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鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及遗传进化分析
1
作者 安乐乐 刘倩芸 +2 位作者 蓝秋菊 罗迅 赵永清 《江西农业大学学报》 北大核心 2025年第1期167-177,共11页
【目的】鸽腺病毒感染在全球鸽群中广泛分布,可引起多种临床症状,如呕吐、腹泻、肝脏损伤等,严重影响鸽的健康与养殖效益。建立一种快速高效检测鸽腺病毒Ⅰ型(PiAdV-Ⅰ)TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,为鸽腺病毒Ⅰ型临床检测及流行病... 【目的】鸽腺病毒感染在全球鸽群中广泛分布,可引起多种临床症状,如呕吐、腹泻、肝脏损伤等,严重影响鸽的健康与养殖效益。建立一种快速高效检测鸽腺病毒Ⅰ型(PiAdV-Ⅰ)TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,为鸽腺病毒Ⅰ型临床检测及流行病学调查提供技术平台。【方法】依据GenBank公布鸽腺病毒Ⅰ型Hexon基因保守区设计引物探针并构建重组质粒pCE2-TA-PiAdV-Ⅰ;优化反应体系和程序,绘制标准曲线、特异性、敏感性和重复性评价,建立鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法;扩增测序阳性临床样品的Hexon基因,使用MEGA5.0进行进化树构建及同源性分析。【结果】该TaqMan探针实时荧光定量PCR方法标准曲线y=-3.1081x+37.374,线性相关系数R2为0.9977,线性关系良好;与鸽疱疹病毒、鸽圆环病毒等鸽子其他常见病毒无交叉反应,具有良好的特异性;最低检测拷贝数为14.6 copies/μL,敏感性是常规PCR方法的10倍,具有高敏感性;组内和组间变异系数均低于1.1%,重复性好。通过检测112份鸽子病料样品,该TaqMan探针实时荧光定量PCR方法检测阳性率为69.64%(78/112),并且高于常规PCR方法阳性检出率65.18%(73/112)。此外,建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法与常规PCR方法的阳性符合率为100%,总体符合率为95.54%。3条测序毒株与Ⅰ型鸽腺病毒参考毒株同源性为99.47%~99.71%,遗传关系高度接近,表明可能由同一个原始毒株进化而来。【结论】研究建立的鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法线性关系良好、特异性强、敏感性高及重复性好,可快速高效检测出临床样品中的PiAdV-Ⅰ。此外,所扩增序列能够用于分析临床毒株遗传进化特征,有助于快速准确诊断鸽腺病毒感染及疫苗研发提供参考依据。 展开更多
关键词 鸽腺病毒Ⅰ型 Hexon基因 TaqMan探针实时荧光定量pcr 遗传进化分析 临床检测 流行病学调查
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猪FoxP3、IL-10双重实时荧光定量PCR方法建立及应用
2
作者 王艳萍 徐倩倩 +5 位作者 孟卫芹 王金良 魏凤 董林 刘吉山 谢金文 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2025年第1期66-73,共8页
旨在建立双重实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,对叉头框蛋白P3(FoxP3)、白细胞介素10(IL-10)的RNA转录进行定量检测。设计并合成FoxP3、IL-10的扩增引物和荧光探针,优化引物浓度、退火温度,建立RT-qPCR方法,检测猪圆环病毒2型(PCV2)感染... 旨在建立双重实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,对叉头框蛋白P3(FoxP3)、白细胞介素10(IL-10)的RNA转录进行定量检测。设计并合成FoxP3、IL-10的扩增引物和荧光探针,优化引物浓度、退火温度,建立RT-qPCR方法,检测猪圆环病毒2型(PCV2)感染外周血调节性T淋巴细胞(Treg)和免疫器官中FoxP3和IL-10的mRNA含量;根据Western blot检测蛋白表达验证方法的可靠性。结果:建立的RT-qPCR方法呈现“S”型扩增曲线,相关系数R^(2)≥0.99;转化生长因子-β(TGF-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素17(IL-17)等基因的核酸模板和阴性对照均无扩增曲线,最低检测浓度10 copies/μL,批内、批间变异系数分别为0.87%、1.84%;PCV2攻毒组外周血Treg细胞中FoxP3和IL-10的mRNA含量均出现明显升高,FoxP3的mRNA含量在攻毒第14天到达峰值,IL-10的mRNA含量在攻毒第10天到达峰值,PCV2感染后导致胸腺、淋巴结和脾脏中FoxP3和IL-10转录水平升高;Western blot检测表明,FoxP3蛋白表达量在攻毒第14天、第28天,IL-10在攻毒第10天和第14天显著高于对照组,与RT-qPCR结果一致。综上,本研究建立的猪FoxP3、IL-10双重RT-qPCR方法具有特异、敏感、检测稳定可靠的特点,对于评价猪体的免疫应答水平和机体免疫稳态具有重要意义。 展开更多
