一株双歧杆菌质粒聚合酶基因的PCR扩增和鉴定 被引量：5

1

作者 朱忠生 王立生 +6 位作者 曾位森 郑跃杰 罗深秋 李迎雪 姜泊 潘令嘉 周殿元 《中国微生态学杂志》 CAS CSCD 2007年第4期321-323,共3页

目的PCR扩增人双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因。方法用改良型MRS双歧杆菌选择培养基,从人新鲜粪便分离长双歧杆菌,PCR扩增长双歧杆菌质粒聚合酶(Bifidobacterium plasmid polymerase,BPP)基因,对BPP基因检测阳性的PCR产物通过序列分析,... 目的PCR扩增人双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因。方法用改良型MRS双歧杆菌选择培养基,从人新鲜粪便分离长双歧杆菌,PCR扩增长双歧杆菌质粒聚合酶(Bifidobacterium plasmid polymerase,BPP)基因,对BPP基因检测阳性的PCR产物通过序列分析,进行鉴定。结果人长双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因PCR扩增后,经1.0%琼脂糖凝胶电泳,测得BPP基因的相对分子质量约为1.9 kb。通过BLAST序列比对分析与GenBank中相应基因同源性为96%。结论成功克隆了1株双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因,为构建与双歧杆菌宿主质粒相适应的载体奠定了基础。 展开更多

关键词 双歧杆菌 质粒聚合酶 PCR

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革兰阴性杆菌中质粒ampC基因的检测与分析 被引量：33

2

作者 蒋燕群 曹娜 +2 位作者 陈泰尧 汤瑾 倪语星 《上海医学检验杂志》 北大核心 2003年第6期328-330,共3页

目的　运用多重聚合酶链反应 (PCR)检测革兰阴性杆菌的质粒ampC基因。 方法　通过热裂解获得DNA模板 ,用 6组引物进行多重PCR扩增 ,用琼脂糖凝胶电泳区分PCR产物。结果　 2 0 0株临床分离的革兰阴性杆菌中有 6株为质粒ampC基因阳性。 ... 目的　运用多重聚合酶链反应 (PCR)检测革兰阴性杆菌的质粒ampC基因。 方法　通过热裂解获得DNA模板 ,用 6组引物进行多重PCR扩增 ,用琼脂糖凝胶电泳区分PCR产物。结果　 2 0 0株临床分离的革兰阴性杆菌中有 6株为质粒ampC基因阳性。 结论　用多重PCR技术能简单、快速地检测革兰阴性杆菌质粒ampC基因 ,且特异性高。 展开更多

关键词 革兰阴性杆菌 质粒 AMPC基因 检测 分析 多重聚合酶链反应

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结核分枝杆菌候选抗原基因克隆与表达质粒构建 被引量：2

3

作者 陈建波 罗一鲁 +3 位作者 谭守勇 冯蝶仪 曹智忠 刘志辉 《热带医学杂志》 CAS 2003年第1期38-40,共3页

目的克隆并构建编码结核分枝杆菌(MTB)ESAT6,Ag85B和MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中分别扩增出ESAT6,Ag85B和MPT64基因(288bp,978bp and 687bp),并克隆到T载体,然后用双内... 目的克隆并构建编码结核分枝杆菌(MTB)ESAT6,Ag85B和MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中分别扩增出ESAT6,Ag85B和MPT64基因(288bp,978bp and 687bp),并克隆到T载体,然后用双内切酶消化后,与同样酶消化的pGEX-4T-2连接,转化大肠杆菌E.coli DH5α,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符,测序结果与文献报道一致,证实符合表达框架。结论成功地克隆并构建了ESAT6,Ag85B和MPT64基因的重组表达质粒pGEX-ESAT6,pGEX-Ag85B和pGEX-MPT64。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 抗原 基因克隆 表达质粒 聚合酶链反应

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双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β-防御素-2基因表达及其信号转导机制 被引量：1

4

作者 王国兴 吴琦 +3 位作者 黄宁 冯云 李成梁 王伯瑶 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第8期1656-1657,共2页

