Vasohibin-2慢病毒过表达载体的构建及相关增殖功能研究 被引量：1

1

作者 孙杰 涂敏 +2 位作者 卫积书 高文涛 苗毅 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期732-737,共6页

目的:构建Vasohibin-2(VASH2)慢病毒过表达载体,获得稳定表达的肝癌细胞株HepG2,并观察其对HepG2增殖的影响。方法:通过逆转录、PCR技术从细胞总RNA中获得VASH2目的基因,引入NheⅠ和PstⅠ酶切位点,连接到pTA2 vector中,经NheⅠ和PstⅠ... 目的:构建Vasohibin-2(VASH2)慢病毒过表达载体,获得稳定表达的肝癌细胞株HepG2,并观察其对HepG2增殖的影响。方法:通过逆转录、PCR技术从细胞总RNA中获得VASH2目的基因,引入NheⅠ和PstⅠ酶切位点,连接到pTA2 vector中,经NheⅠ和PstⅠ双酶切后再连接到Lv-CMV-EGFP vector中,并对重组后的质粒进行双酶切和测序分析;VASH2过表达载体、pVSV-G及delta8.91 3个质粒共转染293T细胞,获得慢病毒感染肝癌细胞株HepG2,经流式细胞仪分选阳性细胞;提取细胞总RNA和总蛋白,利用real-time PCR和Western blot鉴定稳转细胞株中VASH2的表达,用MTT法和细胞周期法检测各组HepG2的增殖能力。结果:成功构建VASH2慢病毒过表达载体,感染肝癌细胞株HepG2后能够稳定高表达VASH2;稳定高表达VASH2的HepG2增殖能力明显增强(P<0.05)。结论:成功构建了VASH2慢病毒过表达载体,并发现VASH2可以促进HepG2的增殖能力,这为进一步研究VASH2在肝癌中的功能及作用机制奠定了基础。 展开更多

关键词 Vasohibin-2 慢病毒过表达载体 细胞增殖

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PRDM5过表达慢病毒载体的构建及稳定转染Neuro-2a细胞的建立

2

作者 吴钊淳 李友 +2 位作者 何嘉文 廖科棋 李胜男 《吉林大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第1期1-8,共8页

目的:构建PR锌指区域蛋白(PRDM)5基因的过表达慢病毒载体,建立稳定转染的小鼠神经瘤母细胞Neuro-2a,为探讨PRDM5在缺血性脑卒中(IS)发病机制中的作用奠定基础。方方法法:在NCBI上搜索PRDM5的序列并设计引物,PCR法扩增获取PRDM5基因序列... 目的:构建PR锌指区域蛋白(PRDM)5基因的过表达慢病毒载体,建立稳定转染的小鼠神经瘤母细胞Neuro-2a,为探讨PRDM5在缺血性脑卒中(IS)发病机制中的作用奠定基础。方方法法:在NCBI上搜索PRDM5的序列并设计引物,PCR法扩增获取PRDM5基因序列,将其与Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶双酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-PRDM5过表达重组质粒,采用PCR法筛选并鉴定出的与目的基因片段长度相近的阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序正确的GV492-control质粒和GV492-PRDM5过表达重组质粒分别转染至人胚胎肾细胞HEK293T中,转染48 h后离心收集慢病毒,分别为GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒,采用慢病毒滴度测定法检测上述2种慢病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-control组和GV492-PRDM5组,分别使用GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后使用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))对成功感染GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的Neuro-2a细胞进行筛选,通过荧光显微镜观察GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态及绿色荧光蛋白的表达情况。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平;Western blotting法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平。结果:PCR法,GV492-PRDM5重组质粒阳性转化子的长度约为684 bp,GV492-PRDM5过表达重组质粒基因序列与设计合成的PRDM5过表达序列一致;GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的滴度均为2.5×108 TU·mL^(-1)。荧光显微镜,GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态均良好,且能观察到绿色荧光蛋白的表达。RT-qPCR法,与GV492-control组比较,GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。Western blotting法,GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞在相对分子质量为75000附近出现特异性条带;与GV492-control组比较,GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平升高(P<0.01)。结论:成功构建PRDM5过表达慢病毒载体,建立了稳定转染的GV492-PRDM5-Neuro-2a细胞。 展开更多

