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鹅星状病毒Ⅰ型与Ⅱ型双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用
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作者 姚展杏 王超 +6 位作者 林寅盛 赵丹 张嘉家 伍辉吉 朱婉君 张济培 陈济铛 《中国家禽》 北大核心 2025年第1期64-70,共7页
为建立一种快速检测鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)Ⅰ型(GAstV-1)与Ⅱ型(GAstV-2)的SYBR GreenⅠ双重实时荧光定量PCR检测方法,试验根据GAstV-1的ORF1a特异保守序列与GAstV-2的ORF2特异保守序列分别设计1对引物,将PCR扩增的两个片... 为建立一种快速检测鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)Ⅰ型(GAstV-1)与Ⅱ型(GAstV-2)的SYBR GreenⅠ双重实时荧光定量PCR检测方法,试验根据GAstV-1的ORF1a特异保守序列与GAstV-2的ORF2特异保守序列分别设计1对引物,将PCR扩增的两个片段分别克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒作为阳性质粒标准品,建立检测并鉴别GAstV-1与GAstV-2的SYBR GreenⅠ双重实时荧光定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行评估,并运用该方法对28份疑似痛风雏鹅临床样品进行检测。结果显示:建立的SYBR GreenⅠ双重实时荧光定量PCR方法检测GAstV-1、GAstV-2的标准曲线相关系数均在0.99以上,批间、批内重复变异系数均小于0.7%,最低检测限度均为10 copies/μL;该方法对鸭肝炎病毒、禽流感病毒、鹅细小病毒均无特异性扩增,同时检测GAstV-1与GAstV-2未出现交叉反应;该方法检测28份临床样品的GAstV阳性率为92.8%,其中GAstV-1和GAstV-2均为阳性的有6份,仅GAstV-2阳性的有18份,仅GAstV-1阳性的有2份。研究表明,建立的荧光定量PCR检测方法可用于GAstV-1与GAstV-2的鉴别检测,并且当前引发GAstV感染的主要病原依然是GAstV-2,GAstV-1和GAstV-2混合感染情况也同时存在。 展开更多
关键词 鹅星状病毒 GAstV-1 GAstV-2 双重荧光定量pcr 雏鹅 痛风
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猫冠状病毒和猫细小病毒双重荧光定量PCR方法的建立
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作者 郭存杰 王蕾 +3 位作者 毕振威 钱晶 张传美 谭业平 《中国动物检疫》 CAS 2024年第4期91-95,共5页
为建立猫冠状病毒(feline coronavirus,FCoV)和猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的双重荧光定量PCR方法,选取FCoV 3'UTR和FPV VP2基因保守区域,分别设计2对特异性引物和TaqMan MGB探针,并进行反应体系和条件优化,以及特异性、敏... 为建立猫冠状病毒(feline coronavirus,FCoV)和猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的双重荧光定量PCR方法,选取FCoV 3'UTR和FPV VP2基因保守区域,分别设计2对特异性引物和TaqMan MGB探针,并进行反应体系和条件优化,以及特异性、敏感性和重复性试验,探讨所建方法的可行性。结果显示:该方法可特异性检出FCoV和FPV,与猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫轮状病毒、支原体、衣原体、波氏杆菌、犬腺病毒和犬副流感病毒等病原核酸无交叉反应,对FCoV和FPV检测限均为1 copies/μL;FCoV和FPV阳性参考质粒组间和组内重复试验变异系数均小于3%;对35份临床样本进行检测,发现建立的双重荧光定量PCR方法阳性检出率比普通PCR方法高。结果表明,本研究建立的双重荧光定量PCR方法具有灵敏、特异和稳定等优点,可用于临床FCoV和FPV感染的早期鉴别诊断。 展开更多
关键词 猫冠状病毒 猫细小病毒 双重荧光定量pcr
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产气荚膜梭菌四环素耐药基因双重荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 欧兰欣 叶碧锦 +13 位作者 孙铭飞 戚南山 李娟 吕敏娜 林栩慧 蔡海明 胡俊菁 宋勇乐 陈祥杰 朱易斌 尹理君 张健騑 廖申权 张浩吉 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4630-4637,共8页