关键词 FOXP3 IL-10 实时荧光定量pcr Treg活化 免疫负调控
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犬冠状病毒和犬细小病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立
3
作者 宫英杰 扈富哥 +4 位作者 王蕾 毕振威 钱晶 王建发 谭业平 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2025年第1期74-78,共5页
旨在建立犬冠状病毒(CCoV)和犬细小病毒(CPV)双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。针对CCoV的3′UTR与CPV的VP2设计引物与探针,通过对反应体系与条件进行优化,建立了CCoV与CPV的双重荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性、重... 旨在建立犬冠状病毒(CCoV)和犬细小病毒(CPV)双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。针对CCoV的3′UTR与CPV的VP2设计引物与探针,通过对反应体系与条件进行优化,建立了CCoV与CPV的双重荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性、重复性验证与临床样品检验。结果:CCoV与CPV阳性参考质粒浓度在10^(2)~10^(7) copies/μL,CCoV与CPV的标准曲线R^(2)分别为0.999与0.996,线性关系良好,CCoV与CPV的最低检测限均为5 copies/μL,与其他病原无交叉反应,组内与组间的变异系数均小于1.38%,说明该方法灵敏度高、特异性强、重复性良好;对113份临床样本进行检测,与普通PCR比较,该方法对CCoV和CPV的检出率较高,分别为37.2%和40.7%。研究表明,本试验建立的CCoV和CPV双重荧光定量PCR方法检测效果良好,为相关疾病的临床诊断、流行病调查等提供了有力工具。 展开更多
关键词 犬冠状病毒 犬细小病毒 双重实时荧光定量pcr TAqMAN探针
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牦牛源牛肠道病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
4
作者 林伟山 韩元 +5 位作者 马豆豆 李春花 童生林 李秀萍 雷萌桐 王光华 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2025年第1期123-128,共6页
为了快速、准确地检测牦牛源牛肠道病毒(Bovine enterovirus,BEV),试验根据GenBank中牦牛源BEV-NH2株3D基因序列(登录号为PP746571)设计可用于检测青海牦牛源BEV的实时荧光定量PCR特异性引物,通过构建标准质粒和绘制标准曲线建立牦牛源... 为了快速、准确地检测牦牛源牛肠道病毒(Bovine enterovirus,BEV),试验根据GenBank中牦牛源BEV-NH2株3D基因序列(登录号为PP746571)设计可用于检测青海牦牛源BEV的实时荧光定量PCR特异性引物,通过构建标准质粒和绘制标准曲线建立牦牛源BEV实时荧光定量PCR检测方法,对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,并分别应用该方法及普通RT-PCR方法对青海省海北地区6个牦牛繁育基地的286份腹泻牦牛粪便样品进行检测,计算两种方法的符合率。结果表明:建立的牦牛源BEV实时荧光定量PCR检测方法扩增产物的熔解曲线单一,Tm值在85.6~85.8℃之间,无引物二聚体和非特异性扩增;质粒浓度在3×10^(2)~3×10^(8)copies/μL范围内时标准曲线的线性关系良好,Ct值在10.88~29.63之间,回归方程为y=-3.16x+38.01,R^(2)=0.9964;仅可检测到牦牛源BEV-NH2株,检测不到牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)MY01株、牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)MY20株和牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BcoV)QL21株;对牦牛源BEV的最低检测限为3×10^(2)copies/μL;当模板浓度为3×10^(2)copies/μL、3×10^(3)copies/μL和3×10^(7)copies/μL时,Ct值的变异系数分别为1.28%、1.74%和0.15%,均在1.80%以下。