关键词 PR锌指区域蛋白 过表达慢病毒载体 稳定表达 Neuro-2a细胞

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MAFA-PDX1过表达慢病毒感染人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的分化 被引量：1

3

作者 邱晓燕 李碧欣 +3 位作者 黎敬弟 范垂钦 马廉 王鸿武 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2024年第7期1000-1006,共7页

背景:干细胞来源胰岛β细胞移植被认为是治疗1型糖尿病的有效手段。人脐带间充质干细胞是理想的细胞来源,但其向胰岛β细胞分化的效率不高。目的:研究MAFA、PDX1修饰促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能。方法:构建MAFA-P... 背景:干细胞来源胰岛β细胞移植被认为是治疗1型糖尿病的有效手段。人脐带间充质干细胞是理想的细胞来源,但其向胰岛β细胞分化的效率不高。目的:研究MAFA、PDX1修饰促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能。方法:构建MAFA-PDX1过表达慢病毒载体,用细胞形态学、RT-qPCR法、双硫腙染色比较3种方案[方案A:单纯慢病毒组;方案B:先药物(尼克酰胺、β-巯基乙醇)诱导再加慢病毒组;方案C:慢病毒和药物诱导同时进行组]诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的效率和潜能。结果与结论:(1)细胞形态学改变:经3种方案诱导后细胞形态均发生了改变,方案B在诱导第11天细胞聚集生长最为明显,出现聚集生长的胰岛样细胞团;(2)RT-qPCR检测胰岛相关基因的表达差异:同一诱导时间点3种方案横向比较,在诱导第5天,方案C的MAFA和PDX1基因表达量最高,方案B的GCG基因表达量最高;在诱导第11天,方案B的MAFA、PDX1基因表达量以及INS和GLUT2基因表达量最高;(3)双硫腙染色鉴定锌离子:3种方案诱导第11天部分细胞被双硫腙染成棕红色,其中方案B中部分小岛状细胞被染成棕红色,颜色较深(阳性表达);(4)结果表明,MAFA和PDX1共过表达可促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化;MAFA-PDX1基因修饰联合药物诱导方案优于单纯基因修饰方案。 展开更多

关键词 脐带间充质干细胞 MAFA PDX1 过表达慢病毒载体 胰岛素分泌细胞 糖尿病 诱导分化

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胞质分裂作用因子4过表达慢病毒载体的构建和稳定转染Neuro-2a细胞的建立

4

作者 李胜男 何嘉文 +1 位作者 廖科棋 李友 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1322-1329,共8页

目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限... 目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶酶切后,将其与酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-DOCK4过表达重组质粒,PCR法鉴定筛选出与目的基因片段长度大小相近的阳性克隆。将GV492-对照质粒和GV492-DOCK4过表达重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-对照组和GV492-DOCK4组,分别采用GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后采用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))筛选出成功感染GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞生长状态及绿色荧光蛋白表达情况;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA和DOCK4蛋白表达水平。结果:PCR检测,GV492-DOCK4过表达重组质粒的基因片段长度约为691 bp,测序结果显示GV492-DOCK4过表达重组质粒基因序列与设计合成的DOCK4过表达序列一致;GV492-对照组和GV492-DOCK4过表达组慢病毒的滴度分别为2.5×10^(8) TU·mL^(-1)和2.5×10^(8) TU·mL^(-1);荧光显微镜观察,各组Neuro-2a细胞生长状态良好且存在绿色荧光蛋白表达;RT-qPCR法检测,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);Western blotting法检测,各组细胞在相对分子质量225000附近出现特异性条带,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:本研究成功构建DOCK4过表达慢病毒载体,建立了稳定过表达DOCK4的Neuro-2a细胞。 展开更多