旨在开发一种快速、灵敏的针对产气荚膜梭菌四环素类耐药基因tetA(P)和tetB(P)的双重荧光定量PCR检测方法,为快速检测产气荚膜梭菌四环素类抗生素耐药性提供新策略。本研究针对tetA(P)和tetB(P)的保守序列设计引物和探针,构建重组质粒,... 旨在开发一种快速、灵敏的针对产气荚膜梭菌四环素类耐药基因tetA(P)和tetB(P)的双重荧光定量PCR检测方法,为快速检测产气荚膜梭菌四环素类抗生素耐药性提供新策略。本研究针对tetA(P)和tetB(P)的保守序列设计引物和探针,构建重组质粒,对退火温度和体系进行优化,同时采用药敏纸片琼脂扩散法测定菌株对四环素类药物的敏感性加以验证。结果发现,优化后的反应程序为95℃30 s;95℃5 s,56℃30 s,共39个循环。使用该反应程序仅能扩增重组质粒,对照菌株无扩增曲线;组内变异系数小于1.3%,组间变异系数小于1.8%,重组质粒最低检测限度为102 copies·μL^(-1)。使用本方法对33份产气荚膜梭菌临床分离株样品进行耐药基因检测,同时进行药敏试验,发现本研究建立的检测方法对四环素耐药基因的检出率均为75.8%(25/33),且与药敏试验结果一致。综上,本研究建立了一种特异、敏感、重复性好的产气荚膜梭菌四环素类耐药基因tetA(P)和tetB(P)的双重荧光定量PCR检测方法。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 四环素 tetA(P) tetB(P) 双重荧光定量pcr
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猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:17
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作者 武昱孜 熊祺琰 +5 位作者 刘蓓蓓 张珍珍 王佳 华利忠 韦艳娜 邵国青 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第8期1491-1498,共8页
建立同时检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体的双重荧光定量PCR方法。根据猪肺炎支原体P97序列和猪鼻支原体P37序列的特异性引物,分别标记FAM和Texas Red荧光报告基团的2条TaqMan探针,建立和优化双重实时荧光定量PCR反应条件和体系,同时检测... 建立同时检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体的双重荧光定量PCR方法。根据猪肺炎支原体P97序列和猪鼻支原体P37序列的特异性引物,分别标记FAM和Texas Red荧光报告基团的2条TaqMan探针,建立和优化双重实时荧光定量PCR反应条件和体系,同时检测其敏感性、特异性和重复性。建立的双重荧光定量PCR对猪肺炎支原体和猪鼻支原体的最低检测值均为10copies·μL-1;与猪源致病菌、病毒和其他常见细菌均无交叉反应;各浓度标准品的Ct值变异系数小于5%,重复性好。检测72份临床样本,其中猪肺炎支原体的肺阳性率为80%,鼻拭子阳性率22%,支气管肺泡灌洗液阳性率58.33%;猪鼻支原体的肺阳性率为40%,鼻拭子阳性率66%,支气管肺泡灌洗液阳性率41.67%。建立的双重荧光定量PCR方法比普通PCR更加敏感,实用性强,可用于临床样品的检测。该方法能同时快速和定量地检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体,在短时间内获得样品的多个信息,快速地解决了多次检测所需的时间以及经济消耗,为猪肺炎支原体和猪鼻支原体的监测和防控提供了新型、可靠的检测技术。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 猪鼻支原体 双重荧光定量pcr
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猪链球菌通用型和2型双重荧光定量PCR快速检测技术的建立和应用 被引量:6
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作者 吴静波 南文金 +4 位作者 黄健强 胡鸿惠 彭国良 彭凌 董小英 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期368-377,共10页
