人干燥综合征抗原A毕赤酵母分泌型表达载体的构建 被引量：3

1

作者 杨湘越 兰小鹏 +4 位作者 冯福英 吴文冰 钟智强 廖剑 朱忠勇 《实用医学杂志》 CAS 2006年第22期2575-2577,共3页

目的:构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的毕赤酵母分泌型表达载体。方法:以人白血病淋巴细胞HL-60株cDNA为模板,PCR扩增目的基因SSA,纯化,双酶切,DNA浓缩回收,插入酵母分泌型表达载体pPIC9k,热冲击法转化感受态大肠杆菌JM109,阳性克隆提... 目的:构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的毕赤酵母分泌型表达载体。方法:以人白血病淋巴细胞HL-60株cDNA为模板,PCR扩增目的基因SSA,纯化,双酶切,DNA浓缩回收,插入酵母分泌型表达载体pPIC9k,热冲击法转化感受态大肠杆菌JM109,阳性克隆提取质粒,双酶切鉴定并测序。结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒pPIC9k-SSA双酶切鉴定与预期一致,测序结果正确。结论:成功构建SSA毕赤酵母分泌型表达载体,为下一步取代从动物胸腺中人工提取低纯度、低产量的SSA抗原,研制新型抗SSA诊断试剂盒打下基础。 展开更多

关键词 干燥综合征 毕赤酵母 分泌型表达载体

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hsBLyS分泌型表达载体构建及CHO表达 被引量：1

2

作者 吴海涛 胡云龙 +3 位作者 刁振宇 金丽娜 李洁 张双全 《南京师大学报（自然科学版）》 CAS CSCD 2004年第2期81-86,共6页

本实验引物延伸合成人红细胞生成素信号肽序列 ;信号肽序列和人可溶性B淋巴细胞刺激因子 (hu mansolubleBLymphocyteStimulator,hsBLyS)基因重叠延伸拼接成融合基因 ;融合基因插入pcDNA3、pcDNA3 1、pEFneo质粒 ;信号肽引物设计时 ,突... 本实验引物延伸合成人红细胞生成素信号肽序列 ;信号肽序列和人可溶性B淋巴细胞刺激因子 (hu mansolubleBLymphocyteStimulator,hsBLyS)基因重叠延伸拼接成融合基因 ;融合基因插入pcDNA3、pcDNA3 1、pEFneo质粒 ;信号肽引物设计时 ,突变同义密码 ,最终重组质粒成为分泌表达质粒 ;磷酸钙共沉淀将表达质粒和标志质粒pSV dhfr,共转染CHO—dhfr- 细胞 ;选择培养液筛选 ,氨甲喋呤扩增表达 ,获稳定表达rhsBLyS细胞株 ;ELISA检测浓缩表达上清 ,结果表明 :rhsBLyS表达量由 0 13 μg/mL上升至 0 5 5 μg/mL . 展开更多

关键词 HSBLYS CHO 基因表达 信号肽 分泌型表达载体 免疫调节因子

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Annexin32酵母分泌型表达载体的构建及其高拷贝转化子的快速筛选 被引量：1

3

作者 杨湘越 武圣明 +1 位作者 陈蕊雯 孙树汉 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期695-696,共2页

关键词 Annexin32 酵母分泌型表达载体 构建 高拷贝转化子 快速筛选 毕赤酵母 G418抗性筛选

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应用PCR重组技术构建大肠杆菌分泌型表达载体 被引量：1

