犬细小病毒VP2基因编码主要抗原表位区的核酸免疫及其免疫原性研究 被引量：5

1

作者 吴植 曹斌 +2 位作者 贺生中 戴建华 吴迪 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期473-476,共4页

为评价犬细小病毒(CPV)VP2主要抗原表位的免疫原性,本研究对CPV YZ株VP2的氨基酸序列进行分析,确定了主要抗原表位区域(VP2-228),通过PCR扩增相应的表位编码区域基因片段(700 bp),将其克隆于真核表达载体p VAX1中构建重组真核表达质粒p ... 为评价犬细小病毒(CPV)VP2主要抗原表位的免疫原性,本研究对CPV YZ株VP2的氨基酸序列进行分析,确定了主要抗原表位区域(VP2-228),通过PCR扩增相应的表位编码区域基因片段(700 bp),将其克隆于真核表达载体p VAX1中构建重组真核表达质粒p VAX1-VP2-228。Western blot结果显示VP2-228能够在COS-7细胞中正确表达。将该重组质粒免疫小鼠,利用血凝抑制试验检测不同时期的抗体水平,以MTT法检测免疫35 d时淋巴细胞的增殖活性。结果表明p VAX1-VP2-228能够诱导小鼠产生较高的抗体水平;淋巴细胞增殖试验表明免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数显著高于对照组(p<0.05)。本研究为开展CPV DNA疫苗的研究提供了实验依据。 展开更多

关键词 犬细小病毒 VP2蛋白 主要抗原表位 免疫原性

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大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白主要抗原表位区的原核表达及抗血清制备 被引量：4

2

作者 周小愿 张星朗 +2 位作者 贾秋红 韩亚慧 高宏伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期1407-1411,共5页

目的表达大鲵虹彩病毒(CGSIV)主要衣壳蛋白(MCP)主要抗原表位区蛋白,并制备兔抗血清。方法以大鲵虹彩病毒略阳株(CGSIV-LY)基因组为模板,PCR扩增MCP基因,然后克隆到p ET-21a(+)表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫... 目的表达大鲵虹彩病毒(CGSIV)主要衣壳蛋白(MCP)主要抗原表位区蛋白,并制备兔抗血清。方法以大鲵虹彩病毒略阳株(CGSIV-LY)基因组为模板,PCR扩增MCP基因,然后克隆到p ET-21a(+)表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot法检测重组蛋白的表达和免疫活性,用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。以纯化的重组蛋白为免疫原免疫兔制备抗血清,采用Western blot法和ELISA检测抗血清的免疫特异性并测定效价,利用间接免疫荧光法检测鲤鱼上皮瘤(EPC)细胞CGSIV。结果表达了相对分子质量(Mr)为29 000的重组蛋白。制备的兔抗MCP血清具有良好的特异性和高滴度,间接免疫荧光法检测结果显示制备的多抗血清能识别EPC细胞中的CGSIV。结论成功表达了大鲵虹彩病毒MCP主要抗原表位区蛋白,并制备高滴度和良好特异性的兔抗血清。 展开更多

关键词 大鲵虹彩病毒 主要衣壳蛋白 主要抗原表位区 原核表达 抗血清

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猪伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白gD主要抗原表位区基因的克隆及原核表达 被引量：5

3

作者 罗飞 李宇琴 +3 位作者 周洁 南文龙 陆明哲 陈义平 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第11期83-86,共4页

本试验通过PCR方法以猪伪狂犬病病毒SD株的基因组DNA为模板扩增得到了含gD主要抗原表位编码区的片段,将该PCR产物克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32a的T7启动子下游。构建的重组质粒pET-gD经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3... 本试验通过PCR方法以猪伪狂犬病病毒SD株的基因组DNA为模板扩增得到了含gD主要抗原表位编码区的片段,将该PCR产物克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32a的T7启动子下游。构建的重组质粒pET-gD经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子质量约为45.2ku,主要以包涵体形式存在。表达产物用His亲和层析柱纯化。Western blotting结果显示,该纯化蛋白能与猪伪狂犬病病毒抗体阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原反应性,可以作为猪血清伪狂犬病病毒抗体诊断用抗原。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 gD糖蛋白 主要抗原表位 原核表达

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猪戊型肝炎病毒ORF2主要抗原表位区间接ELISA方法的初步建立 被引量：4

4

作者 闻晓波 王密 +4 位作者 冉旭华 周恩民 李晓娟 侯喜林 朴范泽 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第5期99-102,共4页