为快速区分检测猪链球菌血清型2型和其他血清型,以猪链球菌的保守基因gdh和2型特异性基因cps2J为靶基因设计引物和TaqMan探针,建立猪链球菌通用型和2型特异性的双重荧光定量PCR检测方法,并与常规PCR方法一起对临床样品进行检测。结果显... 为快速区分检测猪链球菌血清型2型和其他血清型,以猪链球菌的保守基因gdh和2型特异性基因cps2J为靶基因设计引物和TaqMan探针,建立猪链球菌通用型和2型特异性的双重荧光定量PCR检测方法,并与常规PCR方法一起对临床样品进行检测。结果显示:本方法在1.5h内可完成猪链球菌和2型猪链球菌同时检测,与其他细菌无交叉反应;检测灵敏度可达5拷贝数,标准曲线相关系数大于0.999,批内和批间CV均小于1.25%。对67份临床样品检测显示猪链球菌和2型猪链球菌检出率分别为79.1%和35.8%,与常规PCR检测结果的符合率为92.5%和89.6%,kappa值为0.800和0.757,具有极好的一致性。成功建立了灵敏、特异和稳定的双重荧光定量PCR方法,实现了猪链球菌和2型猪链球菌同时及快速诊断。 展开更多
关键词 猪链球菌 2型猪链球菌 双重荧光定量pcr 快速检测
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基于免疫磁分离-双重荧光定量PCR的鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的检测 被引量:5
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作者 马凯 高丽娟 +5 位作者 武会娟 杜美红 白羽 陈尔凝 刘杰 刘悦 《食品安全质量检测学报》 CAS 2015年第9期3373-3379,共7页
目的使用免疫磁分离-双重荧光定量PCR方法实现对鲜猪肉中金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的同时、快速检测。方法在37℃的条件下,利用特异性免疫磁球从250 m L循环体系中快速、有效地捕获目标菌。再通过特异性的引物与探针,对沙门氏菌和志贺... 目的使用免疫磁分离-双重荧光定量PCR方法实现对鲜猪肉中金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的同时、快速检测。方法在37℃的条件下,利用特异性免疫磁球从250 m L循环体系中快速、有效地捕获目标菌。再通过特异性的引物与探针,对沙门氏菌和志贺氏菌进行双重荧光定量PCR检测。结果本研究方法针对鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的检测限分别达到3.4 cfu/g和9.4 cfu/g。方法总体灵敏度、特异性和准确度均达到100%。此外,通过对30组实际样品的检测,该方法与传统标准方法的结果保持一致。结论本研究建立的免疫磁分离-双重荧光定量PCR方法比国标方法更快速和高效,适用于鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的快速检测。 展开更多
关键词 沙门氏菌 志贺氏菌 免疫磁分离 双重荧光定量pcr
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产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性双重荧光定量PCR方法的建立及应用 被引量:4
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作者 张蓉蓉 张腾飞 +4 位作者 艾地云 罗青平 温国元 王红琳 邵华斌 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第1期167-170,共4页
为了建立一种双重荧光定量PCR方法检测肠毒素cpe阳性的产气荚膜梭菌,试验通过对部分发表在NCBI中的产气荚膜梭菌序列进行比对,找到其α毒素和肠毒素cpe相对保守的序列,根据保守序列设计合成2对引物和1对探针,以构建的含有α毒素和cpe序... 为了建立一种双重荧光定量PCR方法检测肠毒素cpe阳性的产气荚膜梭菌,试验通过对部分发表在NCBI中的产气荚膜梭菌序列进行比对,找到其α毒素和肠毒素cpe相对保守的序列,根据保守序列设计合成2对引物和1对探针,以构建的含有α毒素和cpe序列的克隆载体作为标准品,进行系列条件优化及特异性、灵敏性和重复性试验。结果表明:该方法具有很好的特异性和重复性,外毒素cpa的灵敏度为1.5×10^(-2)ng/m L,且在1.5×104~1.5×10^(-2)ng/m L内Ct值与阳性质粒浓度的对数值呈很好的线性关系,R2值达到0.991;肠毒素cpe的灵敏度为1.8×10^(-2)ng/m L,且在1.8×103~1.8×10^(-2)ng/m L内Ct值与阳性质粒浓度的对数值呈很好的线性关系,R2值达到0.996;该方法对大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等细菌核苷酸无交叉反应;批间和批内重复性良好;同时对实验室保存的临床分离的疑似菌株用建立的荧光定量方法进行检测,结果临床分离菌株均为A型产气荚膜梭菌。说明该双重荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强和重复性好。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 外毒素cpa 肠毒素cpe 双重荧光定量pcr 条件优化 方法建立