4

作者 黄仪秀 陈杰鹏 +3 位作者 毕群 李斯明 张磊 朱圣庚 《生物化学杂志》 CSCD 1995年第6期642-645,共4页

应用ＰＣＲ重组技术，对大肠杆菌分泌型表达载体ｐＩＮ－ⅢｏｍｐＡ进行改建，除去原载体的ＨｉｎｄⅢ位点，将信号肽序列末端两个密码子ＣＡＧＧＣＣ改为ＣＡＡＧＣＴ，从而引入一个新的ＨｉｎｄⅢ位点，并在其下游接上一段多克隆位点... 应用ＰＣＲ重组技术，对大肠杆菌分泌型表达载体ｐＩＮ－ⅢｏｍｐＡ进行改建，除去原载体的ＨｉｎｄⅢ位点，将信号肽序列末端两个密码子ＣＡＧＧＣＣ改为ＣＡＡＧＣＴ，从而引入一个新的ＨｉｎｄⅢ位点，并在其下游接上一段多克隆位点序列。改建后的载体可用于直接插入外源ＤＮＡ编码序列，表达产物在分泌过程中被切除信号肽而成为天然有活性的蛋白质，操作十分简便。 展开更多

关键词 大肠杆菌 分泌型表达载体 聚合酶链反应

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可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体 被引量：2

5

作者 张超 刘刚 +1 位作者 余少文 邢苗 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期52-58,共7页

从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体(毕赤酵母表达型T载体),并通过表达重组纤维二糖水解酶II对该载体进行了检验。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片段的上游含XhoI和Eam1105I酶切位点... 从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体(毕赤酵母表达型T载体),并通过表达重组纤维二糖水解酶II对该载体进行了检验。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片段的上游含XhoI和Eam1105I酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaI酶切位点。通过XhoI和XbaI位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒。用Eam1105I酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT。使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因(cbh2)的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达。结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达。另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余氨基酸。 展开更多

关键词 纤维二糖水解酶 巴氏毕赤酵母 分泌型表达载体 里氏木霉 T-载体

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猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达 被引量：3

6

作者 徐彦召 张彦明 +4 位作者 何雷 唐青海 代晨 王静 杨小云 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2009年第5期7-11,共5页

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pS... 【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。 展开更多

关键词 猪瘟病毒囊膜蛋白 猪脐静脉血管内皮细胞 分泌型真核表达载体 真核表达

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人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选

7

作者 王广兰 宫璀璀 +3 位作者 刘亚利 初霞 王文丽 李璇 《实用医药杂志》 2009年第11期61-63,66,共4页

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1... 目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。 展开更多

关键词 可溶性1型补体受体1 毕赤酵母细胞 G418抗性筛选 分泌型表达载体

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一种酿酒酵母组成型分泌表达载体的构建及应用

8

作者 王国平 欧阳蓓 +2 位作者 胡紫艳 刘启铃 赵喜华 《江西师范大学学报(自然科学版)》 北大核心 2024年第5期509-513,共5页

该文利用重叠延伸PCR和无缝分子克隆技术构建酿酒酵母组成型分泌表达载体pYAT21,该载体由酿酒酵母组成型分泌表达组件(翻译延伸因子1组成型启动子、α因子N-末端分泌信号肽DNA序列和乙醇脱氢酶2终止子所组成)、2μ复制子、大肠杆菌复制... 该文利用重叠延伸PCR和无缝分子克隆技术构建酿酒酵母组成型分泌表达载体pYAT21,该载体由酿酒酵母组成型分泌表达组件(翻译延伸因子1组成型启动子、α因子N-末端分泌信号肽DNA序列和乙醇脱氢酶2终止子所组成)、2μ复制子、大肠杆菌复制元件以及URA3筛选标记所组成.将草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶与pYAT21连接并转化到酿酒酵母中,其发酵上清液粗酶活达到106.8 U·mL^(-1).酿酒酵母组成型分泌表达载体pYAT21可应用于异源蛋白的组成型分泌表达. 展开更多

关键词 酿酒酵母 组成型分泌表达载体 异源蛋白

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1型人类免疫缺陷病毒tat基因重组分泌型真核表达载体的构建 被引量：1

