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利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9系统敲减α2δ1对人肝癌细胞系Hep-12干性的影响
1
作者 何琦 赵威 张志谦 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期882-887,共6页
目的通过规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统敲减人肝癌细胞系Hep12中电压依赖性钙离子通道α2δ1的表达,观察α2δ1敲减后对肝癌细胞干性的影响。方法设计3对靶向α2δ1的向导(sgRNA),长度为20 bp,构建到lenti CRI... 目的通过规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统敲减人肝癌细胞系Hep12中电压依赖性钙离子通道α2δ1的表达,观察α2δ1敲减后对肝癌细胞干性的影响。方法设计3对靶向α2δ1的向导(sgRNA),长度为20 bp,构建到lenti CRISPRv2-puro载体上,然后在体外检测sgRNA切割活性,利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒,将包装好的病毒感染Hep-12细胞,2 d后加入嘌呤霉素筛选。利用Western blotting验证α2δ1的敲减效果和干性相关基因的表达。通过成球实验检测其体外自我更新能力的变化。结果测序结果显示,sgRNA成功插入载体质粒;体外切割实验显示,3条sgRNA均有切割活性;Western blotting结果显示,α2δ1基因的表达显著降低,干性相关基因B细胞特异性莫洛尼白血病病毒插入位点1(BMI1)和Nanog的表达显著被抑制;无血清培养基成球实验结果表明,敲减α2δ1导致Hep-12细胞的体外自我更新能力减弱。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建敲除α2δ1基因的Hep-12细胞系;敲除α2δ1基因后能抑制Hep-12细胞肿瘤干细胞样特性。 展开更多
关键词 α2δ1 规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9 肝癌干细胞 基因敲减 自我更新 免疫印迹法 人
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规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9靶向Rho GDIα基因敲除质粒的构建及其对小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6迁移的影响
2
作者 曲明娟 李延敏 +3 位作者 谢静 秦苗苗 王静 周菊华 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期55-59,共5页
目的利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建Rho鸟苷酸解离抑制因子α(GDIα)的基因敲除载体,并探讨干扰Rho GDIα后对小鼠肝癌细胞Hepa 1-6迁移的影响。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计Rho GDIα的向导R... 目的利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建Rho鸟苷酸解离抑制因子α(GDIα)的基因敲除载体,并探讨干扰Rho GDIα后对小鼠肝癌细胞Hepa 1-6迁移的影响。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计Rho GDIα的向导RNA(sgRNA)序列,并与PX458载体相连,构建Rho GDIα基因敲除重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1和PX458-Rho GDIα-sgRNA2;脂质体转染法将重组质粒转染入Hepa 1-6细胞抑制Rho GDIα的基因表达;RT-PCR法检测Rho GDIα被抑制后的mRNA表达情况;划痕法检测Rho GDIα干扰后Hepa 1-6细胞迁移距离的差异;迁移小室法检测抑制Rho GDIα后Hepa 1-6细胞迁移数量的差异。结果成功构建了Rho GDIα的CRISPR/Cas9基因敲除质粒PX458-Rho GDIα-sgRNAs;转染有PX458-Rho GDIα-sgRNA1的Hepa 1-6细胞与对照组只转染空载体PX458的细胞相比,Rho GDIα的表达被明显抑制(P<0.05),而且该组细胞从划痕起始处迁移到空白处距离较远,从迁移小室上端迁移到底端数目明显增多,差异极其显著(P<0.01),说明Rho GDIα被抑制后肝癌细胞的迁移能力提高。结论CRISPR/Cas9法构建的重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1可以有效抑制Rho GDIα的基因表达;Rho GDIα被抑制后明显促进小鼠肝癌细胞Hepa 1-6的迁移,提示在体情况下,Rho GDIα的表达可能起到抑制细胞迁移的重要作用,在肿瘤组织中,可以利用过表达Rho GDIα来抑制肿瘤细胞的转移。 展开更多