应用原核表达系统表达猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端和N端的主要抗原表位区,重组蛋白命名为ORF2-C和ORF2-N,初步建立间接ELISA诊断方法。用重组蛋白ORF2-C和ORF2-N作为诊断抗原,对反应条件进行优化,初步建立ELISA诊断方法。抗原最适包被浓... 应用原核表达系统表达猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端和N端的主要抗原表位区,重组蛋白命名为ORF2-C和ORF2-N,初步建立间接ELISA诊断方法。用重组蛋白ORF2-C和ORF2-N作为诊断抗原,对反应条件进行优化,初步建立ELISA诊断方法。抗原最适包被浓度ORF2-C为8μg/mL、ORF2-N为12μg/mL;血清最适稀释度均为1∶50,ORF2-C作用时间为50min、ORF2-N作用时间为90min;酶标抗体最适稀释度为1∶5000;ORF2-C判定标准:D450nm值≥0.348为阳性,D450nm值<0.348为阴性;ORF2-N判定标准:D450nm值≥0.397为阳性,D450nm值<0.397为阴性。与戊型肝炎病毒诊断试剂盒检测结果相比,阳性符合率分别为93.3%、86.7%。利用重组蛋白建立的ELISA方法特异性、敏感性和重复性均较好,且ORF2-C的检测效率明显高于ORF2-N,该方法的初步建立为进一步完善猪戊型肝炎病毒诊断方法奠定基础。 展开更多

关键词 猪戊型肝炎病毒 ORF2 主要抗原表位区 ELISA

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猪细小病毒NS1蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立 被引量：3

5

作者 冉旭华 闻晓波 +1 位作者 孟凡 周恩民 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期964-967,985,共5页

通过分子生物学软件对GenBank中发表的猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)中国株NS1蛋白的氨基酸序列进行分析,确定了主要抗原表位区域,针对此区域设计了1对特异性引物。通过PCR方法扩增出长度为843bp的基因片段,将此片段克隆到原核表... 通过分子生物学软件对GenBank中发表的猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)中国株NS1蛋白的氨基酸序列进行分析,确定了主要抗原表位区域,针对此区域设计了1对特异性引物。通过PCR方法扩增出长度为843bp的基因片段,将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,构建了原核表达载体pET30a-NS1,实现了PPVNS1蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中的高效表达。重组蛋白相对分子质量约为43 000,与预期相符。Western-blot试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性。以纯化的该蛋白作为包被抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为2 mg/L,一抗的最佳稀释倍数为1∶100,阳性标准为:待检血清D450≥0.36,且待检血清D450/阴性血清D450>2,作为阴阳性临界值,初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。用该方法对临床血清样本进行检测,间接ELISA判定为阳性的60份血清,经Western-blot试验只有45份为阳性。随机抽取100份猪血清样品与商品化试剂盒检测结果对比,符合率为96%,表明所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疾病的鉴别诊断奠定了基础。 展开更多

关键词 猪细小病毒 NS1蛋白 主要抗原表位区 表达 间接ELISA

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猪细小病毒结构蛋白VP2主要抗原表位区基因的克隆及原核表达 被引量：4

6

作者 周洁 陈义平 +3 位作者 楚电峰 朱吕昌 罗飞 张秀娟 《中国动物检疫》 CAS 2009年第2期42-44,共3页

本文参照GenBank发表的猪细小病毒结构蛋白VP2基因序列,设计一对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原表位编码区的片段,产物克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32(a)的T7启动子下游,构建的重组质粒pET-VP2经IPTG诱导... 本文参照GenBank发表的猪细小病毒结构蛋白VP2基因序列,设计一对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原表位编码区的片段,产物克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32(a)的T7启动子下游,构建的重组质粒pET-VP2经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子量为39.1KDa,主要以包涵体形式存在。BandScan分析,表达量约占菌体蛋白的65.2%。表达产物用His亲和层析柱纯化。Western blotting结果显示,该种蛋白能与阳性血清发生特异性反应。结果说明,该重组蛋白具有抗原性,可以作为鉴别诊断用抗原。 展开更多

关键词 猪细小病毒 结构蛋白VP2 主要抗原表位 原核表达

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猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端主要抗原表位区的原核表达 被引量：2

7

作者 冉旭华 闻晓波 +2 位作者 王密 李冬野 侯喜林 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第1期51-54,共4页