关键词 胞质分裂作用因子4 过表达慢病毒载体 Neuro-2a细胞 稳定转染 过表达慢病毒

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小鼠miR-125b慢病毒过表达载体构建与鉴定

5

作者 顾玉青 孙杰 +2 位作者 李占军 高文涛 钱祝银 《江苏医药》 CAS 北大核心 2013年第14期1616-1618,F0002,共4页

目的构建小鼠胰腺β细胞NIT-1中miR-125b慢病毒过表达载体。方法从小鼠基因组DNA中用PCR扩增miR-125b的前体序列,经NheⅠ和PstⅠ酶切后连接到Lv-CMV-GFP载体中,并对重组质粒进行双酶切鉴定和测序分析。将miR-125b过表达载体、pVSV-G和de... 目的构建小鼠胰腺β细胞NIT-1中miR-125b慢病毒过表达载体。方法从小鼠基因组DNA中用PCR扩增miR-125b的前体序列,经NheⅠ和PstⅠ酶切后连接到Lv-CMV-GFP载体中,并对重组质粒进行双酶切鉴定和测序分析。将miR-125b过表达载体、pVSV-G和delta8.91质粒共转染293T细胞,收获慢病毒感染NIT-1细胞,流式细胞术分选阳性细胞,RT-PCR鉴定稳转细胞株中miR-125b的表达。结果成功构建了miR-125b慢病毒表达载体,感染小鼠胰腺β细胞NIT-1后能够成功过表达miR-125b。结论成功构建miR-125b慢病毒过表达载体,为进一步研究其功能建立了实验基础。 展开更多

关键词 miR-125b 慢病毒过表达载体 胰腺Β细胞

原文传递

大鼠Tmub1基因过表达慢病毒载体的构建 被引量：3

6

作者 赵晓彪 李光耀 +2 位作者 刘孟刚 范霞 陈平 《重庆医学》 CAS 北大核心 2016年第13期1744-1746,共3页

目的构建Tmubl基因的过表达慢病毒载体（LV—Tmubl），为研究Tmubl蛋白在肝细胞增殖过程中的作用提供实验材料。方法化学合成Tmubl基因序列，用BamHI／AgeI酶切化学合成含有目的基因的质粒及GV287载体，PCR产物连接入线性化表达的载体。... 目的构建Tmubl基因的过表达慢病毒载体（LV—Tmubl），为研究Tmubl蛋白在肝细胞增殖过程中的作用提供实验材料。方法化学合成Tmubl基因序列，用BamHI／AgeI酶切化学合成含有目的基因的质粒及GV287载体，PCR产物连接入线性化表达的载体。PCR鉴定引物，再对PCR鉴定阳性的克隆进行DNA测序和比对分析。使用构建的LV—Tmnbl，转染293T细胞，荧光法检测构建的慢病毒滴度。结果成功构建了LV-Tmubl，并获得相应的病毒，病毒滴度为2×10^8TU／mL。结论LV-Tmubl为进一步研究Tmubl蛋白在肝细胞增殖中的作用提供了实验基础。 展开更多

关键词 Tmub1 基因 过表达慢病毒载体 大鼠

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GJB6基因突变体过表达慢病毒载体的构建及其在HaCaT细胞中的表达 被引量：2

7

作者 姬灿灿 王震英 +5 位作者 燕鹏荣 陈楠 吴静 张永飞 宋亚丽 张莉 《中国麻风皮肤病杂志》 2015年第1期11-14,共4页

目的;明确GJB6目的基因蛋白Cx30在GJB6 3种突变体A88V、G11R和V37E在HaCaT细胞中的表达。方法:构建GJB6基因突变体的慢病毒载体,并转染至HaCaT,应用荧光倒置显微镜检测其表达。结果:突变体中G11R和A88V经过多次转染实验,能够明确观察到H... 目的;明确GJB6目的基因蛋白Cx30在GJB6 3种突变体A88V、G11R和V37E在HaCaT细胞中的表达。方法:构建GJB6基因突变体的慢病毒载体,并转染至HaCaT,应用荧光倒置显微镜检测其表达。结果:突变体中G11R和A88V经过多次转染实验,能够明确观察到HaCaT细胞细胞膜上有Cx30蛋白的荧光表达;而V37E突变型荧光表达极弱或无。结论:3种突变体的Cx30表达量不同,初步推测突变体编码的蛋白质或不能定位于角质形成细胞膜或不能形成功能性的Cx30,从而影响了HaCaT细胞正常的增殖和分化。 展开更多