286份牦牛粪便样品中,采用建立的实时荧光定量PCR检测方法检出BEV阳性样品182份,阳性率为63.64%;采用普通RT-PCR方法检出BEV阳性样品114份,阳性率为39.86%;两种方法的符合率为76.22%。说明本研究建立的牦牛源BEV实时荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于牦牛腹泻临床样本的BEV检测。 展开更多
关键词 牦牛 牛肠道病毒 3D基因 腹泻 检测方法 实时荧光定量pcr
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实时荧光定量PCR检测AML-M2患者骨髓中WT1基因表达水平及临床意义
5
作者 齐松青 刘洋 +2 位作者 朱洁 张振南 王新有 《临床医学研究与实践》 2025年第8期1-4,共4页
目的探讨实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测急性粒细胞白血病部分分化型(AML-M2)患者骨髓中的WT1基因表达水平及临床意义。方法采用qRT-PCR检测67例AML-M2患者及30名健康者骨髓样本中的WT1基因表达水平。根据AML1-ETO融合基因状态将AML-M2... 目的探讨实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测急性粒细胞白血病部分分化型(AML-M2)患者骨髓中的WT1基因表达水平及临床意义。方法采用qRT-PCR检测67例AML-M2患者及30名健康者骨髓样本中的WT1基因表达水平。根据AML1-ETO融合基因状态将AML-M2患者分为AML1-ETO阳性组和阴性组,比较两组的WT1基因表达水平及AML1-ETO与WT1基因检测的诊断价值。将AML1-ETO阴性患者按WT1基因表达水平分为低表达组和高表达组,分析其与原始细胞比例、完全缓解(CR)、无事件生存时间(EFS)及总生存时间(OS)的关系。结果AML-M2患者的WT1基因中位表达水平高于健康者(P=0.000)。AML1-ETO阳性组中AML1-ETO基因检测和WT1基因检测的曲线下面积(AUC)无显著差异(P>0.05)。WT1基因低表达组和WT1基因高表达组的原始细胞比例有显著差异(P=0.000);Spearman相关性分析结果显示,WT1基因表达水平与原始细胞比例呈正相关(P=0.000);9例AML1-ETO阴性的AML-M2患者的WT1基因表达水平与原始细胞比例呈正相关(P<0.05)。WT1基因低表达组的OS短于WT1基因高表达组(P=0.031)。结论骨髓中WT1基因表达水平对AML-M2患者的诊断、治疗及预后评估具有重要临床意义。 展开更多
关键词 实时荧光定量pcr WT1基因 ETO基因 急性粒细胞白血病部分分化型
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猫传染性腹膜炎病毒SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法的建立与临床应用
6
作者 李星颖 谢梓民 +11 位作者 原耀贤 孙铭澮 江文康 赵明明 何诗 何静 赖健仪 白银山 陈胜锋 陈志胜 马骏 王丙云 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第3期44-49,共6页
为了提高猫传染性腹膜炎(FIP)的临床检出率,本试验根据猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)M基因设计特异性引物,将扩增的目的基因连接到p MD19-T载体上,获得重组质粒并作为标准阳性模板,建立针对FIPV的SYBR Green实时荧光定量PCR(q PCR)检测方法... 为了提高猫传染性腹膜炎(FIP)的临床检出率,本试验根据猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)M基因设计特异性引物,将扩增的目的基因连接到p MD19-T载体上,获得重组质粒并作为标准阳性模板,建立针对FIPV的SYBR Green实时荧光定量PCR(q PCR)检测方法,并对其特异性、敏感性、重复性和临床检出率进行验证。结果显示,本方法梯度稀释的标准品与Ct值呈良好的线性关系,R^(2)=0.999 9,扩增效率为92.4%;与其他猫常见病毒未发生交叉反应;最低检测限为3.48×10^(2) copies/μL,敏感性是普通PCR检测方法的100倍;该方法重复性好,批内和批间变异系数均小于2.4%;应用该方法对临床阳性样本的检出率为100%,阴性样本检出率为0。结果表明,本试验建立的SYBR Green q PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好、临床检测效果佳,可用于FIPV的临床诊断。 展开更多