用原核表达系统表达猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端的主要抗原表位区。通过对GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列进行分析,确定了其N端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了1对特异性引物,RT-PCR扩增该区段,并将此片段... 用原核表达系统表达猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端的主要抗原表位区。通过对GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列进行分析,确定了其N端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了1对特异性引物,RT-PCR扩增该区段,并将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,命名为pET30a-ORF2N,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,1.0 mmol/LIPTG37℃诱导表达。RT-PCR扩增得到424 bp的片段,重组蛋白大小约为21.8 ku,与预期大小相符。West-ern blotting分析结果表明,该蛋白能与阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有生物学活性。猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端主要抗原表位区在大肠杆菌中成功表达,具有一定的反应原性,为进一步用其建立诊断方法奠定基础。 展开更多

关键词 猪戊型肝炎病毒 ORF2 主要抗原表位区 表达

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猪细小病毒NS1蛋白主要抗原表位区的原核表达 被引量：2

8

作者 冉旭华 孟凡 +2 位作者 闻晓波 单玉波 周恩民 《生物技术》 CAS CSCD 2008年第2期18-20,共3页

目的:用大肠杆菌表达猪细小病毒NS1基因的主要抗原表位区。方法:通过对GenBank发表的猪细小病毒(Porcine Par-vovirus,PPV)中国株非结构蛋白NS1的氨基酸序列分析,确定了其中抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,扩... 目的:用大肠杆菌表达猪细小病毒NS1基因的主要抗原表位区。方法:通过对GenBank发表的猪细小病毒(Porcine Par-vovirus,PPV)中国株非结构蛋白NS1的氨基酸序列分析,确定了其中抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,扩增出包含NS1主要抗原表位区的843bp的片段。酶切后连接到原核表达载体pET30a(+)上,构建的原核表达载体pET30a-NS1s转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达。结果:重组蛋白大小约为43kD,与预期大小相符。Westernblot分析表明,该蛋白能与标准阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有生物学活性。结论:NS1蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中成功表达,具有免疫原性。可作为鉴别诊断抗原用于PPV的临床检测。 展开更多

关键词 猪细小病毒 NS1蛋白 主要抗原表位区 表达

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兔出血症病毒VP60主要抗原表位的原核表达及其免疫原性 被引量：6

9

作者 隋慧 杨金生 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2010年第28期15660-15661,共2页

[目的]研究兔出血症病毒(RHDV)VP60主要抗原表位基因原核表达蛋白的免疫原性。[方法]采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。以pET-28b(+)为表达载体,在E.coliRosetta菌株中表达重组蛋白。通过Western blot分析和接种... [目的]研究兔出血症病毒(RHDV)VP60主要抗原表位基因原核表达蛋白的免疫原性。[方法]采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。以pET-28b(+)为表达载体,在E.coliRosetta菌株中表达重组蛋白。通过Western blot分析和接种家兔检测了重组蛋白的免疫原性。[结果]经Western blot检测,在相对分子量24.0k Da处出现特异性的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。[结论]RHDV VP60主要抗原表位的原核表达产物具有较好的免疫原性。 展开更多

关键词 兔出血症病毒 VP60 主要抗原表位基因 免疫原性

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单纯疱疹病毒1型糖蛋白D主要抗原表位区的表达、纯化及鉴定 被引量：2

10

作者 刘红 刘宾 +1 位作者 和骁 赵晓涛 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2013年第3期350-355,共6页

目的原核表达单纯疱疹病毒1型(HSV-1)糖蛋白D(gD)主要抗原表位区,纯化融合表达蛋白并对其进行鉴定。方法用Lasergene7.0中Protean软件对HSV-1 gD氨基酸序列进行抗原表位预测和分析,筛选出gD主要抗原表位区(gD MED),人工合成该区域cDNA序... 目的原核表达单纯疱疹病毒1型(HSV-1)糖蛋白D(gD)主要抗原表位区,纯化融合表达蛋白并对其进行鉴定。方法用Lasergene7.0中Protean软件对HSV-1 gD氨基酸序列进行抗原表位预测和分析,筛选出gD主要抗原表位区(gD MED),人工合成该区域cDNA序列,构建原核表达载体pET-GST-gD MED;将重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)pLysS,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过GST.Bind纯化试剂盒对gDMED融合蛋白进行纯化;Western blot对gD MED融合蛋白的免疫活性进行分析。结果 HSV-1 gD在266～394区域富含抗原表位,人工合成了该区域的cDNA序列,并成功构建了原核表达载体pET-GST-gD MED;gD MED融合蛋白主要以可溶形式表达,分子质量约为45 ku,纯度能达95%;Western blot结果显示,gD MED融合蛋白能与感染HSV-1患者的血清发生特异结合。结论成功表达和纯化了具有良好抗原性的HSV-1 gD MED融合蛋白,为HSV免疫诊断试剂盒和基因工程疫苗的研制提供了依据。 展开更多