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鼠疫一体系双重荧光定量PCR检测方法的建立及评价 被引量:3
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作者 董珊珊 段存娟 +4 位作者 郭英 石丽媛 钟佑宏 李伟 王鹏 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第5期38-43,共6页
本研究根据鼠疫耶尔森氏菌caf1及YPO0392基因,设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,构建一体系的检测体系,对其敏感性、特异性和稳定性进行评价,并对8份鼠疫阳性及24份阴性DNA样本进行应用评价。结果显示,一体系双重检测鼠... 本研究根据鼠疫耶尔森氏菌caf1及YPO0392基因,设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,构建一体系的检测体系,对其敏感性、特异性和稳定性进行评价,并对8份鼠疫阳性及24份阴性DNA样本进行应用评价。结果显示,一体系双重检测鼠疫DNA的敏感度为17.93×10^-5 ng/μL;19份鼠疫菌DNA都有扩增,25份非鼠疫菌DNA都未扩增;对8份阳性现场DNA样本进行检测,一体系检测结果均为阳性;对24份阴性DNA样本进行检测,结果均为阴性。结果表明,本研究成功建立了可同时检测鼠疫耶尔森氏菌caf1和YPO0392基因的一体系双重荧光定量PCR方法,具有良好的敏感性与特异性,操作方便并节约成本,能够代替单基因检测方法。 展开更多
关键词 鼠疫耶尔森氏菌 caf1 TPO0392 双重荧光定量pcr方法
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猪圆环病毒2型/3型双重荧光定量PCR检测方法 被引量:5
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作者 王林青 樊霖 +5 位作者 赵宇 田润博 崔建涛 韩昊莹 赵丽 陈红英 《安徽农业大学学报》 CAS CSCD 2021年第4期595-599,共5页
为了能够同时快速地检测和鉴别猪圆环病毒2型和3型(PCV2和PCV3),参考GenBank中已发表的PCV2和PCV3基因组序列,针对其保守区分别设计了2对特异性引物,经优化反应体系和条件,建立了能快速检测和鉴别PCV2/PCV3双重荧光定量PCR方法。结果表... 为了能够同时快速地检测和鉴别猪圆环病毒2型和3型(PCV2和PCV3),参考GenBank中已发表的PCV2和PCV3基因组序列,针对其保守区分别设计了2对特异性引物,经优化反应体系和条件,建立了能快速检测和鉴别PCV2/PCV3双重荧光定量PCR方法。结果表明,PCV2和PCV3的R2分别为0.999、0.9993,E值分别为3.5731、3.3734。该方法能同时特异地检测PCV2和PCV3,而对其他5种猪病原均未检测到荧光信号;PCV2和PCV3的最低检测值分别为41.1 copies·μL^(-1)、27.0 copies·μL^(-1);批内和批间变异系数均小于1%。临床样本检测结果显示,PCV2和PCV3的阳性率分别为62.12%(41/66)、48.48%(32/66),二者混合感染的阳性率为46.96%(31/66)。表明该方法具有敏感、特异和可靠等特点,该方法为PCV2和PCV3单独或者混合感染的早期诊断、定量检测及其流行病学调查提供了可行的技术支持。 展开更多
关键词 猪圆环病毒 PCV2和PCV3 双重荧光定量pcr 检测
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甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒双重荧光定量PCR方法的建立及应用 被引量:2
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作者 张磊 鲁淑婷 +1 位作者 李玉龙 黄洲风 《中国实验诊断学》 2015年第12期2063-2066,共4页
目的建立甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)的双重荧光定量PCR检测方法并应用于临床样本的检测。方法根据参考文献分别选取HAV以及HEV基因组的保守区域设计合成特异性引物和探针,从而建立并优化双重荧光定量PCR反应体系,之后评价反... 目的建立甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)的双重荧光定量PCR检测方法并应用于临床样本的检测。方法根据参考文献分别选取HAV以及HEV基因组的保守区域设计合成特异性引物和探针,从而建立并优化双重荧光定量PCR反应体系,之后评价反应体系的特异性、敏感性和稳定性。结果本研究建立的HAV和HEV双重荧光定量PCR技术应用于检测HAV核酸时检测极限可以达到1个拷贝/反应,对同一样品重复测定5次获得的Ct值的变异系数(CV)最大为1.5%,同时该体系检测HEV的最低检测极限也达到10个拷贝/反应,重复测试5次后Ct值的变异系数(CV)最大为2.6%,临床样本测试结果显示该体系能够对甲型肝炎和戊型肝炎临床样本中的病毒进行定量。结论本研究成功建立了HAV和HEV双重荧光定量PCR检测方法,灵敏度高,稳定性好,可以同时准确定量HAV和HEV,为这两种病毒的分子病原学诊断提供了一种更加快速的手段。 展开更多
