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人源性RPL22基因的原核表达与纯化及功能分析
1
作者 田甜 张星娟 杨明夏 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第10期1785-1793,共9页
目的了解人类核糖体蛋白L22(RPL22)基因的生物信息学,原核表达与纯化人类RPL22重组蛋白,在体外合成人类RPL22(标记为试剂M),研究试剂M对NSCLC A549细胞增殖、周期、凋亡的影响,分析试剂M和顺铂(DDP)联合进行化疗的效果。方法分析RPL22... 目的了解人类核糖体蛋白L22(RPL22)基因的生物信息学,原核表达与纯化人类RPL22重组蛋白,在体外合成人类RPL22(标记为试剂M),研究试剂M对NSCLC A549细胞增殖、周期、凋亡的影响,分析试剂M和顺铂(DDP)联合进行化疗的效果。方法分析RPL22生物信息学。PCR克隆RPL22基因,进行单链寡核苷酸的设计及合成,获得目的基因后连接pET-28α载体,构建pET-28α-RPL22重组质粒,转化大肠埃希菌感受态细胞DH 5α,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot分析重组蛋白RPL22的表达情况。CCK-8检测试剂M和DDP在A549细胞中的半抑制率(IC_(50))以及试剂M对A549细胞增殖的影响;流式细胞术检测试剂M对A549细胞凋亡、周期的影响;qPCR、Western blot检测试剂M和DDP分别对磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、腺苷5′-单磷酸激活蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AMPK/mTOR)信号通路的影响。结果RPL22蛋白为不稳定亲水性蛋白质。诱导表达的重组蛋白经溶解纯化后获得了高浓度重组蛋白。在A549细胞中,试剂M的IC_(50)为400μg/L,DDP的IC_(50)为10μmol/L,试剂M抑制细胞增殖,其浓度与细胞活性成反比;试剂M(200μg/L)与DDP(2.5μmol/L)联合运用时,效果与单独使用10μmol/L DDP抑制增殖比相似;试剂M能诱导G 2细胞周期停止、促进细胞凋亡,且可能参与PI3K/AKT、AMPK/mTOR通路的调节。结论该研究首次克隆得到人类RPL22重组蛋白,使其成功纯化表达。 展开更多
关键词 核糖体蛋白L22 非小细胞肺癌 生物信息学分析 原核表达与纯化 功能分析
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花生类受体蛋白激酶AhAlSRK的原核表达与体外活性分析 被引量：1
2
作者 黄舒婷 李霞 +4 位作者 苏桂军 詹洁 王爱勤 何龙飞 肖冬 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期787-795,共9页
基于对已有转录组数据的分析,发现花生AhAlSRK(LOC107458489)基因在耐铝花生品种99-1507和铝敏感型花生品种中花2号(ZH 2号)受铝毒害后基因表达量出现明显差异,暗示其可能参与花生铝胁迫下信号传递铝胁迫响应机制。花生AhAlSRK基因与拟... 基于对已有转录组数据的分析,发现花生AhAlSRK(LOC107458489)基因在耐铝花生品种99-1507和铝敏感型花生品种中花2号(ZH 2号)受铝毒害后基因表达量出现明显差异,暗示其可能参与花生铝胁迫下信号传递铝胁迫响应机制。花生AhAlSRK基因与拟南芥富含亮氨酸类受体蛋白激酶(leucine-rich repeat receptor-like kinases,LRR-RLKs)VIII_2亚家族中的AT1G56140基因具有相似的结构,为同源基因。为验证花生AhAlSRK蛋白激酶活性,克隆了AhAlSRK的全长编码序列,并基于对AhAlSRK蛋白结构预测的基础上,克隆了AhAlSRK的胞内域,构建其原核表达载体pGEX-6p-1-AhAlSRK-CD,转入大肠杆菌菌株Rosetta 2(DE3)plysS。在1 mmol/L IPTG条件下,16℃低温诱导过夜,成功诱导可溶性GST-AhAlSRK-CD蛋白。重组蛋白GST-AhAlSRK-CD表达效率较高,经过自磷酸化检测验证其具有丝/苏氨酸和酪氨酸激酶活性。实验结果为后续在蛋白质水平上探究AhAlSRK基因响应铝胁迫机理打下基础。 展开更多