9

作者 赵丽娟 陈源红 +2 位作者 唐华英 韦红玉 曾怡 《微创医学》 2012年第4期347-350,共4页

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载... 目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载体片段经小牛碱性磷酸酶去磷酸化后,用T4 DNA连接酶将tat基因与pSecTag2B载体片段连接过夜并转化感受态大肠杆菌DH5α,提取阳性克隆质粒进行Hind III酶切鉴定,并利用Nco I酶切鉴定克隆的tat基因反向。最后选取正向tat基因克隆质粒送基因测序。结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上约320bp位置出现条带,与预期的324bp大小一致;经Hind III和Nco I分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源。结论本研究方法可以成功地构建HIV-1 tat基因分泌型真核表达载体。 展开更多

关键词 人类免疫缺陷病毒1型 TAT基因 分泌型真核表达载体

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人血管抑素基因分泌型融合载体的构建与表达

10

作者 王瑞珉 靳秋月 +1 位作者 程世翔 陈立军 《武警医学院学报》 CAS 2005年第3期178-180,F002,共4页

【目的】构建人血管抑素(angiostatin,As)原核分泌型融合表达载体pEZZ18-As,诱导表达As融合蛋白。【方法】根据人AscDNA序列的开放读码框架设计上、下游引物,从人肝组织中提取总RNA后,利用RT-PCR技术扩增As基因;酶切目的基因与pEZZ18载... 【目的】构建人血管抑素(angiostatin,As)原核分泌型融合表达载体pEZZ18-As,诱导表达As融合蛋白。【方法】根据人AscDNA序列的开放读码框架设计上、下游引物,从人肝组织中提取总RNA后,利用RT-PCR技术扩增As基因;酶切目的基因与pEZZ18载体,回收纯化后做定向克隆连接,转化E.coliDH5α;XbaⅠ及EcoRⅠ双酶切电泳与测序鉴定pEZZ18-As;诱导培养重组菌,表达目的蛋白。【结果】酶切pEZZ18-As,电泳分析插入片段长度为1111bp,与预期结果一致,对连接点两端进行测序,结果显示接头两端序列连接正确;SDS-PAGE分析诱导培养重组菌,新出现的蛋白大小约61kD,与预期相符。【结论】成功构建人血管抑素表达载体并表达出目的蛋白,该研究为抗血管药物治疗实体瘤奠定了基础。 展开更多

关键词 血管抑素 分泌型融合表达载体 抗血管生成

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重组分泌型人类免疫缺陷病毒Tat蛋白在真核细胞中的表达及活性检测

11

作者 韦红玉 曾怡 +1 位作者 唐华英 赵丽娟 《检验医学与临床》 CAS 2014年第11期1455-1457,1461,共4页

目的构建人类免疫缺陷病毒病毒tat基因的重组分泌型真核表达载体并在真核细胞中表达,检测表达的重组蛋白活性。方法聚合酶链反应(PCR)从重组质粒pcDNA3.1(+)/Tat中扩增tat基因,利用HindⅢ和BamHⅠ酶切位点分别将tat基因正向、反向插入... 目的构建人类免疫缺陷病毒病毒tat基因的重组分泌型真核表达载体并在真核细胞中表达,检测表达的重组蛋白活性。方法聚合酶链反应(PCR)从重组质粒pcDNA3.1(+)/Tat中扩增tat基因,利用HindⅢ和BamHⅠ酶切位点分别将tat基因正向、反向插入分泌型载体pSecTag,获得正向插入克隆(pSecTat)和反向插入克隆(pSecTat-AS),经双酶切鉴定连接成功后,利用测序鉴定其序列和插入方向。将构建的重组质粒转染293细胞,利用Western blot法检测Tat蛋白的表达。进而将重组质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞,CAT-酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其细胞内CAT表达,从而检测Tat蛋白的活性。最后将转染重组质粒的293细胞与转染LTR-CAT报告质粒的BCBL-1细胞用Transwell培养系统共培养,CAT-ELISA检测分泌型Tat蛋白的旁分泌调控活性。结果 PCR扩增产物在10g/L琼脂糖凝胶上约300bp位置出现条带,与预期的324bp大小相符;经HindⅢ和BamHⅠ分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与GenBank中登记的HIV-1tat基因100%同源。正向克隆质粒转染293细胞后,Western blot法检测观察到约19×103蛋白条带。正向克隆质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞CAT表达量高于反向克隆质粒转染细胞(P<0.05)。与反向克隆对照相比,与正向克隆转染的293细胞共培养的BCBL-1细胞CAT表达量更高(P<0.05)。结论成功构建HIV-1tat基因基因分泌型真核表达载体,该载体不但可在真核细胞内表达具有调控活性的Tat蛋白,表达的Tat蛋白还可分泌至细胞外并具有调控活性。 展开更多