关键词 甲型肝炎病毒 戊型肝炎病毒 双重荧光定量pcr 敏感性
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双重荧光定量PCR法检测正常人及系统性红斑狼疮患者白细胞介素18基因的表达 被引量:1
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作者 金晶 胡昕 吕建新 《分子诊断与治疗杂志》 2011年第5期296-299,共4页
目的建立双重荧光定量PCR方法研究人白细胞介素18基因(IL-18)的表达。方法分别用FAM和VIC两种不同荧光素标记IL-18基因和β-actin基因的MGB-TaqMan探针,在一个反应通道中,双重荧光RT-PCR定量测定PBMC中IL-18mRNA的量,并进行方法学评价... 目的建立双重荧光定量PCR方法研究人白细胞介素18基因(IL-18)的表达。方法分别用FAM和VIC两种不同荧光素标记IL-18基因和β-actin基因的MGB-TaqMan探针,在一个反应通道中,双重荧光RT-PCR定量测定PBMC中IL-18mRNA的量,并进行方法学评价。结果比较双重荧光定量PCR与单通道荧光定量PCR,发现没有差异。系统性红斑狼疮患者PBMC中IL-18mRNA含量高于正常人,有显著统计学意义(P<0.05)。结论双重荧光定量PCR技术具有敏感、特异、快速等特点,可用于人外周血IL-18mRNA的定量检测。 展开更多
关键词 双重荧光定量pcr 定量 白细胞介素18
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双重荧光定量PCR技术在药品微生物检验中的应用 被引量:9
12
作者 林铁豪 曾璞 《广东化工》 CAS 2018年第18期62-63,73,共3页
目的建立快速检测金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的双重荧光定量PCR方法并在药品微生物检测中应用。方法通过设计特异性引物和探针,扩增金黄色葡萄球菌的femB基因和铜绿假单胞菌的DNA gyrase subunit B基因,建立荧光定量PCR方法。将该方... 目的建立快速检测金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的双重荧光定量PCR方法并在药品微生物检测中应用。方法通过设计特异性引物和探针,扩增金黄色葡萄球菌的femB基因和铜绿假单胞菌的DNA gyrase subunit B基因,建立荧光定量PCR方法。将该方法应用于30批次药品微生物检测。结果建立同时检测金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的双重荧光定量PCR方法,从DNA提取到检测完毕仅需2 h。检测灵敏度为50 copies/μL,特异性为100%。30批次样品检验结果表明该方法与传统细菌培养方法结果一致。结论该法缩短了检测时间,具有良好的灵敏性和特异性,在药品微生物检验中有很好的应用前景。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 双重荧光定量pcr
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外环境样本中产毒型O1群霍乱弧菌双重荧光定量PCR快速检测方法的建立
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作者 黄世旺 徐丹戈 +6 位作者 徐昌平 张政 方叶珍 包芳珍 李剑 蒋雪凤 卢亦愚 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期29-32,36,共5页
目的研究建立双重荧光定量PCR技术快速检测产毒型O1群霍乱弧菌,并首次应用于外环境样本的检测中。方法从GenBank上下载O1群霍乱弧菌O抗原编码基因rfbO1和毒力基因CT序列,在rfbO1和CT保守区域设计特异性引物和探针,建立优化单一和双重荧... 目的研究建立双重荧光定量PCR技术快速检测产毒型O1群霍乱弧菌,并首次应用于外环境样本的检测中。方法从GenBank上下载O1群霍乱弧菌O抗原编码基因rfbO1和毒力基因CT序列,在rfbO1和CT保守区域设计特异性引物和探针,建立优化单一和双重荧光PCR反应体系,评价所建双重PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性,并应用于外环境样本的监测检验中。结果该方法对O1群霍乱弧菌检测具有高度特异性,对rfbO1和CT基因序列检出限达到1.0×102cfu/mL,构建的体系定量标准曲线相关系数分别为0.999和0.998,具有较好的稳定性,并首次从352件外环境样本中检测出了5株产毒型O1群霍乱弧菌。结论本研究建立的双重荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,可应用于外环境样本中产毒型O1群霍乱弧菌的大范围筛查。 展开更多