关键词 花生 类受体蛋白激酶 原核表达与纯化 自磷酸化
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白脂素包涵体表达纯化及其功能评价
3
作者 韦雪静 敖青青 +5 位作者 孟玲 徐怡璐 陆彩玲 唐深 王新航 李习艺 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期67-72,共6页
目的构建白脂素的原核表达质粒,表达及纯化重组白脂素蛋白,并初步探索其功能,为进一步研究白脂素作用机制及其生理病理作用提供依据。方法利用基因工程技术构建表达白脂素BL21菌株,经异丙基硫代半乳糖苷诱导,梯度尿素复性,亲和层析纯化... 目的构建白脂素的原核表达质粒,表达及纯化重组白脂素蛋白,并初步探索其功能,为进一步研究白脂素作用机制及其生理病理作用提供依据。方法利用基因工程技术构建表达白脂素BL21菌株,经异丙基硫代半乳糖苷诱导,梯度尿素复性,亲和层析纯化及去内毒素处理得到可用于细胞和动物实验的重组白脂素。采用血糖仪检测重组白脂素腹腔注射后C57小鼠血糖变化情况。Alamar Blue检测重组白脂素作用24 h对MIHA细胞活性的影响;重组白脂素刺激MIHA细胞24 h,用蒽酮法检测糖原含量。结果在37℃,A600 nm=0.8,IPTG终浓度为1 mmol/L诱导4 h目的蛋白表达效果较好。通过纯化和去内毒素处理,重组白脂素纯度大于95%,内毒素含量小于1 EU/mg,可以用于动物与细胞实验。腹腔注射重组白脂素60 min后C57小鼠血糖升高至峰值(重组白脂素组vs对照组P=0.021),120 min恢复到正常水平(重组白脂素组vs对照组P=0.03)。重组白脂素刺激MIHA细胞24 h,对细胞活性没有影响;检测糖原发现,不同浓度白脂素组糖原与对照组比较差异有统计学意义(P1=0.013,P2=0.036,P3=0.011)。结论通过原核表达系统成功表达及纯化了白脂素蛋白,该方法纯化后的白脂素具有降低MIHA细胞糖原含量及升高小鼠血糖的作用,这为白脂素功能的进一步研究提供了理论依据。 展开更多
关键词 原核表达与纯化 包涵体 白脂素 糖原分解 血糖
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鸡WDR72基因的克隆表达及其相应抗体的制备
4
作者 李炳熠 刘长国 《中国家禽》 北大核心 2012年第14期31-34,共4页
WDR72是课题组前期初步鉴定的蛋壳强度相关基因,它是个新基因。本文首先参考GenBank中原鸡(G.gallus)的WDR72基因序列设计3对引物,从仙居鸡子宫组织的cDNA中克隆WDR72基因,并构建家鸡WDR72编码基因的pEGFP-N1真核表达重组质粒;其次,将... WDR72是课题组前期初步鉴定的蛋壳强度相关基因,它是个新基因。本文首先参考GenBank中原鸡(G.gallus)的WDR72基因序列设计3对引物,从仙居鸡子宫组织的cDNA中克隆WDR72基因,并构建家鸡WDR72编码基因的pEGFP-N1真核表达重组质粒;其次,将所克隆的WDR72基因的3′端编码序列构建到原核表达质粒pET-28b,然后利用0.4mmol/L的IPTG于37℃诱导表达WDR72的C端肽链;最后利用500mmol/L的咪唑纯化该肽链,并免疫大白兔制备wdr72特异性多抗。上述工作将为深入研究WDR72基因的生物学特性及其生化功能提供基础。 展开更多
关键词 鸡 WDR72 基因克隆 原核表达与纯化
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马尔堡病毒糖蛋白RBD基因的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备
5
作者 王琪 盖微微 +15 位作者 闫飞虎 冯娜 吴芳芳 赵梓淇 曹增国 李岭 迟航 金宏丽 邱泊宁 崔健男 赵永坤 王铁成 高玉伟 王化磊 杨松涛 夏咸柱 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期1261-1267,共7页