关键词 Cx30 GJB6基因及其突变体 过表达慢病毒 HACAT细胞

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miR-186过表达慢病毒载体的构建及鉴定 被引量：3

8

作者 李胜男 王梦旭 +3 位作者 胡伟东 陈少凤 陈杏兰 李友 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期997-1002,I0001,共7页

目的:构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞(HEK)293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法:以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin... 目的:构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞(HEK)293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法:以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin的慢病毒载体FV040中,经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切及测序鉴定后获得重组慢病毒载体。利用Lipofectamine2000将重组慢病毒质粒FV040Vector和FV040miR-186分别与辅助质粒通过共转染至HEK293T细胞中,48h后收集慢病毒,以FV040Vector慢病毒作为对照组,FV040miR-186作为实验组,分别感染HEK293T细胞。感染48h后,观察HEK293T细胞中绿色荧光的分布情况,并采用实时荧光定量PCR法检测miR-186的表达水平。结果:测序分析,miR-186过表达慢病毒与GenBank上公布的miR-186序列完全一致。与对照组(0.838 7±0.145 6)比较,实验组HEK293T细胞中miR-186表达水平(12.640 0±0.788 4)明显升高(t=14.72,P<0.01),约为对照组的15.07倍。结论:成功构建miR-186过表达慢病毒载体并包装出慢病毒,miR-186慢病毒成功感染HEK293T细胞,miR-186表达水平在HEK293T细胞中明显升高。 展开更多

关键词 miR-186 慢病毒 HEK293T细胞 过表达慢病毒载体 绿色荧光蛋白

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TAZ诱导性过表达慢病毒载体的构建、鉴定及诱导过表达TAZ神经母细胞瘤细胞株的建立 被引量：1

9

作者 阮红峰 应忠明 罗环 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期1035-1036,共2页

神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见且致死性极高的实体肿瘤之一[1]。由NB所致死亡人数占所有儿童肿瘤死亡总数的15%[2]。分子靶向治疗是近年肿瘤领域研究的热点[3]。TAZ是一个包含WW-domain结构域的转录共激活子,参与多种肿... 神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见且致死性极高的实体肿瘤之一[1]。由NB所致死亡人数占所有儿童肿瘤死亡总数的15%[2]。分子靶向治疗是近年肿瘤领域研究的热点[3]。TAZ是一个包含WW-domain结构域的转录共激活子,参与多种肿瘤细胞的增殖、调控肿瘤转移,并能预测部分肿瘤患者的预后情况[4]。针对Oncomine肿瘤数据库NB肿瘤组织的生物信息学分析发现,TAZ基因在NB肿瘤组织中呈高表达,且随着NB的恶化,表达逐渐升高。而TAZ是否参与NB的形成及恶化尚未完全明确。 展开更多

关键词 TAZ基因 神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 诱导过表达慢病毒载体

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小鼠IFN-γ过表达慢病毒载体对RAW264．7细胞CXCR4表达的调节

10

作者 喻晶 张丹 +2 位作者 许仁帆 石薇 余学锋 《中国保健营养（下半月）》 2010年第10期16-19,共4页

目的观察小鼠IFN-γ过表达慢病毒载体对RAW264．7细胞CXCR4表达的调节。方法小鼠IFN-γ过表达慢病毒载体感染RAW264．7细胞，在荧光显微镜下观察荧光表达情况，使用酶标记免疫吸附测定法（Elisa法）测定细胞上清IFN-γ浓度，使用western... 目的观察小鼠IFN-γ过表达慢病毒载体对RAW264．7细胞CXCR4表达的调节。方法小鼠IFN-γ过表达慢病毒载体感染RAW264．7细胞，在荧光显微镜下观察荧光表达情况，使用酶标记免疫吸附测定法（Elisa法）测定细胞上清IFN-γ浓度，使用westernblot法检测细胞CXCR4表达。结果1．小鼠IFN-γ过表达慢病毒载体能够感染RAW264．7细胞，在感染第6天达到高峰；2．小鼠IFN-γ过表达慢病毒载体感染的RAW264．7细胞比未感染细胞或是阴性对照病毒载体表达的IFN-γ明显升高而CXCR4明显下降。结论小鼠IFN-γ过表达隧病毒载体能够有效感染RAW264．7细胞，并下调其CXCR4的表达。 展开更多