关键词 猫传染性腹膜炎病毒 M基因 SYBR Green 实时荧光定量pcr(qpcr)
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槟榔黄化植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：1
7
作者 林兆威 孟秀利 +2 位作者 唐庆华 牛晓庆 宋薇薇 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2024年第6期1120-1126,共7页
槟榔是海南省重要的热带经济作物,由植原体侵染引起的槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,YLD)是当前我国槟榔生产上的一种毁灭性病害。为了建立精准高效的槟榔黄化植原体检测方法,本研究基于槟榔黄化植原体16SrDNA基因,设计并... 槟榔是海南省重要的热带经济作物,由植原体侵染引起的槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,YLD)是当前我国槟榔生产上的一种毁灭性病害。为了建立精准高效的槟榔黄化植原体检测方法,本研究基于槟榔黄化植原体16SrDNA基因,设计并合成特异性引物AMf/AMr和探针AM-Prode,使用该方法进行准确性、敏感性、特异性及重复性测试,并在其他植物的植原体病害进行检测。结果显示:本检测方法能够准确的检测出阳性样品,健康样品无扩增曲线;在敏感性测试中,该检测方法能检测到1.16×10^(1) copies/μL样本浓度水平,其标准曲线方程为y=-3.4185x+43.624,扩增效率为96.12%,相关系数R^(2)=0.9833;在特异性测试中,该检测方法对YLD的检测具有较好的特异性,槟榔、槟榔其他病害病原及其内生菌的基因组对本方法未造成干扰;在重复性测试中,该检测方法对槟榔黄化病的检测具有较好的重复性;并且该检测方法可对苦楝黄化病、细圆藤丛枝病及辣椒黄化病等8种植原体病害进行检测,对植原体的检测具有一定的通用性。本检测方法的建立,有利于为槟榔黄化病的精准诊断、病原监测及媒介昆虫的检测等研究提供可靠的技术手段。 展开更多
关键词 槟榔 槟榔黄化病 植原体 TaqMan实时荧光定量pcr 病害检测
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鸭坦布苏病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立
8
作者 陈平平 嵇辛勤 +5 位作者 阮涌 王晗晗 罗晓宇 安而立 龙丹丹 段志强 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第10期75-80,共6页
为了建立一种有效、快速、准确的鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本试验针对NCBI发布的DTMUV E基因保守序列设计特异性引物和探针,建立qPCR反应体系。通过制备的标准质粒建立标准曲线,评估该方法的特异性... 为了建立一种有效、快速、准确的鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本试验针对NCBI发布的DTMUV E基因保守序列设计特异性引物和探针,建立qPCR反应体系。通过制备的标准质粒建立标准曲线,评估该方法的特异性、敏感性和重复性,并使用该方法对临床样本进行检测。结果显示,所建立的标准曲线相关系数为0.999 5,有良好的线性关系;该方法可特异检测DTMUV;对标准质粒的最低检测限为2.72×10^(2) copies/μL,是普通PCR的100倍;CT值组内变异系数为0.97%~1.32%,组间变异系数为1.24%~1.79%;人工感染DTMUV的20份鸭胚成纤维细胞样本以及12份人工攻毒2 d的雏鸭脾脏组织样本和12份泄殖腔棉拭子样本阳性率为100%(44/44);疑似感染的12份活鸭泄殖腔棉拭子阳性率为25.00%(3/12),14份病死鸭脾脏组织样本阳性率为28.57%(4/14)。结果表明,本试验建立的TaqMan探针qPCR方法有良好的敏感性、准确性和重复性,能特异检测DTMUV,适用于临床快速检测,为DTMUV的分子流行病学调查和临床疾病诊断提供了技术支撑。 展开更多
关键词 鸭坦布苏病毒(DTMUV) TAqMAN探针 实时荧光定量pcr(qpcr)