目的:本项研究目的是检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞hBD-2基因的激活作用并分离其活性组分,进一步探讨其受体及其胞内信号传导通路. 方法:厌氧培养长双歧杆菌,采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取方法获得双歧杆菌胞壁蛋白质成份,利用S... 目的:本项研究目的是检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞hBD-2基因的激活作用并分离其活性组分,进一步探讨其受体及其胞内信号传导通路. 方法:厌氧培养长双歧杆菌,采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取方法获得双歧杆菌胞壁蛋白质成份,利用SepharylS-100HR分子筛分离细胞壁蛋白.分别利用活菌,热灭活全菌,全细胞壁组份和全细胞壁蛋白组分,刺激人肠腺上皮细胞Caco-2,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法、Northem杂交、免疫细胞化学染色和ELISA等技术在mRNA和肽水平上检测hBD-2基因的表达.应用Westem Blotting技术检测到IκB-α磷酸化和降解、NF-κBp65的核移位以及细胞内MAPKs蛋白分子ERK1/2、p38 MAPK和JNK的磷酸化. 展开更多

关键词 人肠腺上皮细胞 长双歧杆菌 基因表达及 蛋白诱导 Β-防御素-2 信号转导机制 hBD-2基因 NORTHERN杂交 逆转录聚合酶链反应

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双歧杆菌质粒聚合酶基因对质粒载体稳定性的影响 被引量：1

5

作者 荀安营 王立生 +5 位作者 李娜 朱忠生 李迎雪 龙若庭 曾位森 朱惠明 《中国微生态学杂志》 CAS CSCD 2009年第2期104-105,共2页

目的探讨双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因(Bifidobacterium plasmid polymerase,BPP)对人工构建的大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭质粒载体(shuttle vector)在长双歧杆菌中稳定性的影响。方法首先电转化质粒pBADs-A和pBADs-BPP至长双歧杆菌,培养... 目的探讨双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因(Bifidobacterium plasmid polymerase,BPP)对人工构建的大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭质粒载体(shuttle vector)在长双歧杆菌中稳定性的影响。方法首先电转化质粒pBADs-A和pBADs-BPP至长双歧杆菌,培养鉴定后,接种含质粒pBADs-A和pBADs-BPP的双歧杆菌于AMP-和AMP+的MRS培养液中。厌氧培养后,将样品涂布于AMP+的MRS固体培养板上计数菌落数。结果相同条件下质粒pBADs-BPP组菌落数高于质粒pBADs-A组(P<0.05)。结论BPP可以增加质粒载体的稳定性。 展开更多

关键词 双歧杆菌 质粒聚合酶基因 质粒载体 稳定性

原文传递

双歧杆菌质粒聚合酶基因表达系统的构建及其鉴定

6

作者 朱忠生 王立生 +2 位作者 曾位森 张定国 付丹 《中国微生态学杂志》 CAS CSCD 2013年第11期1255-1258,共4页

目的构建可以在双歧杆菌表达外源性基因的系统。方法 PCR扩增双歧杆菌质粒聚合酶基因(BPP)并连接至质粒pBS-T以形成重组质粒pBS-BPP。PCR扩增双歧杆菌内源性阿拉伯糖苷酶的启动子及分泌性信号肽DNA序列(ara)并连接至质粒pBAD-A以形成重... 目的构建可以在双歧杆菌表达外源性基因的系统。方法 PCR扩增双歧杆菌质粒聚合酶基因(BPP)并连接至质粒pBS-T以形成重组质粒pBS-BPP。PCR扩增双歧杆菌内源性阿拉伯糖苷酶的启动子及分泌性信号肽DNA序列(ara)并连接至质粒pBAD-A以形成重组质粒pBAD-ara,然后将增强绿色荧光蛋白(eGFP)基因连接至质粒pBAD-ara以形成重组质粒pBAD-ara-GFP。采用基因重组技术重组含有ara、BPP、eGFP基因序列并可将外源性基因分泌表达于菌体外及锚定表达于细胞壁的质粒pBS-BPP-ara-GFP,激光共聚焦显微镜下观察含有pBS-BPP-ara-GFP质粒及对照质粒的E.coli,验证eGFP定位表达情况。结果所构建的表达系统可以在E.coli中表达eGFP基因。结论通过基因重组方法成功构建了双歧杆菌表达系统,其可将外源基因分泌表达于菌体外。 展开更多