关键词 霍乱弧菌 双重荧光定量pcr 外环境 CT rfbO1
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副猪嗜血杆菌及巴氏杆菌双重荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:10
14
作者 姜睿姣 周丽军 +7 位作者 邬旭龙 张鹏飞 罗梓丹 肖璐 王印 姚学萍 杨泽晓 罗燕 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期489-494,共6页
为建立副猪嗜血杆菌(Hps)、多杀性巴氏杆菌(Pm)的双重荧光定量PCR检测方法,本研究基于Hps的Omp P2基因,Pm的PlpE基因设计两对特异性引物及探针,通过对反应条件优化,建立了一种同时检测Hps及Pm的双重荧光定量PCR方法。该方法能够特异性... 为建立副猪嗜血杆菌(Hps)、多杀性巴氏杆菌(Pm)的双重荧光定量PCR检测方法,本研究基于Hps的Omp P2基因,Pm的PlpE基因设计两对特异性引物及探针,通过对反应条件优化,建立了一种同时检测Hps及Pm的双重荧光定量PCR方法。该方法能够特异性地检测Hps和Pm,其对重组质粒标准品的最低检测浓度分别为5.60×10^2拷贝/μL、7.58×10^2拷贝/μL。双重与单一荧光定量PCR最低检测限相同,且均是常规PCR的100倍。重复性试验结果显示,该方法的组内和组间变异系数均小于2.5%。临床应用结果显示:该方法对阳性样品的检出率为53.57%,明显优于常规PCR和细菌分离鉴定。该方法能够用于两种疾病的同时检测和快速排查疾病。为两种疾病的防治提供有效检测工具。 展开更多
关键词 副猪嗜血杆菌 巴氏杆菌 双重荧光定量pcr
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蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫双重荧光定量PCR两步法检测技术的建立 被引量:5
15
作者 李佳 黄达娜 +3 位作者 张晓敏 牛丛 万成松 张仁利 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期32-39,共8页
目的建立同时检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫的双重荧光定量PCR两步检测方法。方法针对蓝氏贾第鞭毛虫的gdh基因和微小隐孢子虫的cowp基因分别设计特异性引物和TaqMan探针。优化引物和探针浓度后,确定反应体系和反应条件,对其灵敏度... 目的建立同时检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫的双重荧光定量PCR两步检测方法。方法针对蓝氏贾第鞭毛虫的gdh基因和微小隐孢子虫的cowp基因分别设计特异性引物和TaqMan探针。优化引物和探针浓度后,确定反应体系和反应条件,对其灵敏度、特异性、稳定性和重复性进行评价。通过与金标层析法进行医源性腹泻样本检测的比较评估该方法的实际应用价值。结果该方法能特异地检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫,对其它非目标虫种均不产生扩增曲线,特异性良好。对阳性质粒pMDTM19-T-GIA和pMDTM19-T-CRY同时定量扩增的敏感度分别为45.1 copies/μL和52.8 copies/μL;阳性质粒标准品的标准曲线在109 copies/μL^101 copies/μL之间线性关系良好(R2=0.99),批内和批间重复实验的变异系数均小于5%。该方法与金标层析法具有较好的一致性。结论建立的双重荧光定量PCR两步法可快速、灵敏、特异地同时检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫,具有较好的实际应用价值。 展开更多
关键词 双重荧光定量pcr 蓝氏贾第鞭毛虫 微小隐孢子虫
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马泰勒虫和弩巴贝斯虫双重荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:3
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作者 陈克伟 胡哲 +6 位作者 郭奎 刘荻萩 戚亭 郭巍 杨光璞 杜承 王晓钧 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期1282-1286,1292,共6页