关键词 规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9 鸟苷酸解离抑制因子α 向导RNA PX458质粒 肝癌细胞系Hepa 1-6 反转录聚合酶链反应 小鼠
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空肠弯曲菌中规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)的检测与结构分析 被引量：2
3
作者 吴瑜凡 申进玲 +4 位作者 崔思宇 郭旸 吴福平 王翔 邵景东 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2018年第24期139-144,共6页
规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是近年在原核生物中发现的针对噬菌体等外源遗传物质的干扰而进化出的获得性和可遗传性生物免疫系统。因其序列的高度多态性及携带遗传... 规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是近年在原核生物中发现的针对噬菌体等外源遗传物质的干扰而进化出的获得性和可遗传性生物免疫系统。因其序列的高度多态性及携带遗传信息的可追溯性,成为分子分型方法的理想位点。本研究对江苏地区分离的86株空肠弯曲菌基因组进行CRISPR结构的检测和分析。结果表明:36%的菌株基因组含有CRISPR结构,32株含有确定CRISPR结构的菌株均只含有1个CRISPR结构,CRISPR序列长度范围为92～366 bp;重复序列与数据库中出现频率最高的重复序列一致;识别到的间隔序列共111条,共分为17种类型,有10种类型的间隔序列与CRISPR DB数据库中公布的一致,有7种间隔序列为新报道的间隔序列,共55条,占总间隔序列的49.5%。通过同源性比对发现,间隔序列除与来自同属同种的质粒或噬菌体具有同源性外,有些还与其他致病菌的质粒或噬菌体具有同源性,这种现象说明空肠弯曲菌与其他致病菌可能存在基因的水平转移等信息交流方式。另外,通过CRISPR结构间隔序列的多样性,可以将38株空肠弯曲菌野生菌株分为5种不同的谱型。研究结果为空肠弯曲菌利用CRISPR结构进行分型和溯源提供数据基础。 展开更多
关键词 空肠弯曲菌 成簇的规律间隔短回文重复序列(crispr) 重复序列 间隔序列 同源性
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成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术研究进展 被引量：3
4
作者 单琳琳 夏海滨 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第9期856-862,共7页
成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术已成为生物医学领域中研究基因功能及其表达调控的重要手段之一。随着CRISPR技术的拓展,各种基于CRISPR技术的新型研究、诊断和治疗等工具得到进一步的开发,并在新型动物疾... 成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术已成为生物医学领域中研究基因功能及其表达调控的重要手段之一。随着CRISPR技术的拓展,各种基于CRISPR技术的新型研究、诊断和治疗等工具得到进一步的开发,并在新型动物疾病模型的建立、疾病快速诊断、肿瘤及免疫相关性疾病的治疗等方面取得了重大进展和突破。我们重点对CRISPR/CRISPR相关蛋白(Cas)技术的发展现状及其在生物医学领域的应用进展进行综述,并对其未来应用前景和发展方向进行讨论和展望。 展开更多
关键词 成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr) crispr相关蛋白(Cas) 基因编辑 基因诊断 基因治疗 综述
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食源性致病菌耐药性与成簇的规律间隔短回文重复序列系统关联性研究进展 被引量：1
5
作者 金姗姗 王义哲 赵喜红 《食品安全质量检测学报》 CAS 2020年第24期9301-9307,共7页
近年来,随着对抗生素的滥用,食源性致病菌的耐药性问题日趋严重。目前除了从管理上规范抗生素的使用,对规律间隔短回文重复序列系统(clusterd regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与耐药性相关研究也在持续进行。C... 近年来,随着对抗生素的滥用,食源性致病菌的耐药性问题日趋严重。目前除了从管理上规范抗生素的使用,对规律间隔短回文重复序列系统(clusterd regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与耐药性相关研究也在持续进行。CRISPR-Cas作为一种天然免疫机制,因为其独特的免疫作用机理,目前常被用以基因编辑、耐药性等方面研究。本文对CRISPR-Cas系统进行简要介绍,从其结构、原理以及目前的研究趋势对不同菌株间CRISPR系统与耐药性、毒力因素进行相关总结,为防治食源性致病菌引起的食品安全问题提供新思路。 展开更多
关键词 成簇的规律间隔短回文重复序列系统 耐药性 毒力因素 食源性致病菌 食品安全