关键词 单纯疱疹病毒1型 糖蛋白D 主要抗原表位区 原核表达

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猪伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gB主要抗原表位区基因的克隆及原核表达 被引量：2

11

作者 罗飞 陈义平 +5 位作者 陆明哲 彭大新 周洁 李宇琴 徐宝娟 南文龙 《中国动物检疫》 CAS 2009年第12期27-28,36,共3页

参照GenBank发表的猪伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gB主要抗原表位的编码区基因序列,设计一对引物,通过PCR扩增后,将约为600bp的目的片段克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32(a)的T7启动子下游,构建的重组质粒pET-gB经IPTG诱导,在... 参照GenBank发表的猪伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gB主要抗原表位的编码区基因序列,设计一对引物,通过PCR扩增后,将约为600bp的目的片段克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32(a)的T7启动子下游,构建的重组质粒pET-gB经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子量约为42.4KDa,主要以包涵体形式存在。BandScan分析表明,表达量约占菌体蛋白的60.5%。利用His亲和层析方法得到了纯化的表达产物。Western blotting结果显示,重组蛋白能与阳性血清发生特异性反应,具有较好的抗原反应原性,可以作为检测用抗原。 展开更多

关键词 猪伪狂犬病毒 囊膜糖蛋白gB 主要抗原表位 原核表达

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猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端主要抗原表位区的原核表达 被引量：1

12

作者 冉旭华 闻晓波 +2 位作者 王密 李冬野 侯喜林 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第1期24-27,共4页

利用分子生物学软件分析GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列,确定了其C端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,RT-PCR扩增该区域,并将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,命名为pET30a-ORF2C,然后... 利用分子生物学软件分析GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列,确定了其C端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,RT-PCR扩增该区域,并将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,命名为pET30a-ORF2C,然后转化大肠埃希菌BL21感受态细胞,1.0 mmol/L IPTG 37℃诱导表达。结果表明,RT-PCR扩增得到301 bp的片段,重组蛋白大小约为18 ku,与预期大小相符。Western blot分析表明,该蛋白与阳性血清发生特异性反应,为进一步利用其建立诊断方法奠定了基础。 展开更多

关键词 猪戊型肝炎病毒 ORF2 主要抗原表位区 表达

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RHDV CD株VP60主要抗原表位基因的克隆与序列分析 被引量：3

13

作者 隋慧 杨金生 《中国动物检疫》 CAS 2010年第8期27-29,48,共4页

本实验用RHDV CD株人工感染家兔,发病死亡后,取肝脏匀浆,用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物,采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后,进行序列测定。测... 本实验用RHDV CD株人工感染家兔,发病死亡后,取肝脏匀浆,用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物,采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后,进行序列测定。测序结果表明,VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDV VP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示,CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97.5%,与其它毒株的同源性在92.0%～96.6%之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexi-co-89株同源性最高为99.4%,与其它毒株的同源性在96.6%～98.3%之间。 展开更多

关键词 RHDV VP60 主要抗原表位基因 克隆 同源性

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鸡新城疫病毒Lasota株HN蛋白主要抗原表位基因在大肠杆菌中的表达 被引量：1

14

作者 赵坤 王选年 赵德明 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期402-405,413,共5页

用RT—PCR法从NDV Lasota疫苗株中扩增出HN基因，将其克隆到pGEM—T easy vector中，构建了重组质粒pT—HN．设计了1对引物，用PCR法扩增出HN蛋白主要抗原表位基因（442—1734bp共1239bp），将其连接到原核表达载体pET-28a（＋），构建... 用RT—PCR法从NDV Lasota疫苗株中扩增出HN基因，将其克隆到pGEM—T easy vector中，构建了重组质粒pT—HN．设计了1对引物，用PCR法扩增出HN蛋白主要抗原表位基因（442—1734bp共1239bp），将其连接到原核表达载体pET-28a（＋），构建重组质粒pET—HN．用IPTG诱导使其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达．SDS—PAGE结果表明，NDV HN主要抗原表位基因在pET—HN中获得了高效融合表达，其表达蛋白的分子量为28kD．同时，通过试验摸索并确定了表达HN蛋白主要抗原表位基因的最佳诱导条件：IPTG终浓度为0．4mmol·L^-1，诱导时间为4h，温度为37℃． 展开更多