马梨形虫病(EP)是由巴贝斯虫属的驽巴贝斯虫(B.caballi)和泰勒虫属的马泰勒虫(T.equi)感染引起的蜱传马属动物疾病。为建立EP两种病原的双重荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中T.equi和B.caballi 18S rRNA基因序列设计特异性引物... 马梨形虫病(EP)是由巴贝斯虫属的驽巴贝斯虫(B.caballi)和泰勒虫属的马泰勒虫(T.equi)感染引起的蜱传马属动物疾病。为建立EP两种病原的双重荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中T.equi和B.caballi 18S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体系和条件优化,建立了能够同时检测T.equi和B.caballi的双重荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果显示该方法与马疱疹病毒Ⅰ型(EHV-1),马疱疹病毒Ⅳ型(EHV-4),马流产沙门氏菌(S.abortus equi),马链球菌(S.equi),马传染性贫血病毒(EIAV)均无交叉反应,特异性强。敏感性试验结果显示,该方法对T.equi和B.caballi的质粒标准品的检测下限均为100拷贝/μL,敏感性高;将T.equi和B.caballi的质粒标准品10倍倍比稀释为1×10^(8)拷贝/μL~1×10^(4)拷贝/μL共5个稀释度,进行组内、组间重复性试验,结果显示该方法的组内、组间变异系数均小于5%,重复性好。利用本实验建立的方法对2019年我国北方西部地区200份马属动物全血样品进行检测,结果显示T.equi的阳性率为47%(94/200),B.caballi的阳性率为2.5%(5/200),其中T.equi和B.caballi混合感染率为1%(2/200),该方法与套式PCR的符合率为97.5%,且该方法具有耗时较短、易操作等特点。本研究首次建立的EP双重荧光定量PCR检测方法对T.equi和B.caballi的鉴别检测、病原监测、流行病学调查等均具有重要的意义。 展开更多
关键词 马梨形虫 马泰勒虫 驽巴贝斯虫 双重荧光定量pcr
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猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立和初步应用 被引量:3
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作者 邹宏 夏应菊 +5 位作者 李玲 徐璐 赵俊杰 王团结 张乾义 宋振辉 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期4422-4427,共6页
本研究旨在建立一种快速、高效、灵敏的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双重鉴别荧光定量PCR检测方法,针对CSFV E2基因和BVDV 5′UTR基因序列的高度保守区域设计特异性引物和探针,经过反应条件及体系的优化,建立双重RT-qPCR方... 本研究旨在建立一种快速、高效、灵敏的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双重鉴别荧光定量PCR检测方法,针对CSFV E2基因和BVDV 5′UTR基因序列的高度保守区域设计特异性引物和探针,经过反应条件及体系的优化,建立双重RT-qPCR方法。结果表明,该方法最低检测值均为5 copies·μL^(-1),比普通PCR灵敏约200倍,敏感性高;可准确区分CSFV和BVDV,且与口蹄疫病毒、猪伪狂犬病病毒等猪常见病原均无交叉反应,特异性强;组内和组间重复变异系数均小于2%,重复性良好。对109份临床样品及7份商品化牛血清分别采用构建的双重RT-qPCR检测方法及CSFV RT-qPCR检测方法(GB/T 27540—2011)和BVDV RT-qPCR检测方法(GB/T 18637—2018)进行检测和对比,符合率为100%,同时,检测结果还证实目前商品化牛血清中仍存在BVDV污染,为CSFV、BVDV的鉴别诊断及流行病学的调查提供了技术支持。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 牛流行性腹泻病毒 双重荧光定量pcr
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鉴别牛结节性皮肤病病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量:3
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作者 赵钟毅 闭璟珊 +11 位作者 尹德玮 吕荞 吴健皓 韦正吉 邹联斌 苏姣秀 汪伟 辛佳亮 彭久青 李文静 郑敏 胡传活 《中国动物检疫》 CAS 2023年第2期117-124,共8页