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类NADC34 PRRSV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立
9
作者 袁丽莉 朱振邦 +5 位作者 刘盼娆 陈南华 李燕华 范娟 陈昌海 李向东 《中国动物传染病学报》 北大核心 2024年第6期81-88,共8页
类NADC34 PRRSV自2018年在我国首次报道以来,流行范围不断扩大,在局部地区已演变为优势毒株。目前尚无针对类NADC34 PRRSV特异性的普通PCR或real-time PCR诊断方法,常规的PRRSV分型与鉴别诊断方法可能导致此类毒株被误诊为类NADC30 PRRS... 类NADC34 PRRSV自2018年在我国首次报道以来,流行范围不断扩大,在局部地区已演变为优势毒株。目前尚无针对类NADC34 PRRSV特异性的普通PCR或real-time PCR诊断方法,常规的PRRSV分型与鉴别诊断方法可能导致此类毒株被误诊为类NADC30 PRRSV。因此,本研究根据类NADC30 PRRSV与类NADC34 PRRSV在Nsp2基因的序列差异,设计特异性引物和探针,建立了类NADC34 PRRSV TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示:本研究建立的方法特异性良好;不同稀释度的阳性标准质粒在2.8×10^(1)~2.8×10^(6)copies/μL具有良好的线性范围,标准曲线R^(2)值为0.997;本方法灵敏度高,检测下限为2.8×10^(1)copies/μL;重复性分析结果显示,批内和批间试验的变异系数CV值均小于2.5%,呈现出良好的重复性。综上,本研究成功建立了快速检测类NADC34 PRRSV的实时荧光定量PCR方法,为开展此类毒株在我国流行状况的调查提供了有力的检测工具。 展开更多
关键词 类NADC34 PRRSV TAqMAN探针 实时荧光定量pcr
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TaqMan实时荧光定量PCR法检测对虾肝肠胞虫(EHP)步骤优化
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作者 李慰欣 陈政思 黄瑜 《安徽农学通报》 2024年第21期32-36,共5页
优化虾肝肠胞虫(EHP)的TaqMan实时荧光定量PCR检测流程,目的是更准确、快速地检测出虾苗,饵料,亲虾体内携带的EHP。本研究采用酚/氯仿抽提法与水生动物病原体核酸提取试剂盒两种DNA提取方法,对等量的病原组织样本进行了对比提取。此外,... 优化虾肝肠胞虫(EHP)的TaqMan实时荧光定量PCR检测流程,目的是更准确、快速地检测出虾苗,饵料,亲虾体内携带的EHP。本研究采用酚/氯仿抽提法与水生动物病原体核酸提取试剂盒两种DNA提取方法,对等量的病原组织样本进行了对比提取。此外,还设置不同浓度的裂解液以探究其对病原组织裂解效果的影响,并设定不同裂解时间以优化裂解步骤。最后,通过调整qPCR反应的循环数,确定最佳的检测条件。结果显示,水生动物病原体试剂盒提取的DNA检出率高于酚/氯仿抽提法提取,裂解液浓度90%时检测出的EHP含量最高;裂解时间30 min时检测出的EHP含量较高;循环数在40次时足以检测出EHP。综上,优化后的检测流程为用水生动物病原体核酸提取试剂盒提取病原组织DNA,裂解液浓度90%,裂解时间30 min及qPCR检测条件的循环数控制在40次。 展开更多
关键词 虾肝肠胞虫 DNA提取 条件优化 TaqMan实时荧光定量pcr
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B型禽偏肺病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立及应用
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作者 沈海强 车艳杰 +3 位作者 宋新宇 高冉 付旭彬 金天明 《中国家禽》 北大核心 2024年第9期121-127,共7页
试验旨在开发一种特异性检测B亚型禽偏肺病毒(aMPV-B)的方法。研究参照GenBank中的aMPV-G基因序列设计一对特异性引物,建立aMPV-B TaqMan荧光定量PCR方法,优化该方法的反应条件,建立标准曲线,进行特异性、重复性和敏感性试验,并将该方... 试验旨在开发一种特异性检测B亚型禽偏肺病毒(aMPV-B)的方法。研究参照GenBank中的aMPV-G基因序列设计一对特异性引物,建立aMPV-B TaqMan荧光定量PCR方法,优化该方法的反应条件,建立标准曲线,进行特异性、重复性和敏感性试验,并将该方法用于临床样品的检测。结果显示:建立的TaqMan荧光定量PCR方法只能检测出B亚型aMPV,其敏感性能达到1.34×10^(1) copies/µL,斜率为-3.346,截距为40.01,相关系数(R2)为1.00,循环阈值(Ct)与模板拷贝数之间呈现良好的相关性;临床样品检测结果显示,该方法检测出18份样品阳性,而普通PCR仅检测出10份阳性。综上所述,建立的aMPV-B TaqMan荧光定量PCR方法在样品检测中表现出良好的特异性和较高的敏感性,适用于临床样品的aMPV-B检测。 展开更多