关键词 小鼠IFN-γ过表达慢病毒载体RAW264.7 CXCR4

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IL-10表达对小鼠脾脏CD4+T细胞亚群相关细胞因子的影响 被引量：2

11

作者 李东杰 薛永平 +2 位作者 刘丽媛 陆思敏 程锁利 《宁夏医学杂志》 CAS 2023年第10期878-882,共5页

目的研究应用T细胞特异性慢病毒过表达白细胞介素10(IL-10)或siRNA片段抑制IL-10后对小鼠脾脏CD4+T细胞亚群的影响。方法磁珠分选试剂分离小鼠初始CD4+T细胞,通过IL-10过表达特异性慢病毒侵染CD4+T细胞,应用qRT-PCR检测IFN-γ、IL-4、IL... 目的研究应用T细胞特异性慢病毒过表达白细胞介素10(IL-10)或siRNA片段抑制IL-10后对小鼠脾脏CD4+T细胞亚群的影响。方法磁珠分选试剂分离小鼠初始CD4+T细胞,通过IL-10过表达特异性慢病毒侵染CD4+T细胞,应用qRT-PCR检测IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3的mRNA表达量,应用流式细胞术分别检测IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3在CD4+T细胞中的分泌比率。应用siRNA干扰片段抑制IL-10,应用qRT-PCR检测IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3的mRNA表达量,应用流式细胞术分别检测IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3在CD4+T细胞中的分泌比率。结果过表达IL-10后,IFN-γ、IL-4、IL-17A mRNA水平明显下降(P<0.05),Foxp3 mRNA表达明显上升(P<0.05);IFN-γ、IL-4、IL-17A分泌量均明显降低(P<0.05),Foxp3分泌量明显增高(P<0.05)。IL-10抑制后,IFN-γ和IL-17A mRNA表达明显上升(P<0.05);IFN-γ和IL-17A分泌量均明显升高(P<0.05)。结论过表达IL-10后抑制Th1、Th2、Th17亚群中的IFN-γ、IL-4、IL-17A的表达,对Treg细胞Foxp3的分泌具有促进作用。IL-10抑制能明显促进IFN-γ、IL-17A的表达。 展开更多

关键词 CD4+T细胞 IL-10 慢病毒过表达 SIRNA抑制

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长链非编码RNA(lncRNA)-MSTRG.22610.1对BHV-1体外复制影响的研究

12

作者 姜坤生 王禹淳 +2 位作者 马金柱 于立权 宋佰芬 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期278-284,299,共8页