关键词 人类免疫缺陷病毒病毒 TAT基因 分泌型真核表达载体 调控活性

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人骨唾液酸蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达 被引量：2

12

作者 董燕 王捷 +2 位作者 杨连生 张宏斌 郑文岭 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2003年第1期26-29,共4页

以PCR方法扩增人bsp基因 ,与分泌型表达载体 pPICZαA重组 ,重组质粒经电击转化毕赤酵母GS115菌株 ,获得的GS115 /pPICZαA_hbsp表达菌株能高效分泌表达rhBSP .SDS_PAGE和Westernblot分析结果表明 ,产物的分子质量接近 6 6ku ,能发生特... 以PCR方法扩增人bsp基因 ,与分泌型表达载体 pPICZαA重组 ,重组质粒经电击转化毕赤酵母GS115菌株 ,获得的GS115 /pPICZαA_hbsp表达菌株能高效分泌表达rhBSP .SDS_PAGE和Westernblot分析结果表明 ,产物的分子质量接近 6 6ku ,能发生特异性抗原 展开更多

关键词 人骨唾液酸蛋白 巴斯德毕赤酵母 基因表达 分泌型表达载体 PCR方法 抗原-抗体反应

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利用套叠PCR技术改造酵母表达载体pAO815的研究 被引量：3

13

作者 周鹏 郭安平 黎小瑛 《生命科学研究》 CAS CSCD 2002年第4期310-313,共4页

利用套叠PCR技术将α factor信号肽基因插入pAO815之EcoRⅠ位点,构建成分泌型表达载体pAO815α A.在不改变原克隆位点EcoRⅠ的条件下,借助pAO815之第873位的HindⅢ位点,将pAO815AOX1启动子873 940片段连同α factor信号肽基因序列(246bp... 利用套叠PCR技术将α factor信号肽基因插入pAO815之EcoRⅠ位点,构建成分泌型表达载体pAO815α A.在不改变原克隆位点EcoRⅠ的条件下,借助pAO815之第873位的HindⅢ位点,将pAO815AOX1启动子873 940片段连同α factor信号肽基因序列(246bp)插入pAO815之HindⅢ EcoRⅠ之间,构建成含α factor信号肽基因的分泌型表达载体pAO815α A. 展开更多

关键词 套叠PCR技术 改造 酵母表达载体 pAO815 分泌型表达载体

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转基因枸杞表达HIV-1壳体蛋白病毒样颗粒疫苗表达载体的构建 被引量：3

14

作者 孙晓光 宋长征 张更林 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第8期51-55,共5页

利用PCR技术扩增出人免疫缺陷病毒HIV-1MA4-CA融合基因,将其克隆到pGEM-T载体中,测定其核苷酸序列,并推导其氨基酸序列。该基因全长为450bp,与已发表的HIV-1的全序列基因(AF324493)完全同源,编码一个含150个氨基酸残基的蛋白质。将该基... 利用PCR技术扩增出人免疫缺陷病毒HIV-1MA4-CA融合基因,将其克隆到pGEM-T载体中,测定其核苷酸序列,并推导其氨基酸序列。该基因全长为450bp,与已发表的HIV-1的全序列基因(AF324493)完全同源,编码一个含150个氨基酸残基的蛋白质。将该基因与分泌型表达载体pCAMBIA1305.2连接,同时将水稻中富含甘氨酸蛋白的信号肽序列(GRP)引入MA4-CA融合基因,构建了含MA4-CA基因的植物分泌表达载体pCAMBIA1305.2-MA4-CA。 展开更多