关键词 双歧杆菌 双歧杆菌质粒聚合酶基因(bpp) ARA eGFP外源性基因表达系统

原文传递

新疆维吾尔族肠道中高产胞外多糖双歧杆菌的筛选及其抗氧化活性 被引量：4

7

作者 蔡静静 徐晓裕 +4 位作者 张艳 张亚川 魏小晶 阚泽宇 倪永清 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第8期144-151,共8页

使用Wilkins-Chalgren厌氧菌琼脂和BSM培养基作为筛选平板,结合重复基因外回文序列-聚合酶链式反应和16S rRNA序列分析,对新疆维吾尔族婴儿及其母亲粪便中的双歧杆菌(Bifidobacterium)进行分离鉴定,并筛选出高产胞外多糖的双歧杆菌,测... 使用Wilkins-Chalgren厌氧菌琼脂和BSM培养基作为筛选平板,结合重复基因外回文序列-聚合酶链式反应和16S rRNA序列分析,对新疆维吾尔族婴儿及其母亲粪便中的双歧杆菌(Bifidobacterium)进行分离鉴定,并筛选出高产胞外多糖的双歧杆菌,测定其多糖的抗氧化活性以及菌株的耐受性和黏附性。结果显示,20份粪便样品中共分离出52株双歧杆菌,其中假小链双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)14株,假长双歧杆菌(B.pseudolongum)8株,两歧双歧杆菌(B.bifidum)9株,短双歧杆菌(B.breve)7株,长双歧杆菌婴儿亚种(B.longum subsp.infantis)5株,动物双歧杆菌乳亚种(B.animal subsp.lactis)6株以及长双歧杆菌(B.longum)3株。经过表型初筛和苯酚-硫酸法复筛,共筛选出7株高产胞外多糖的双歧杆菌,37℃发酵36 h后胞外多糖产量均可达400 mg/L以上。抗氧化活性实验结果表明7株双歧杆菌所产的胞外多糖对过氧化氢自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基均有一定的清除能力。此外,菌株BF66-16相较于其他几株双歧杆菌具有较强的胃肠液耐受性以及黏附性,因此来源于婴儿粪便的BF66-16可以作为潜在的抗氧化菌株应用于制药和食品工业中。 展开更多

关键词 双歧杆菌 重复基因外回文序列-聚合酶链式反应 胞外多糖 抗氧化活性

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人源性热休克蛋白70在大肠杆菌中的表达及鉴定

8

作者 宁晓暄 吴开春 +2 位作者 李源 时永全 樊代明 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第11期973-975,共3页

为在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白 70 (HSP70 )的基因 ,以质粒为模板 ,采用PCR方法进行扩增 ,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳 ,回收大小约 1 96kb的片段 ;回收片段经T A克隆法克隆到pUCm T载体上 ,并进行DNA测序 ;将目的基因片段从pUC... 为在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白 70 (HSP70 )的基因 ,以质粒为模板 ,采用PCR方法进行扩增 ,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳 ,回收大小约 1 96kb的片段 ;回收片段经T A克隆法克隆到pUCm T载体上 ,并进行DNA测序 ;将目的基因片段从pUCm T载体上酶切后 ,亚克隆到表达载体pET 2 1a(+)上 ;将重组质粒pET 2 1a(+) /HSP转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导后 ,收集细菌 ,菌体裂解后进行SDS PAGE及Westernblot检测。结果表明 ,应用PCR方法扩增出约 1 96kb的目的片段 ,序列测定结果证实 ,扩增的HSP70基因序列与GeneBank中HSP70cDNA序列一致 ;经EcoRⅠ+XhoⅠ酶切及PCR鉴定证实 ,HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET 2 1a(+)上 ;转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,进行SDS PAGE ,发现在分子量为 72 0 0 0处有表达量明显增多的蛋白条带 ,Westernblot证实其为目的条带。 展开更多