本研究室前期将牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)感染牛肾细胞(MDBK),通过转录组测序筛选到了转录显著差异的长链非编码RNA-MSTRG.22610.1(lncRNA-MSTRG.22610.1),为了探究其在MDBK中对BHV-1复制的影响,本研究采用CCK-8法筛选对细胞无毒性的聚凝... 本研究室前期将牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)感染牛肾细胞(MDBK),通过转录组测序筛选到了转录显著差异的长链非编码RNA-MSTRG.22610.1(lncRNA-MSTRG.22610.1),为了探究其在MDBK中对BHV-1复制的影响,本研究采用CCK-8法筛选对细胞无毒性的聚凝胺、嘌呤霉素的最佳浓度;将重组慢病毒r ZHLV-U6-Zs Green1-puro-MSTRG.22610.1和r ZHLV-U6-Zs Green1-puro(对照慢病毒)按照不同的MOI分别感染MDBK细胞,48 h后观察荧光,采用Image J软件检测并计算各慢病毒感染细胞后出现绿色荧光细胞的比率,出现绿色荧光细胞的比率达80%的细胞对应的MOI即为最佳MOI。筛选结果显示聚凝胺与嘌呤霉素的最佳工作浓度分别为5μg/mL及3μg/m L,慢病毒感染的最适MOI为80。将r ZHLV-U6-Zs Green1-puro-MSTRG.22610.1和对照慢病毒分别以最佳条件感染MDBK细胞并培养及传代,传至8~10代,每代均观察细胞形态及细胞中的绿色荧光,并通过RT-q PCR检测第6、8、10代细胞中lncRNA-MSTRG.22610.1的转录水平,以构建并鉴定稳定表达lncRNA-MSTRG.22610.1的MDBK细胞系1T及对照细胞系1NC。结果显示,每代1T细胞、1NC细胞的状态均良好并均与阴性对照MDBK细胞的形态无差别,且每代1T及1NC细胞均出现绿色荧光。RT-q PCR结果显示,与1NC及阴性对照细胞相比,1T细胞系中lncRNA-MSTRG.22610.1的转录水平极显著升高(P<0.0001)。表明获得了高水平表达lncRNA-MSTRG.22610.1却不影响细胞增殖的细胞系,且该细胞系的遗传稳定性较强。将BHV-110倍倍比稀释后分别感染传至10代的1T与1NC细胞,24 h后采用Reed-Muench法计算各组细胞中的病毒滴度。结果显示,1T、1NC及MB细胞(感染BHV-1的MDBK细胞)的病毒滴度分别为105.15 TCID50/0.1 m L、104.41TCID50/0.1 m L及104.58 TCID50/0.1 m L。与MB和1NC细胞相比,1T细胞中的病毒滴度显著升高(P<0.05),表明lnc RNA-MSTRG.22610.1表达后促进BHV-1在MDBK细胞中的复制。本研究为进一步探究lncRNA-MSTRG.22610.1促进病毒复制的分子机制及深入了解BHV-1感染的分子机制提供参考依据。 展开更多

关键词 长链非编码RNA 牛肾细胞 牛疱疹病毒I型 慢病毒过表达 病毒增殖

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锌指蛋白146(RNF146)对吡柔比星引起的小鼠睾丸精原细胞DNA损伤的保护作用 被引量：1

13

作者 程建华 杨晓霞 +4 位作者 杨慧莹 关立锋 丁敬宾 丁娟 赵薇 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期945-949,共5页

目的评价锌指蛋白146(RNF146)对化疗药吡柔比星引起的GC-1小鼠睾丸精原细胞DNA损伤的保护作用。方法采用1.0μg/m L吡柔比星处理的方法复制DNA损伤的小鼠GC-1精原细胞模型。构建小鼠rnf146慢病毒过表达载体p CDHrnf146并包装rnf146过表... 目的评价锌指蛋白146(RNF146)对化疗药吡柔比星引起的GC-1小鼠睾丸精原细胞DNA损伤的保护作用。方法采用1.0μg/m L吡柔比星处理的方法复制DNA损伤的小鼠GC-1精原细胞模型。构建小鼠rnf146慢病毒过表达载体p CDHrnf146并包装rnf146过表达慢病毒,感染GC-1细胞上调rnf146的表达,Western blot验证过表达效率。评价RNF146对吡柔比星引起的GC-1细胞增殖抑制、凋亡增多及DNA损伤的保护作用。结果成功构建了p CDH-rnf146重组质粒并包装具有良好感染效率的RNF146过表达慢病毒。溴脱氧尿苷(Brd U)掺入标记显示RNF146能够减轻吡柔比星引起的GC-1增殖抑制。原位末端转移酶标记技术(TUNEL)提示RNF146能够抑制吡柔比星诱导的GC-1细胞凋亡。彗星实验显示RNF146过表达能够有效保护吡柔比星作用下GC-1细胞DNA的完整性。结论 RNF146对化疗药吡柔比星引起的小鼠睾丸精原细胞损伤具有保护作用。 展开更多

关键词 锌指蛋白146(RNF146) 过表达慢病毒 GC-1细胞系 吡柔比星 DNA损伤

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大鼠肝细胞系lncRNA NONRATT021477.2过表达及干扰表达条件优化 被引量：2