关键词 新城疫病毒 HN蛋白 主要抗原表位基因 克隆 原核表达

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猪细小病毒GZ分离株NS1基因主要抗原表位区原核表达研究 被引量：2

15

作者 刘建 汤德元 +2 位作者 姜德荣 王洪光 李达 《山地农业生物学报》 2013年第5期397-402,共6页

根据GenBank登录的猪细小病毒NADL-2株和China株NS1基因序列设计1对特异性引物,对贵州大学动物生物技术实验中心分离的猪细小病毒GZ株接种ST细胞传代培养后,提取病毒DNA,进行PCR扩增PPV NS1基因主要抗原表位区,克隆后测序,随后将该基因... 根据GenBank登录的猪细小病毒NADL-2株和China株NS1基因序列设计1对特异性引物,对贵州大学动物生物技术实验中心分离的猪细小病毒GZ株接种ST细胞传代培养后,提取病毒DNA,进行PCR扩增PPV NS1基因主要抗原表位区,克隆后测序,随后将该基因亚克隆至pET-32a(+)载体,构建pET-32a-NS1重组质粒,转化得到重组菌,经IPTG诱导表达,通过亲和柱纯化并复性,制备重组蛋白。Western-blot检测发现,经诱导表达的NS1基因主要抗原表位区蛋白约为64 ku,与预测的大小一致,而且,重组蛋白在纯化复性后能被PPV阳性血清所识别,具有较好的反应原性。 展开更多

关键词 猪细小病毒 NS1基因 主要抗原表位区 原核表达

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伪狂犬病病毒gE囊膜糖蛋白主要抗原表位区基因的原核表达

16

作者 柴虹 范忠军 +1 位作者 陈义平 王志亮 《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期13-16,共4页

参照GenBank上公布的伪狂犬病病毒gE基因序列设计1对引物,通过PCR方法扩增一段包含gE主要抗原表位编码区的564 bp的片段,扩增产物克隆于pMD18-T vector中,酶切后插入原核表达载体pET-32a的T7启动子下游,构建的原核表达质粒pET-gE在大肠... 参照GenBank上公布的伪狂犬病病毒gE基因序列设计1对引物,通过PCR方法扩增一段包含gE主要抗原表位编码区的564 bp的片段,扩增产物克隆于pMD18-T vector中,酶切后插入原核表达载体pET-32a的T7启动子下游,构建的原核表达质粒pET-gE在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示:表达产物分子质量为38 ku,以包涵体的形式存在,表达产物用His亲和层析柱进行纯化。Western blotting分析表明:该蛋白能与标准阳性血清发生特异性反应。结果证明该表达产物具有生物学活性,可作为鉴别诊断的抗原。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 gE 主要抗原表位 表达

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猪伪狂犬病毒Guizhou-DY株gE基因主要抗原表位区的克隆及序列分析

17

作者 罗险峰 郝飞 +6 位作者 汤德元 李春燕 曾智勇 甘振磊 王凤 刘建 王洪光 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第9期106-108,共3页

为了研究猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因主要抗原表位区是否可以进行原核表达,试验根据GenBank中发表的PRV GDSH株(EF552427)和Guizhou-DY株(JX417716)的基因序列,设计1对特异性引物,采用PCR扩增Guizhou-DY株gE基因主要抗原表位区,并进行克隆... 为了研究猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因主要抗原表位区是否可以进行原核表达,试验根据GenBank中发表的PRV GDSH株(EF552427)和Guizhou-DY株(JX417716)的基因序列,设计1对特异性引物,采用PCR扩增Guizhou-DY株gE基因主要抗原表位区,并进行克隆与序列分析。结果表明:Guizhou-DY株gE基因主要抗原表位区全长为636 bp,与韩国Yangsan株和国内GDSH株核苷酸同源性较高,分别为99.4%和99.2%;与韩国Yangsan株和国内GDSH株、HNJZ株氨基酸同源性较高,均为98.6%。说明该分离株与韩国Yangsan株和国内GDSH株具有较近的亲缘关系。 展开更多