关键词 大肠杆菌 热休克蛋白70 基因克隆 基因表达 质粒 聚合酶链反应 肿瘤免疫学

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重组HIV-1跨膜蛋白gp41在大肠杆菌中的表达

9

作者 王静 王斌 +2 位作者 路永波 王秋波 张艳丽 《青岛大学医学院学报》 CAS 2000年第3期161-163,共3页

1目的　构建重组 HIV- 1SF2株跨膜蛋白 gp41基因片段的原核表达克隆并在大肠杆菌中表达。2方法　通过聚合酶链反应 (PCR)扩增目的基因 ,然后用限制性内切酶将其与原核表达载体 p MAL - p2定向连接 ,构建成重组质粒转入大肠杆菌 DH5α菌... 1目的　构建重组 HIV- 1SF2株跨膜蛋白 gp41基因片段的原核表达克隆并在大肠杆菌中表达。2方法　通过聚合酶链反应 (PCR)扩增目的基因 ,然后用限制性内切酶将其与原核表达载体 p MAL - p2定向连接 ,构建成重组质粒转入大肠杆菌 DH5α菌中。经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE电泳分析有无重组蛋白表达。3结果　获得了重组的原核表达质粒及其表达产物。4结论　在 p MAL - p2中构建的 HIV - 1gp41重组质粒可在大肠杆菌中表达。 展开更多

关键词 重组HIV-1跨膜蛋白 大肠杆菌 质粒 基因重排 GP41 基因表达 聚合酶链反应 艾滋病 AID3

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乙型肝炎病毒前-X在大肠杆菌中的表达和纯化

10

作者 王春花 成军 +3 位作者 郎振为 李蕴茹 闫杰 张黎颖 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2005年第13期1612-1614,共3页

目的:在大肠杆菌中表达乙型肝炎病毒(HBV)前-X蛋白, 并进行纯化和鉴定. 方法:通过聚合酶链式反应(PCR)获得HBV前-X基因,将前-X克隆至PET32a+,构建原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达,表达产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),考... 目的:在大肠杆菌中表达乙型肝炎病毒(HBV)前-X蛋白, 并进行纯化和鉴定. 方法:通过聚合酶链式反应(PCR)获得HBV前-X基因,将前-X克隆至PET32a+,构建原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达,表达产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),考马斯亮蓝染色.采用凝胶电泳回收纯化.经Western blot. 结果:成功扩增获得HBV的前-X编码基因片断,并构建大肠杆菌表达载体.表达载体转化的大肠杆菌经过IPTG 的诱导,裂解,SDS-PAGE,结果显示得到了目的蛋白Mr27 000.以抗-His的单克隆抗体进行的western blot杂交实验,结果表明表达、纯化的目的蛋白具有特异性免疫反应识别. 结论:成功表达HBV的前-X蛋白,对于研究HBV的前- X蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了坚实的基础. 展开更多

关键词 大肠杆菌 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 纯化 聚合酶链式反应(PcR) 乙型肝炎病毒(HBV) SDS-PAGE WESTERN WESTERN blot 表达载体 前-X基因 单克隆抗体 特异性免疫 生物学特性 X蛋白 重组质粒 原核表达 诱导表达 表达产物 基因片断

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基因工程

11

《生物技术通报》 CAS CSCD 1995年第4期33-49,共17页

关键词 质粒 肠杆菌 基因组DNA 寡核苷酸 DNA-聚合酶 启动子 转基因 序列分析 重组蛋白 融合蛋白

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基因工程

12

《生物技术通报》 CAS CSCD 1996年第1期33-52,共20页

960001 用次级脉冲场凝胶电泳分离大分子DNA[英]/Lai,E.…∥Anal. Biochem. -1995,224(1).-68～74[译自DBA,1995,14(7),95-03698] 报道了用次级脉冲场凝胶(SPFG)电泳在不降低分辨率的情况下提高大分子DNA的分离速度。然而,重复SPFG条件... 960001 用次级脉冲场凝胶电泳分离大分子DNA[英]/Lai,E.…∥Anal. Biochem. -1995,224(1).-68～74[译自DBA,1995,14(7),95-03698] 报道了用次级脉冲场凝胶(SPFG)电泳在不降低分辨率的情况下提高大分子DNA的分离速度。然而,重复SPFG条件的试验却没有成功。于是人们试图精确限定次级脉冲对分离大分子DNA的作用。 展开更多

关键词 质粒DNA 肠杆菌 基因文库 启动子 DNA片段 序列分析 聚合酶 鼠伤寒沙门氏菌 基因表达 限制性位点

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枸橼酸杆菌中质粒介导喹诺酮耐药基因的检测 被引量：2

13

作者 邵宜波 李旭 +1 位作者 胡立芬 谢琴秀 《中华传染病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期513-518,共6页