关键词 HIV-1 MA4-CA 病毒样颗粒 分泌型表达载体 转基因 蛋白质 构建 pGEM-T载体 人免疫缺陷病毒 核苷酸序列

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猪α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达 被引量：28

15

作者 葛丽 李震 +4 位作者 于瑞嵩 刘惠莉 张德福 周智爱 尹逊和 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期289-292,共4页

将猪α干扰素(PoIFN-α)基因克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中,电转化毕赤酵母KM71H菌株,抗生素ZeocinTM浓度梯度筛选高抗性转化子,以PCR鉴定阳性重组菌株。筛选出的高拷贝重组菌株分别通过BMGY/BMMY培养基和YPG培养基,用甲醇诱... 将猪α干扰素(PoIFN-α)基因克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中,电转化毕赤酵母KM71H菌株,抗生素ZeocinTM浓度梯度筛选高抗性转化子,以PCR鉴定阳性重组菌株。筛选出的高拷贝重组菌株分别通过BMGY/BMMY培养基和YPG培养基,用甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Westernblot印迹杂交结果证实,表达产物为重组PoIFN-α融合蛋白,经细胞毒性试验检测(WISH/VSV系统),表达产物的抗病毒活性为4.1×104IU/mL。 展开更多

关键词 毕赤酵母 干扰素基因 分泌表达 分泌型表达载体 Western IFN-α 猪 重组菌株 表达产物 PCR鉴定 抗病毒活性 基因克隆 浓度梯度 诱导表达 PAGE 印迹杂交 blot 融合蛋白 试验检测 细胞毒性 培养基 电转化 转化子 高抗性 抗生素

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小鼠CCL2基因毕赤酵母表达载体的构建及鉴定 被引量：2

16

作者 王东 李海军 高剑峰 《江苏农业科学》 CSCD 北大核心 2011年第4期33-35,共3页

从小鼠肝脏组织中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增小鼠CCL2基因序列,构建小鼠CCL2cDNA毕赤酵母表达载体,并进行鉴定及序列测定。结果表明,克隆获得的480 bp片段与GenBank里登录号为AF065929和AF065930的cDNA序列完全一致,将目的基因正确... 从小鼠肝脏组织中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增小鼠CCL2基因序列,构建小鼠CCL2cDNA毕赤酵母表达载体,并进行鉴定及序列测定。结果表明,克隆获得的480 bp片段与GenBank里登录号为AF065929和AF065930的cDNA序列完全一致,将目的基因正确插入毕赤酵母表达载体pPICZαA分泌信号肽下游。为大量获得小鼠趋化因子CCL2,以及对其生物学功能的研究奠定了试验基础。 展开更多

关键词 CCL2 毕赤酵母 分泌型表达载体

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猪流行性腹泻病毒S1蛋白在干酪乳杆菌中的分泌表达及免疫原性分析

17

《今日畜牧兽医》 2009年第9期67-67,共1页

将猪流行性腹泻病毒（PEDV）纤突蛋白S1基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG-2中，构建了重组表达载体pPG-sl，将其电转化干酪乳杆菌Lcasei393，获得了表达PEDVsl蛋白的重组乳酸菌杆菌。重组杆菌诱导后，经westernblot、间接ELISA... 将猪流行性腹泻病毒（PEDV）纤突蛋白S1基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG-2中，构建了重组表达载体pPG-sl，将其电转化干酪乳杆菌Lcasei393，获得了表达PEDVsl蛋白的重组乳酸菌杆菌。重组杆菌诱导后，经westernblot、间接ELISA实验表明，目的蛋白获得了分泌表达。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 干酪乳杆菌 分泌表达 S1蛋白 免疫原性 重组表达载体 分泌型表达载体 间接ELISA

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透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn在毕赤酵母中的表达研究 被引量：9