关键词 B型禽偏肺病毒 G基因 实时荧光定量pcr TapMan荧光探针
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布鲁氏菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步评价
12
作者 常秀琴 郝梦 +4 位作者 雷振华 杨丹 海晓梅 李静 徐珂 《国际检验医学杂志》 CAS 2024年第11期1399-1403,共5页
目的建立快速、准确检测布鲁氏菌感染的TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。方法利用布鲁氏菌IS711基因序列设计特异性引物和探针,并对该方法的特异性、灵敏度及重复性进行评价。结果所建立的检测方法可对布鲁氏菌基因组进行特异性检... 目的建立快速、准确检测布鲁氏菌感染的TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。方法利用布鲁氏菌IS711基因序列设计特异性引物和探针,并对该方法的特异性、灵敏度及重复性进行评价。结果所建立的检测方法可对布鲁氏菌基因组进行特异性检测,对其他细菌无特异性扩增曲线。该检测方法基因拷贝数的检出限为3.8 copy/μL。批内变异系数在0.20%~2.01%,批间变异系数在0.71%~2.57%,具有较高的可重复性。采用qPCR检测临床标本,其灵敏度明显高于血培养检测,可对患者做出准确、及时的诊断。结论该实验建立的TaqMan qPCR检测方法能有效、快速准确地检测布鲁氏菌感染。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 TAqMAN探针 实时荧光定量pcr IS711
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鉴别猪伪狂犬病病毒gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立
13
作者 李倩倩 黄英 +7 位作者 陈翔鸿 宋文博 杨柳 龙云志 余道兵 梁巩 黄超 汤细彪 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第10期68-74,共7页
为建立一种鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,本试验依据PRV HB-98株和HB2000株的gE和gI基因缺失片段设计特异性引物和探针,优化反应体系,绘制标准曲线,进行特异性试验和敏感性... 为建立一种鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,本试验依据PRV HB-98株和HB2000株的gE和gI基因缺失片段设计特异性引物和探针,优化反应体系,绘制标准曲线,进行特异性试验和敏感性试验,对临床样本和疫苗样本进行检测,并与商品化试剂盒的检测结果进行对比。结果显示,本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线R^(2)为0.9971;该方法特异性强,能区分PRV与其他常见的猪病原体;敏感性高,最低检测限为10 copies/μL;对临床样本的检测结果与商品化试剂盒的检测结果一致;能够区分PRV gI/gE基因部分缺失的疫苗株和野毒株。结果表明,本试验建立了一种特异性强、灵敏度高、适用范围广的鉴别诊断PRV gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病病毒(PRV) gI/gE基因部分缺失疫苗株 鉴别诊断 TaqMan实时荧光定量pcr
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绿豆象实时荧光定量PCR内参基因的筛选 被引量：1
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作者 张敏 李子鹏 +2 位作者 赵欣然 张仙红 郑海霞 《环境昆虫学报》 CSCD 北大核心 2024年第1期174-183,共10页
绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献... 绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性。结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异。不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的基因表达研究中取得更为可靠、准确的数据。 展开更多