原核表达并纯化马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)糖蛋白(glycoprotein,GP)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,并以此为抗原免疫家兔制备抗MARV-GP-RBD多克隆抗体。参照GenBank提供的MARV GP全基因序列,找到主要抗原表位区域,... 原核表达并纯化马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)糖蛋白(glycoprotein,GP)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,并以此为抗原免疫家兔制备抗MARV-GP-RBD多克隆抗体。参照GenBank提供的MARV GP全基因序列,找到主要抗原表位区域,设计特异性引物,采用PCR方法扩增RBD基因,扩增产物经双酶切(EcoRⅠ/XhoⅠ)后定向克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a(+)-GP-RBD,转化BL21(DE3)感受态表达宿主菌,在不同条件下(时间、IPTG浓度、温度)诱导表达目的蛋白,并用His-Band N+柱进行亲和层析纯化;以纯化的重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过SDS-PAGE、Western blot和IFA鉴定重组蛋白的反应原性及免疫原性。结果显示:PCR扩增到长度为453bp的RBD基因片段;构建的重组质粒pET-30a(+)-GP-RBD经双酶切后得到与目的片段长度相同的特异性条带,测序结果显示没有突变;转化产物在培养7h、终浓度为0.4mmol/L IPTG和37℃条件下能够充分诱导目的蛋白表达,得到相对分子质量为25 000的重组蛋白,主要以包涵体形式存在,BCA试剂盒产量测定,每升诱导的重组菌可纯化约20mg纯度较高的目的蛋白;Western blot检测证实重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白能同时被抗His标签的单抗和兔源多抗识别并发生特异性反应,证明重组蛋白有良好的反应原性;IFA鉴定证实所制备的兔源多抗能够特异性识别表达MARV GP蛋白的重组杆状病毒rBacmid-GP-VP40,证明重组蛋白具有良好的免疫原性。结果表明:成功表达、纯化了MARV GP RBD蛋白,并完成了兔源多抗的制备,为MARV亚单位疫苗的制备和抗原、抗体检测方法的建立奠定基础。 展开更多
关键词 马尔堡病毒 糖蛋白受体结合域 原核表达与纯化 多克隆抗体
原文传递
猪热休克蛋白40(Hsp40)的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 被引量：6
6
作者 吕其壮 刘畅 +4 位作者 颜秋 陈艳 章烨雯 陈旭健 邓旭 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期728-734,共7页
克隆猪热休克蛋白40 (heat shock protein 40,Hsp40)基因并构建其原核表达载体,以纯化的猪Hsp40蛋白为抗原免疫兔制备抗猪Hsp40多克隆抗体。参照GenBank收录的猪Hsp40全基因序列,设计1对特异性扩增其CDS区全序列的引物,利用RT-PCR方法... 克隆猪热休克蛋白40 (heat shock protein 40,Hsp40)基因并构建其原核表达载体,以纯化的猪Hsp40蛋白为抗原免疫兔制备抗猪Hsp40多克隆抗体。参照GenBank收录的猪Hsp40全基因序列,设计1对特异性扩增其CDS区全序列的引物,利用RT-PCR方法扩增猪Hsp40基因;扩增产物经双酶切后定向克隆至原核表达载体pCzn1-His,测序无误后转化Arctic Express (DE3) RP感受态高效表达宿主菌,优化其表达条件(时间、IPTG浓度、温度)后,将可溶性的猪Hsp40重组蛋白用His-Band Ni^+层析柱进行纯化,用纯化的His-Hsp40重组蛋白免疫兔以制备多克隆抗体。采用抗原亲和纯化法对制备的多抗进行纯化,并采用间接ELISA法检测抗体效价。利用Western blot检测重组蛋白的免疫原性和反应原性,以及抗体的特异性。结果显示,克隆得到的猪Hsp40基因片段长度为1 485 bp,表达出的可溶性His-Hsp40重组蛋白相对分子质量约为57 800,制备出的猪Hsp40蛋白多克隆抗体效价为1∶512 000,且该多抗能够特异性识别His-Hsp40重组蛋白和猪肺泡巨噬细胞中的Hsp40蛋白。结果表明,成功克隆了猪Hsp40基因,表达并纯化了猪Hsp40蛋白,制备的兔抗猪Hsp40蛋白多克隆抗体能够有效地应用于猪Hsp40蛋白抗原的检测。 展开更多