目的了解枸橼酸杆菌中质粒介导喹诺酮耐药（PMQR）基因的分布，以期发现新型PMQR基因。测定临床分离的PMQR基因阳性枸橼酸杆菌对临床常用抗菌药物的敏感性。方法收集安徽医科大学第一附属医院检验科2009年临床分离的枸橼酸杆菌，PCR扩增... 目的了解枸橼酸杆菌中质粒介导喹诺酮耐药（PMQR）基因的分布，以期发现新型PMQR基因。测定临床分离的PMQR基因阳性枸橼酸杆菌对临床常用抗菌药物的敏感性。方法收集安徽医科大学第一附属医院检验科2009年临床分离的枸橼酸杆菌，PCR扩增qnr、nnr（6’）-Ib-cr和qepA基因，产物纯化测序，测序结果在GenBank上比对并行转移接合实验。对收集的PMQR基因阳性枸橼酸杆菌及其接合子，采用琼脂对倍稀释法进行临床常用抗菌药物的药物敏感试验。结果收集的枸橼酸杆菌共31株，8株菌株扩增出qnr，qnr基因阳性率为25．8％；其中6株扩增出qnrB。4株qnr阳性菌株的qnr基因转移接合成功。在qnr阳性的枸橼酸杆菌中，测序发现1种PMQR基因新亚型，命名为qnrB24。所有qnr阳性临床菌株对喹诺酮类药物的耐药率为87．5％，对头孢噻肟、阿米卡星、头孢他啶、头孢吡肟和庆大霉素的耐药率分别为75．0％、7．5％、62．5％、37．5％和87．5％，所有qnr阳性菌株对亚胺培南耐药表型为敏感。喹诺酮类药物对qnr阳性的接合子最低抑菌浓度升高10-23倍，敏感性下降。结论安徽地区枸橼酸杆菌中qnr基因型的检出率较高，以qnrB基因型为主，qnr阳性枸橼酸杆菌对常用抗菌药物耐药性较高。 展开更多

关键词 质粒 喹诺酮类 抗药性 细菌 聚合酶链反应 基因扩增 柠檬酸杆菌属

原文传递

用Red重组系统快速敲除大肠杆菌aroL和aroK基因 被引量：10

14

作者 汪莉 王玉民 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2007年第4期308-311,共4页

目的:利用Red重组系统构建aroL和aroK缺失的大肠杆菌工程菌株。方法:本研究应用PCR扩增两翼与目的基因上下游同源的、含有氯霉素抗性基因片段,电击转化大肠杆菌BW25113。在阿拉伯糖诱导下,含有质粒pKD46的菌株DH5α表达λ噬菌体的3个重... 目的:利用Red重组系统构建aroL和aroK缺失的大肠杆菌工程菌株。方法:本研究应用PCR扩增两翼与目的基因上下游同源的、含有氯霉素抗性基因片段,电击转化大肠杆菌BW25113。在阿拉伯糖诱导下,含有质粒pKD46的菌株DH5α表达λ噬菌体的3个重组蛋白,利用含同源臂的氯霉素抗性片段分别替换目的基因aroK和aroL,并进一步利用FTP位点专一性重组将氯霉素抗性基因删除。结果:成功地敲除了aroK和aroL基因。结论:莽草酸是一种具有极高价值的精细化工产品和医药中间体,具有广泛的医药、化工应用价值。莽草酸是莽草酸途径中的重要中间产物,它在莽草酸激酶(aroK和aroL)的作用下流向3-磷酸莽草酸,阻碍了莽草酸在大肠杆菌体内的堆积。敲除上述基因将为使用大肠杆菌发酵生产莽草酸奠定基础。 展开更多

关键词 RED重组系统 基因敲除 大肠杆菌 聚合酶链反应 质粒 莽草酸激酶

原文传递

构建Neuregulin1克隆载体的实验

15

作者 张际绯 金连弘 +2 位作者 傅松滨 史忠诚 于旸 《中国临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2005年第15期117-119,共3页