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作者 牛春阳 薛琳琳 +7 位作者 詹雪龙 徐晶 邵子益 郭景茹 甄莉 计红 李士泽 杨焕民 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期1560-1565,共6页

试验分别以带有目的基因的重组慢病毒质粒(pSllV-CMV-zsGreen-puro-lncRNA77.2)和3条反义核苷酸质粒转染BRL细胞,根据绿色荧光蛋白(GFP)表达情况评估转染效率;优化过表达慢病毒的最佳感染复数,并通过嘌呤霉素筛选以得到高表达稳转株。... 试验分别以带有目的基因的重组慢病毒质粒(pSllV-CMV-zsGreen-puro-lncRNA77.2)和3条反义核苷酸质粒转染BRL细胞,根据绿色荧光蛋白(GFP)表达情况评估转染效率;优化过表达慢病毒的最佳感染复数,并通过嘌呤霉素筛选以得到高表达稳转株。应用荧光定量PCR方法检测lncRNA NONRATT021477.2的表达量,验证过表达效果及初步确定干扰效率最高的质粒,并进一步优化ASO质粒的转染浓度和时间曲线。结果显示,重组慢病毒以感染复数(MOI)=4转染BRL细胞48 h时,lncRNA NONRATT021477.2表达量比空病毒NC组极显著升高(P<0.01),过表达效果为17倍,成功获得高表达稳转株;并且确定了干扰质粒ASO-2以250 nmol/L浓度转染BRL细胞24 h时,对靶基因水平的干扰效率最高,为78%。本试验建立了lncRNA NONRATT021477.2过表达和干扰表达质粒转染BRL细胞的最佳条件,为后续深入研究lncRNA NONRATT021477.2的生物学功能奠定基础。 展开更多

关键词 lncRNA NONRATT021477.2 慢病毒过表达 ASO干扰 BRL细胞

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过表达PKM2增加卵巢癌细胞的增殖和迁移 被引量：4

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作者 刘芳芳 曾丽 黄俏佳 《医学分子生物学杂志》 CAS 2018年第1期1-7,共7页

目的探究人M2型丙酮酸激酶（pyruvatekinasetypeM2，PKM2）对卵巢癌SKOV3细胞增殖和迁移的影响。方法将PKM2cDNA以XhoI和NotI位点克隆入pLVX—Neo—IRES．ZsGreenlvector慢病毒载体中，得到的重组载体及空载体分别与慢病毒包装质粒psPAX... 目的探究人M2型丙酮酸激酶（pyruvatekinasetypeM2，PKM2）对卵巢癌SKOV3细胞增殖和迁移的影响。方法将PKM2cDNA以XhoI和NotI位点克隆入pLVX—Neo—IRES．ZsGreenlvector慢病毒载体中，得到的重组载体及空载体分别与慢病毒包装质粒psPAX2和pMD2．G共转染入293T包装细胞．以得到PKM2过表达的慢病毒表达载体；将其转导入SKOV3细胞后用G418筛选稳定转染的细胞，分别测定PKM2过表达前后SKOV3细胞的增殖和迁移的改变。结果测序鉴定表明PKM2重组慢病毒表达载体正确无误。Western印迹检测结果显示转导PKM2慢病毒表达载体可增加SKOV3细胞中PKM2的表达。MTT测定和细胞划痕实验结果表明过表达PKM2可增加SKOV3的增殖和迁移。结论PKM2过表达可增加卵巢癌SKOV3细胞的增殖和迁移。 展开更多

关键词 PKM2慢病毒过表达载体 SKOV3卵巢癌细胞 MTY实验 细胞划痕实验

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Etk敲除及过表达细胞株构建并探讨Etk对细胞增殖的影响 被引量：1

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作者 苏宏 李钊 +2 位作者 刘婷婷 陈超飞 王敏 《现代生物医学进展》 CAS 2020年第5期801-807,共7页