关键词 绿豆象 实时荧光定量pcr 内参基因 不同发育阶段 组织 基因稳定表达
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马铃薯病毒病实时荧光定量PCR检测技术
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作者 杨茹薇 刘易 +2 位作者 古丽米拉·热合木土拉 孙慧 江应红 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期2484-2490,共7页
【目的】鉴定马铃薯主要病毒病病原,为马铃薯病毒病的科学防治提供科学依据。【方法】根据Gen-Bank数据库注册序列设计马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV... 【目的】鉴定马铃薯主要病毒病病原,为马铃薯病毒病的科学防治提供科学依据。【方法】根据Gen-Bank数据库注册序列设计马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)的检测引物,完成引物浓度及系统优化。【结果】建立3种马铃薯病毒病的实时荧光定量PCR检测技术体系(real-time fluorescent quantitative RT-PCR,RT-qPCR),其标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为99.42%以上,扩增效率均为84.48%以上,可快速、准确检测出3种马铃薯病毒。【结论】实时荧光定量PCR检测技术是一种高灵敏度、特异性强的检测方法,可实时监测马铃薯生产中病毒病的感染情况。 展开更多
关键词 马铃薯 病毒病 实时荧光定量pcr
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鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用
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作者 张玉霞 董雯雯 +2 位作者 袁小远 孟凯 徐怀英 《山东农业科学》 北大核心 2024年第6期128-132,共5页
鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基... 鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。 展开更多
关键词 鸡喉气管炎病毒 TK基因 实时荧光定量pcr 特异性 敏感性 重复性
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低温弱光胁迫下茄子幼苗实时荧光定量PCR内参基因的筛选与评价
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作者 林珲 裘波音 +1 位作者 朱海生 温庆放 《福建农业科技》 CAS 2024年第8期1-15,共15页
为了探索茄子Solanum melongena L.的基因表达模式,利用qRT-PCR方法分析了茄子ACT、EF1α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20和CysPro 20个候选内参基因mRNA的表达差... 为了探索茄子Solanum melongena L.的基因表达模式,利用qRT-PCR方法分析了茄子ACT、EF1α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20和CysPro 20个候选内参基因mRNA的表达差异情况,并运用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3种计算方法评价茄子20个候选内参基因在低温、弱光、低温弱光叶片样品中的表达稳定性。结果表明:茄子20个候选内参基因荧光定量引物扩增效率(E)数值在96.8%~117.6%,相关系数(R^(2))介于0.9688~0.9999,扩增效率良好,扩增反应具有高度的专一性,引物能特异性扩增,特异性好,均为单峰,样品间扩增曲线重复性强,可用于qRT-PCR扩增。茄子20个候选内参基因C_(T)值表达丰度分析,发现茄子20个候选内参基因平均CT值在19.76~31.20。3种计算方法的综合评价分析结果显示,TBP基因在所有样本中为最稳定的内参基因。研究可为茄子低温、弱光和低温弱光胁迫下基因特异性表达研究提供了合适的内参基因。 展开更多
关键词 茄子 内参基因 实时荧光定量pcr 标准化 基因表达
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在生物科学综合实验引入实时荧光定量PCR技术