目的:Schwann细胞具有促进神经元再生的作用,Neuregulin1(NRG1)具有促进神经元再生和Schwann细胞增殖的效应,构建NRG1克隆载体,可为下一步建立NRG1转染的Schwann细胞系,对神经损伤模型进行Schwann细胞移植,观察其对神经损伤的修复作用... 目的:Schwann细胞具有促进神经元再生的作用,Neuregulin1(NRG1)具有促进神经元再生和Schwann细胞增殖的效应,构建NRG1克隆载体,可为下一步建立NRG1转染的Schwann细胞系,对神经损伤模型进行Schwann细胞移植,观察其对神经损伤的修复作用提供重要实验方法。方法:实验于2003-09/2004-01在哈尔滨医科大学医学遗传学研究室完成。提取幼龄大鼠脑RNA,反转录聚合酶链反应,用XbaⅠ和EcoRⅠ对目的基因和载体质粒进行双酶切,T4连接酶连接Schwann后转化Top10感受态大肠杆菌,挑取LB(Amp+)平板生长克隆菌摇菌扩增,用菌液扩增聚合酶链反应检测目的基因,同时提取质粒与空载体并列电泳验证克隆质粒,进行克隆载体测序。结果:获得一株NRG1克隆质粒,测序结果显示为NRG1新的异构体,用基因组DNA和cDNA为模板扩增聚合酶链反应验证是NRG1新的剪切体。结论:构建的NRG1克隆异构体是大鼠NRG1基因克隆载体,可用于进一步的细胞转染、蛋白表达功能检测和细胞移植研究。 展开更多

关键词 克隆载体 SCHWANN细胞 反转录聚合酶链反应 聚合酶链反应检测 哈尔滨医科大学 神经元再生 基因组DNA 细胞移植 目的基因 医学遗传学 细胞增殖 实验方法 修复作用 神经损伤 损伤模型 脑RNA 幼龄大鼠 载体质粒 大肠杆菌 cDNA

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携带幽门螺杆菌ureB和IL-2质粒DNA的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗构建

16

作者 徐灿 李兆申 +6 位作者 杜奕奇 屠振兴 龚燕芳 金晶 孙波 杨骅 许国铭 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期234-238,共5页

目的　构建编码幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,H .pylori)尿素酶B亚单位 (ureB)基因和小鼠IL 2基因以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的核酸疫苗 ,体外转染Cos 7细胞 ,鉴定其表达蛋白的免疫性。方法　应用聚合酶链式反应 (PCR)技术从H .pylor... 目的　构建编码幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,H .pylori)尿素酶B亚单位 (ureB)基因和小鼠IL 2基因以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的核酸疫苗 ,体外转染Cos 7细胞 ,鉴定其表达蛋白的免疫性。方法　应用聚合酶链式反应 (PCR)技术从H .pylori标准菌株CCUG1 7874基因组DNA扩增ureB基因 ,从重组质粒 pCIneo IL 2扩增小鼠IL 2基因 ,通过T A克隆分别插入 pUCmT载体 ,检测ureB及IL 2的核苷酸序列 ,通过酶切、连接反应分别克隆入真核表达载体 pIRES ,PCR和酶切反应进行鉴定 ;重组载体 pIRES ureB和 pIRES ureB IL 2转入减毒鼠伤寒沙门菌LB50 0 0 ,抽提质粒 ,再次转入SL72 0 7,反复传代 ,鉴定核酸疫苗载体菌的稳定性。通过脂质体法将重组载体 pIRES ureB和pIRES ureB IL 2转染Cos 7细胞 ,SDS PAGE及Westernblot法检测表达蛋白的免疫性。结果　扩增出长约 1 70 0bp的ureB基因和 51 0bpIL 2 ,测序结果表明 ,扩增出的ureB基因与基因库H .pyloriureB序列一致 ,IL 2序列和小鼠的IL 2序列一致 ,PCR和酶切鉴定结果证实ureB和IL 2基因克隆入真核表达载体 pIRES ,并成功构建了稳定的幽门螺杆菌ureB和IL 2基因以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的核酸疫苗 ,并且以Westernblot检测到特异性的相对分子质量 (Mr)为 6 6× 1 0 3的UreB蛋白? 展开更多

关键词 减毒鼠伤寒沙门菌 质粒DNA 疫苗构建 聚合酶链式反应(PCR) H.pylori IL-2基因 编码幽门螺杆菌 Cos-7细胞 Western ureB基因 SDS-PAGE 真核表达载体 尿素酶B亚单位 pylori) 核酸疫苗 相对分子质量 BLOT检测 表达蛋白 重组载体

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牛朊病毒正常蛋白特异性片段的克隆表达和纯化 被引量：1

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作者 李炎鑫 马贵平 +1 位作者 尹少满 田波 《检验检疫科学》 2005年第3期3-6,共4页