关键词 猪Hsp40蛋白 原核表达与纯化 多克隆抗体 猪圆环病毒2型
原文传递
传染性喉气管炎病毒gD蛋白多克隆抗体制备与运用
7
作者 张晓彩 赵妍 +1 位作者 张雪梅 刘胜旺 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期69-75,97,共8页
鸡传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis,ILT）是由传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）引起的一种急性接触性上部呼吸道病。ILTV表面糖蛋白g D能刺激机体产生良好体液和细胞免疫应答,编码该蛋白的... 鸡传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis,ILT）是由传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）引起的一种急性接触性上部呼吸道病。ILTV表面糖蛋白g D能刺激机体产生良好体液和细胞免疫应答,编码该蛋白的g D基因是ILTV主要抗原性基因之一。以ILTV-LJS09株基因组为模板,PCR扩增g D基因主要抗原区域（54~344 aa）及g D基因,分别亚克隆至p GEX-6P-1和p CAGGS载体,构建原核表达载体p GEX-6P-1-g D163/1032和真核表达载体p CAGGS-g D。利用纯化ILTV、原核表达纯化获得重组蛋白r-g D和真核质粒p CAGGS-g D,对新西兰大白兔进行免疫与加强免疫,制备兔抗ILTV g D多克隆抗体。通过间接免疫荧光试验确定ILTV g D多克隆抗体和ILTV感染的鸡肝癌细胞表达蛋白发生反应,表明制备的ILTV g D多克隆抗体能识别ILTV天然抗原表位,最佳稀释度为11 000;用ILTV感染的LMH细胞培养物进行Western Blot分析,在40 ku左右出现一条特异性条带,与预期ILTV g D蛋白大小相符。激光共聚焦定位感染鸡肝癌细胞中ILTV g D蛋白,发现ILTV g D蛋白主要表达于感染细胞胞浆及融合细胞交界处。 展开更多
关键词 ILTV gD蛋白 原核表达与纯化 真核表达 多克隆抗体 细胞定位
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猪c-Myc蛋白多克隆抗体的制备
8
作者 田淑婧 陈羽彤 +2 位作者 陆春秀 苏春宇 吕其壮 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期894-900,共7页
【目的】克隆猪c-Myc基因CDS序列并构建其原核表达载体,同时纯化c-Myc蛋白并以此为抗原制备多克隆抗体,为进一步研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)Rep蛋白与宿主c-Myc蛋白之间的交互作用奠定基础。【方法】根据猪c-My... 【目的】克隆猪c-Myc基因CDS序列并构建其原核表达载体,同时纯化c-Myc蛋白并以此为抗原制备多克隆抗体,为进一步研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)Rep蛋白与宿主c-Myc蛋白之间的交互作用奠定基础。【方法】根据猪c-Myc全基因序列(GenBank No.NM_001005154)设计引物,以反转录PCR方法扩增c-Myc基因CDS序列,经Nde I/Xho I双酶切后定向克隆至原核表达载体pET-30a(+);转化至Arctic-Express^(TM)大肠杆菌后诱导表达;表达产物经变性、复性和His-Band Ni+层析柱亲和纯化后免疫新西兰白兔。抗原亲和层析法纯化抗体后,用间接ELISA法测定其效价,用Western blot检测其特异性。【结果】经检测,克隆产生的猪c-Myc基因CDS序列长度为1359 bp,c-Myc-His重组蛋白主要以包涵体形式出现,分子质量约为63 kDa,由此蛋白制备的多抗效价可以达到1∶1093500,并能特异性识别猪c-Myc蛋白和重组蛋白c-Myc-His。【结论】本研究成功制备了猪c-Myc蛋白多克隆抗体,为研究猪c-Myc蛋白功能和其与PCV2 Rep蛋白之间的相互作用奠定了良好基础。 展开更多
关键词 猪c-Myc蛋白 原核表达与纯化 多克隆抗体
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