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基于小型化Cas蛋白的CRISPR/Gal4BD-Cas供体适配基因编辑系统研究
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作者 杨森 马宝霞 +7 位作者 钱泓润 崔婕妤 张潇筠 李利达 魏泽辉 张智英 王建刚 徐坤 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期716-726,共11页
在哺乳动物细胞中,利用同源引导修复(homology-directed repair,HDR)机制的基因编辑策略能够实现精准的点编辑和敲入,但是HDR的低效性严重制约了该策略在精准医疗和分子设计育种中的应用。鉴于HDR机制所需的供体DNA模板不能自主募集到... 在哺乳动物细胞中,利用同源引导修复(homology-directed repair,HDR)机制的基因编辑策略能够实现精准的点编辑和敲入,但是HDR的低效性严重制约了该策略在精准医疗和分子设计育种中的应用。鉴于HDR机制所需的供体DNA模板不能自主募集到基因组双链断裂(double-stranded break,DSB)处,本课题组提出了供体适配系统(donor adapting system,DAS)的概念并开发出CRISPR/SpCas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统。由于SpCas9蛋白分子较大,与Gal4BD适配器结合不利于表达、病毒载体包装及活体递送等过程,因此本研究进一步采用两种小型化Cas蛋白——路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)源SlugCas9变体SlugCas9-HF与氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.)源AsCas12a,开发了新型的CRISPR/Gal4BD-SlugCas9和CRISPR/Gal4BD-AsCas12a供体适配基因编辑系统。通过SSA活性报告实验初步证明了Gal4BD与SlugCas9、AsCas12a N-端融合对其打靶活性影响较小。通过HDR效率报告实验进行功能验证并优化供体设计方案,结果表明:对于CRISPR/Gal4BD-AsCas12a DAS,适配器结合序列(binding sequence,BS)与供体5′-端融合(BS-dsDNA)效果较好;对于CRISPR/Gal4BD-SlugCas9 DAS,则BS与供体3′-端融合(dsDNA-BS)较佳。最终,利用CRISPR/Gal4BD-SlugCas9 DAS对HEK293T细胞中的EMX1、NUDT5、AAVS1三个基因位点分别实现了24%、37%、31%的精准编辑,相比对照组得到了显著提高。本研究为供体适配基因编辑系统的进一步优化提供了参考和借鉴,为后续动物分子设计育种应用研究提供了新的基因编辑工具。 展开更多
关键词 基因编辑 同源引导修复 供体适配 小型化Cas蛋白 适配器
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