目的:利用CRISPR-Cas9技术在人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中构建Etk(Epithelial and endothelial tyrosine kinase)敲除稳定细胞株以及利用慢病毒构建Etk过表达稳定细胞株,并初步探讨Etk基因对HUV... 目的:利用CRISPR-Cas9技术在人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中构建Etk(Epithelial and endothelial tyrosine kinase)敲除稳定细胞株以及利用慢病毒构建Etk过表达稳定细胞株,并初步探讨Etk基因对HUVECs细胞增殖的影响。方法:利用CRISPR-Cas9技术,使用在线工具设计针对Etk的sgRNA (https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/)。将sgRNA利用连接酶整合到病毒载体中,包被病毒并感染HUVECs敲除HUVECs中的内源性Etk。利用嘌呤霉素筛选得到Etk敲除的稳定细胞株。PCR扩增Etk基因序列,将其整合到pLEX-MCS慢病毒过表达载体中构建Etk过表达重组质粒。包被病毒并感染HUVECs,在HUVECs中过表达Etk,利用嘌呤霉素筛选得到Etk过表达的稳定细胞株。利用qRT-PCR和Western-Blotting检测Etk的敲除和过表达情况。利用CCK-8盒子检测两种稳定细胞株细胞增殖情况。结果:利用CRISPR-Cas9技术有效的敲除HUVECs中内源性Etk,同对照相比,Etk的mRNA和蛋白水平显著地降低(P<0.01)。同时利用慢病毒在HUVECs中过表达Etk,同对照相比,在过表达Etk稳定细胞株中Etk的mRNA和蛋白表达显著上调(P<0.01)。CCK-8检测发现,Etk敲除降低细胞增殖能力;而Etk过表达增加细胞增殖能力。结论:通过CRISPR-Cas9技术成功在HUVECs中敲除Etk,利用慢病毒过表达系统成功的在HUVECs中过表达Etk,并且初步验证了Etk促进HUVECs细胞增殖。 展开更多

关键词 Etk CRISPR-Cas9敲除 慢病毒过表达 细胞增殖

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小鼠脂肪间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化研究 被引量：2

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作者 赵天闯 安星兰 +3 位作者 刘阳 唐博 张学明 李子义 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期755-764,共10页

为了通过特定转录因子将小鼠脂肪间充质干细胞(mADSCs)定向诱导分化为胰岛素分泌细胞(IPCs)。本研究分别构建Pdx1(胰十二指肠同源盒基因1)、MafA(V-maf肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A)、NeuroD1(神经分化因子1)3种基因的慢病毒过表达载... 为了通过特定转录因子将小鼠脂肪间充质干细胞(mADSCs)定向诱导分化为胰岛素分泌细胞(IPCs)。本研究分别构建Pdx1(胰十二指肠同源盒基因1)、MafA(V-maf肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A)、NeuroD1(神经分化因子1)3种基因的慢病毒过表达载体,使用293T细胞对3种因子进行慢病毒包装,将3种慢病毒过表达载体以单因子侵染、双因子侵染、三因子联合侵染的方式对mADSCs进行定向分化诱导,于诱导分化第15天对不同方式诱导的IPCs进行检测鉴定,并对不同方式诱导组的IPCs进行高糖刺激,刺激后30~120min检测培养基中含糖量的变化。结果显示,构建的慢病毒过表达载体pHBLV-CMV-IRES-ZsGreen-Pdx1、pHBLV-CMV-PGK-RFPMafA、pHBLV-CMV-PGK-RFP-NeuroD1所含目的片段基因序列与小鼠全基因编码序列完全一致,三种基因慢病毒过表达载体构建成功;诱导分化第15天,三因子联合诱导组所形成的IPCs克隆双硫腙(DTZ)染色呈阳性,并可表达胰岛素生物合成及分泌相关基因;在高糖刺激条件下,三因子联合诱导组糖分解速度、分解量远优于单因子或双因子诱导组。结果表明,Pdx1、MafA、NeuroD1 3种因子联合作用,可以将小鼠脂肪间充质干细胞定向诱导分化为胰岛素分泌细胞,并可在高糖刺激下,有效发挥降糖作用。 展开更多

关键词 脂肪间充质干细胞(ADSCs) 胰岛素分泌细胞(IPCs) 慢病毒过表达载体 诱导分化 小鼠

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