18

作者 王清路 张锐 +2 位作者 倪万潮 陈毓荃 郭三堆 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期730-735,共6页

为获得高效表达外源蛋白的Pichiapastoris菌株而设计了重组质粒pPIC9K_vgbbxn ,其中透明颤菌血红蛋白基因vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度 ,腈水解酶基因bxn分泌表达。转化GS115菌株后 ,通过PCR、SDS_PAGE检测证实两基因已经整合进酵... 为获得高效表达外源蛋白的Pichiapastoris菌株而设计了重组质粒pPIC9K_vgbbxn ,其中透明颤菌血红蛋白基因vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度 ,腈水解酶基因bxn分泌表达。转化GS115菌株后 ,通过PCR、SDS_PAGE检测证实两基因已经整合进酵母基因组且能高效表达 ,以及用准确的蛋白活性测定方法成功地检测到二者所表达的产物均具有正常的活性。摇瓶发酵实验证明 。 展开更多

关键词 毕赤酵母 分泌型表达载体 腈水解酶 透明颤菌血红蛋白

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人纤溶酶原Kringle5区的基因克隆的表达及纯化 被引量：7

19

作者 尹桂芝 李彪 +4 位作者 张一帆 尤蓓 赵龙 陆林 于金德 《上海第二医科大学学报》 CSCD 北大核心 2005年第2期151-154,共4页

目的克隆人纤溶酶原Kringle5 (K5 )区基因 ,并进行重组蛋白的表达纯化及活性鉴定。方法用PCR方法从正常成人肝cDNA库扩增出人纤溶酶原K5区基因 ,构建K5的原核表达载体pET 2 2b(+) K5 6×His,IPTG诱导蛋白表达后经Ni+ -树脂亲和层... 目的克隆人纤溶酶原Kringle5 (K5 )区基因 ,并进行重组蛋白的表达纯化及活性鉴定。方法用PCR方法从正常成人肝cDNA库扩增出人纤溶酶原K5区基因 ,构建K5的原核表达载体pET 2 2b(+) K5 6×His,IPTG诱导蛋白表达后经Ni+ -树脂亲和层析进行纯化 ,通过血管内皮细胞增殖抑制试验检测蛋白活性。结果经PCR成功扩增出了 2 4 3bp的K5区基因 ,测序正确后克隆进大肠杆菌分泌型表达载体pET 2 2b(+) ,重组质粒在BL2 1中成功表达出分子量为 14 0 0 0的蛋白质 ,纯化后的蛋白纯度达95 % ,具有抑制血管内皮细胞增殖活性的功能 ,K5蛋白浓度为 4 μg/mL时抑制率达 5 0 %。 结论纤溶酶原K5的成功克隆。 展开更多

关键词 分泌型表达载体 纯化 ET 血管内皮细胞 基因克隆 肿瘤 扩增 人纤溶酶原 IPTG cDNA库

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地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达 被引量：2

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作者 蔡恒 陈忠军 +1 位作者 路福平 杜连祥 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2004年第12期15-18,共4页

用PCR方法从地衣芽孢杆菌中扩增了耐高温α淀粉酶基因,将扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体pUC19中,构建重组分泌型表达载体pUAM。pUAM中的耐高温α淀粉酶基因在大肠杆菌JM109中得到表达。经SDSPAGE分析显示,蛋白表达产物的分子量为55ku... 用PCR方法从地衣芽孢杆菌中扩增了耐高温α淀粉酶基因,将扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体pUC19中,构建重组分泌型表达载体pUAM。pUAM中的耐高温α淀粉酶基因在大肠杆菌JM109中得到表达。经SDSPAGE分析显示,蛋白表达产物的分子量为55ku,同核酸序列测定所推导的值相符。 展开更多

关键词 蛋白表达 酶基因 大肠杆菌 扩增 克隆 UC 核酸序列 地衣芽孢杆菌 分泌型表达载体 SDS-PAGE分析

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