关键词 猪伪狂犬病毒(PRV) Guizhou—DY株 GE基因 主要抗原表位区 克隆 序列分析

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兔出血症病毒VP60主要抗原表位基因的克隆与序列分析

18

作者 庄天中 隋慧 +1 位作者 向华 宣华 《农业与技术》 2006年第6期78-83,共6页

本实验用RHDV CD株人工感染家兔，发病死亡后，取肝脏匀浆，用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物，采用RT-PCR方法扩增了PHDV表壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后，选行序列测定... 本实验用RHDV CD株人工感染家兔，发病死亡后，取肝脏匀浆，用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物，采用RT-PCR方法扩增了PHDV表壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后，选行序列测定。测序结果表明，VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDV VP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示，CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97．5％．与其它毒株的同源性在92．0％-96．6％之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexico-89株同源性最高为99．4％，与其它毒株的同源性在96．6％～98．3％之间。 展开更多

关键词 RHDV VP60 主要抗原表位基因 克隆 同源性

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表达传染性喉气管炎病毒gB主要抗原表位区域重组新城疫病毒的构建 被引量：6

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作者 孙娜娜 王琪 +1 位作者 李慧昕 刘胜旺 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期414-417,共4页

为构建以新城疫病毒(NDV)为活病毒载体表达传染性喉气管炎病毒(ILTV)g B主要抗原表位区域的重组病毒,本研究以ILTV LJS09株的DNA为模板,通过PCR技术扩增1 323 bp ILTV编码g B主要抗原表位的基因片段(1 bp^440 bp),将其插入到NDV感染性克... 为构建以新城疫病毒(NDV)为活病毒载体表达传染性喉气管炎病毒(ILTV)g B主要抗原表位区域的重组病毒,本研究以ILTV LJS09株的DNA为模板,通过PCR技术扩增1 323 bp ILTV编码g B主要抗原表位的基因片段(1 bp^440 bp),将其插入到NDV感染性克隆p BR-FL中,构建含有ILTV g B主要抗原基因的NDV c DNA克隆p BR-FL-g B1-440。利用磷酸钙转染法,在辅助质粒p CI-neo-NP、p CI-neo-P和p CI-neo-L的共同作用下,将重组质粒转染于表达T7聚合酶重组痘病毒预感染的BSR-T7/5细胞,获得重组病毒r L-g B1-440。采用RT-PCR检测接种重组病毒的鸡胚尿囊液,结果表明重组病毒中含有相应的外源基因。利用g B的抗血清检测重组病毒中g B的表达,间接免疫荧光试验表明,在感染重组病毒的BSR-T7/5细胞中目的蛋白得到表达。本研究为研制和开发传染性喉气管炎重组新城疫二联活疫苗奠定基础。 展开更多

关键词 重组新城疫病毒 传染性喉气管炎病毒 gB蛋白 主要抗原表位基因

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非洲猪瘟病毒VP73基因主要抗原表位区的融合原核表达 被引量：1

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作者 李秋霞 滕达 +3 位作者 童德文 杨雅麟 田子罡 王建华 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期60-65,共6页

人工合成VP73基因全长序列,利用DNAstar软件确定其中抗原性较高的区域,利用Primer Premier5.0设计一对特异性引物,通过PCR扩增得到243bp的非洲猪瘟病毒VP73基因片段(vp73l)。将该片段与表达载体pET-32a连接克隆至大肠杆菌Escherichia co... 人工合成VP73基因全长序列,利用DNAstar软件确定其中抗原性较高的区域,利用Primer Premier5.0设计一对特异性引物,通过PCR扩增得到243bp的非洲猪瘟病毒VP73基因片段(vp73l)。将该片段与表达载体pET-32a连接克隆至大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)DH5α菌株,经测序、菌落PCR和酶切鉴定,选取VP73L基因正向插入,读码框正确的阳性克隆。构建重组质粒并转化BL21(DE3),经IPTG诱导,融合蛋白以可溶性形式在E.coliBL21(DE3)高效表达,经His亲和层析柱得以纯化。Western blotting显示,该融合蛋白能与兔抗非洲猪瘟病毒VP73多克隆抗体发生特异性反应。所得结果为进一步研究:分离纯化该重组融合蛋白;确证目标抗原蛋白VP73L免疫原性及其特异性,进而达到建立非洲猪瘟病毒的免疫检测方法奠定了必要的材料与技术基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 VP73基因 主要抗原表位区 表达

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