为实现牛结节性皮肤病病毒(LSDV)和羊痘病毒属(CaPV)其他成员的鉴别诊断,针对LSDV 010基因保守区域设计特异性引物及TaqMan探针,与文献报道的CaPV 068基因的通用引物及探针组合,通过优化反应体系和条件,建立了一种可同时鉴别检测LSDV和C... 为实现牛结节性皮肤病病毒(LSDV)和羊痘病毒属(CaPV)其他成员的鉴别诊断,针对LSDV 010基因保守区域设计特异性引物及TaqMan探针,与文献报道的CaPV 068基因的通用引物及探针组合,通过优化反应体系和条件,建立了一种可同时鉴别检测LSDV和CaPV其他成员的双重荧光定量PCR检测方法。结果显示:本方法可以特异性扩增LSDV和CaPV其他成员,并且与其他牛、羊病毒无交叉反应,特异性好;对pLSDV-010和pCaPV-068质粒标准品的最低检测限均为15 copies/μL,具有较高的灵敏性;组内和组间变异系数均小于1.75%,重复性良好。应用本试验建立的方法与荧光定量PCR方法同时检测542份临床样品,发现CaPV的样品符合率为98.52%,LSDV为99.63%。本试验建立的方法为CaPV鉴别筛查、LSDV精准防控及流行病学调查提供了快捷有效的技术手段。 展开更多
关键词 牛结节性皮肤病病毒 羊痘病毒属 双重荧光定量pcr TAQMAN探针 鉴别检测
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基于TaqMan探针的双重荧光定量PCR方法检测海产品中的副溶血弧菌 被引量:5
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作者 王淑娜 周向阳 +5 位作者 胡兴娟 沈飚 贝文联 朱应伟 陈健舜 方维焕 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期455-458,共4页
目的建立海产品中副溶血弧菌检测的双重荧光定量PCR体系。方法针对副溶血弧菌种特异性基因tlh和tdh设计引物和TaqMan探针,建立双重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血弧菌。结果副溶血弧菌可得到... 目的建立海产品中副溶血弧菌检测的双重荧光定量PCR体系。方法针对副溶血弧菌种特异性基因tlh和tdh设计引物和TaqMan探针,建立双重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血弧菌。结果副溶血弧菌可得到特异性扩增,而其它与副溶血弧菌共存于海产品中的细菌均未见扩增曲线。副溶血弧菌与其它细菌的混合DNA检测表明,其它细菌基因组的存在时并不干扰副溶血弧菌检测。副溶血弧菌典型菌株FJ14和BJ97的敏感性试验显示,该体系的最低检测DNA浓度分别为49.8pg与77.8pg,最低检测细菌浓度为56CFU/mL和371CFU/mL。对舟山菜市场采集的50份样本检测表明,32份为tlh基因阳性,3份为tdh基因阳性,与传统方法的检测结果相同。结论与传统检测方法相比,副溶血弧菌的双重荧光定量PCR检测方法快速准确,结果直观。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 tlh基因 tdh基因 双重荧光定量pcr
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耐药基因mcr-1和blaNDM-1的双重荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:2
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作者 张克旭 滚双宝 +3 位作者 车勇良 周伦江 林长光 郭长明 《动物医学进展》 北大核心 2021年第10期9-13,共5页
为快速同时检测多黏菌素抗性基因mcr-1和编码新德里金属-β-内酰胺酶1(NDM-1)的blaNDM-1基因,基于mcr-1和blaNDM-1的保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,创建双重荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法特异性检测仅能扩增阳性质粒,对... 为快速同时检测多黏菌素抗性基因mcr-1和编码新德里金属-β-内酰胺酶1(NDM-1)的blaNDM-1基因,基于mcr-1和blaNDM-1的保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,创建双重荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法特异性检测仅能扩增阳性质粒,对照菌株均无特异性曲线;组内重复变异系数和组间重复变异系数均小于1.5%;质粒标准品的检出下限为2.28×2^(3)拷贝/μL。用该方法对92株分离细菌和24份猪场环境样品进行检测,mcr-1和blaNDM-1基因均显示阴性;24份猪口腔液样品,其中5份样品检测到mcr-1基因,1份猪口腔液中同时携带mcr-1基因和blaNDM-1基因。 展开更多
关键词 多黏菌素 mcr-1基因 blaNDM-1基因 双重荧光定量pcr
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