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作者 陈笑霞 黄盛丰 +3 位作者 冯惠雄 吴映霞 孙彩云 张雁 《实验室科学》 2024年第5期46-49,共4页
实时荧光定量PCR技术是核酸定量分析的重要方法,是分子生物学领域的前沿技术,广泛应用于基础生物学研究、肿瘤诊断、病毒检测和食品检测等领域。在“生物科学综合实验”课程中引入此项技术,丰富了课程内容,也提高了课程的挑战度。经过... 实时荧光定量PCR技术是核酸定量分析的重要方法,是分子生物学领域的前沿技术,广泛应用于基础生物学研究、肿瘤诊断、病毒检测和食品检测等领域。在“生物科学综合实验”课程中引入此项技术,丰富了课程内容,也提高了课程的挑战度。经过教学实践,取得了良好的效果。学生不仅掌握了扎实的实践技能和前沿的科研方法,还提高了数据分析与处理的能力。 展开更多
关键词 实时荧光定量pcr技术 生物科学综合实验 综合实验教学
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荧光定量PCR在石蜡标本中检测新型隐球菌的应用价值
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作者 金晓燕 邹珏 +3 位作者 张倩倩 董燕 胡慧娣 沈丽华 《临床肺科杂志》 2025年第3期366-370,共5页
目的探索实时荧光定量逆转录PCR法(Reverse-transcription quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)在石蜡包埋肺组织中检出新型隐球菌的应用价值。方法采用传统染色方法(HE染色、六胺银染色、PAS染色)和RT-qPCR法... 目的探索实时荧光定量逆转录PCR法(Reverse-transcription quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)在石蜡包埋肺组织中检出新型隐球菌的应用价值。方法采用传统染色方法(HE染色、六胺银染色、PAS染色)和RT-qPCR法对我院30例疑似新型隐球菌病病例进行检测,记录检测结果,用Kappa法进行一致性分析。结果四种方法都可以检出新型隐球菌,RT-qPCR法敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和确诊率(96.2%/100.0%/100.0%/80.0%/96.7%)均高于传统染色方法,HE染色(34.6%/75.0%/90.0%/15.0%/40.0%)、六胺银染色法(88.4%/50.0%/92.0%/40.0%/83.3%)和PAS染色法(80.7%/50.0%/91.3%/28.6%/76.7%),且与临床最终确诊的结果一致性较好(Kappa=0.870),而传统染色方法Kappa值均小于0.4。结论RT-qPCR法检测肺组织石蜡标本中新型隐球菌的敏感度高、特异度好,有望成为新型隐球菌快捷、稳定的检测手段之一。 展开更多
关键词 实时荧光定量逆转录pcr 新型隐球菌 石蜡包埋肺组织
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猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法建立及应用 被引量：4
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作者 刘莹 李峰 +3 位作者 殷宗俊 王敬茹 李书光 郑先瑞 《动物医学进展》 北大核心 2024年第6期34-38,共5页
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方... 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,最适引物浓度为10μmol/L,探针浓度为5μmol/L,以浓度为1×10^(2)~1×10^(6)copies/μL的标准品构建标准曲线相关系数为0.998,扩增效率可达96%。该方法能特异地检测猪肺炎支原体,与其他动物支原体及猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等病原无交叉反应;灵敏度是常规PCR的10倍,可达到10拷贝;该方法重复性较好,组内和组间变异系数均小于2%。在对30份临床样本的检测中,建立的实时荧光定量PCR检出率为63%(19/30),而常规PCR的检出率仅有30%(9/30)。结果表明,成功建立了猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法,可用于猪肺炎支原体的病原学检测和流行病学调查。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 Taq Man探针 实时荧光定量pcr
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