〔目的〕表达重组牛朊病毒正常蛋白特异性片段。〔方法〕用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出牛朊病毒正常蛋白特异性片段基因,利用DNA重组技术,将牛朊病毒正常蛋白特异性片段基因插入表达载体pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,将表达... 〔目的〕表达重组牛朊病毒正常蛋白特异性片段。〔方法〕用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出牛朊病毒正常蛋白特异性片段基因,利用DNA重组技术,将牛朊病毒正常蛋白特异性片段基因插入表达载体pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,将表达产物(包涵体)用8mol/L尿素溶解,在变性条件下用Cu2+氧化复性纯化。〔结果〕重组表达质粒在大肠杆菌中得到了高效表达,目的蛋白分子量约为15KD,Westernblotting分析表明,目的蛋白具有朊病毒蛋白的抗原特性,变性条件下用Cu2+氧化复性纯化得到电泳纯的重组蛋白。〔结论〕这一工作为下一步制备抗体和进行结构、功能的研究打下扎实基础。 展开更多

关键词 特异性 片段 纯化 克隆表达 聚合酶链式反应 DNA重组技术 牛 重组表达质粒 大肠杆菌 氧化复性 Cu2+ 目的蛋白 朊病毒蛋白 表达载体 基因插入 表达产物 高效表达 抗原特性 重组蛋白 包涵体 分子量 分析表 变性 引物 电泳

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医药其他

18

《生物技术通报》 CAS CSCD 1990年第12期83-90,共8页

903415 通过克隆 DNA 片段的聚合酶链反应进行序列分析和扩增以鉴定结核分枝杆菌[英]/Patel,R.J.…∥J.Clin.Microbiol.-1990,28(3).-513～518[译自DBA,1990,9(8),90-04436]描述了利用聚合酶链反应(PCR)扩增的分枝杆菌 DNA,产生一种特异。

关键词 序列分析 聚合酶链反应 基因功能分析 载体质粒 人腺癌细胞 重链可变区 编码人 大肠杆菌表达 密码子 细胞培养物

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不同喂养方式婴儿肠道菌群分布特征 被引量：4

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作者 孙凤春 张文卿 +2 位作者 吕锐 于红 陈云庆 《中华实用儿科临床杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期844-847,共4页

目的探讨不同喂养方式婴儿肠道菌群分布特征。方法62例30～120d健康婴儿按喂养方式分为：母乳喂养、国产奶粉喂养、进口奶粉喂养及混合喂养4组。采集婴儿新鲜粪便标本。均分成2份，一份通过厌氧法分离培养并计数肠道双歧杆菌；另一份提... 目的探讨不同喂养方式婴儿肠道菌群分布特征。方法62例30～120d健康婴儿按喂养方式分为：母乳喂养、国产奶粉喂养、进口奶粉喂养及混合喂养4组。采集婴儿新鲜粪便标本。均分成2份，一份通过厌氧法分离培养并计数肠道双歧杆菌；另一份提取总DNA，通过肠杆菌基因问共有序列一PcR指纹图谱法寻找不同组间差异条带并进行克隆、测序及序列比对分析。结果母乳喂养组与混合喂养组肠道双歧杆菌数[（9．10±1．33）cug；（8．62±1．35）cfu/g]高于国产及进口奶粉喂养组[（7．62±1．22）cfu／g；（7．32±0．80）cfu/g，t=3．23，P〈0．05]；母乳喂养组与混和喂养组之间及2个奶粉喂养组之间差异无统计学意义。不同组间ERIC—PCR条带比对分析发现2条差异条带（A：1100bp；B：1000bp），其中A条带主要见于母乳、国产奶粉及混合喂养组，B条带主要见于进口奶粉组；测序及局部序列排比检索基本工具分析结果显示，A、B序列同源菌均为长双歧杆菌；序列编码产物A可能为糖代谢相关酶类；B可能为蛋白代谢相关酶类。结论母乳及混合喂养婴儿肠道中双歧杆菌数量多于奶粉喂养婴儿；国产奶粉喂养婴儿肠道中菌群分布更接近于母乳喂养婴儿。 展开更多

关键词 婴儿 肠道菌群 喂养方式 肠杆菌基因间共有序列.聚合酶链式反应 双歧杆菌

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