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成簇的规律间隔的短回文重复序列/成簇的规律间隔的短回文重复序列关联系统在核酸检测中的应用进展
6
作者 李宗祥 王金林 +1 位作者 王佳芮 罗继全 《医疗装备》 2022年第13期187-192,共6页
成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR关联基因(Cas)系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古生菌中的一种后天免疫系统,以消灭外来的质体或者噬菌体,其中CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13系统在核酸检测领域得到... 成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR关联基因(Cas)系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古生菌中的一种后天免疫系统,以消灭外来的质体或者噬菌体,其中CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13系统在核酸检测领域得到应用。该研究简要介绍了CRISPR/Cas系统的分类、作用机制及在核酸检测中的应用。 展开更多
关键词 成簇的规律间隔的短回文重复序列/成簇的规律间隔的短回文重复序列关联系统 核酸检测 应用进展
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规律成簇的间隔短回文重复：结构，功能与应用 被引量：10
7
作者 崔玉军 李艳君 +1 位作者 颜焱锋 杨瑞馥 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期1549-1555,共7页
规律成簇的间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPRs)是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构。最近研究表明,CRISPR与一系列相关蛋白、前导序列一起,为原核生物提供对噬菌体等外源... 规律成簇的间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPRs)是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构。最近研究表明,CRISPR与一系列相关蛋白、前导序列一起,为原核生物提供对噬菌体等外源基因的获得性免疫能力,其作用机制可能与真核生物的RNA干扰过程类似。作为基因组中高度可变的区域,CRISPR非常适合成为研究细菌种内分型和微进化的分子靶标。本文综述了CRISPR系统的结构、功能及其应用概况,并对CRISPR研究的前景进行了展望。 展开更多
关键词 规律成簇的间隔短回文重复 crispr相关基因/蛋白 噬菌体 RNA干扰
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基于CRISPR-Cas系统的病原体核酸检测方法的研究进展
8
作者 臧佳 董泽丰 +2 位作者 雅雪蓉 孙万平 沈强 《临床检验杂志》 2025年第3期197-203,共7页
病原体的快速、准确诊断对感染性疾病的有效控制和治疗至关重要,基于核酸的检测方法因具有高灵敏度、高特异性被广泛应用于实验室检测和临床诊断。目前,定量聚合酶链式反应(qPCR)已成为核酸诊断的金标准,然而,该方法对仪器设备和操作者... 病原体的快速、准确诊断对感染性疾病的有效控制和治疗至关重要,基于核酸的检测方法因具有高灵敏度、高特异性被广泛应用于实验室检测和临床诊断。目前,定量聚合酶链式反应(qPCR)已成为核酸诊断的金标准,然而,该方法对仪器设备和操作者技能要求较高并且容易发生气溶胶污染,不适用于病原体的即时检测。成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)及CRISPR相关蛋白(Cas)系统(简称为CRISPR-Cas)克服了其他核酸检测方法的局限性,为病原体核酸的即时检测提供了新工具。该文从CRISPR-Cas系统的组成及作用机制、基于不同类别Cas蛋白的检测方法以及检测方法的发展趋势3个方面对基于CRISPR-Cas系统的病原体核酸检测方法进行总结,旨在为进一步提升上述方法的可操作性以及开发更多新的检测方法提供思路。 展开更多
关键词 感染性疾病 核酸检测 成簇规律间隔短回文重复序列及crispr相关蛋白系统 检测方法
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成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9基因编辑技术在抗乙型肝炎病毒感染治疗中的应用 被引量：1
9
作者 王亚东 梁乾飞 +1 位作者 李子月 赵彩彦 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第11期860-864,共5页
缺乏有效根除乙型肝炎病毒（HBV）的药物及技术手段是限制HBV感染无法治愈的瓶颈。成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9系统是近年来新兴的对特定基因位点进行编辑的技术，可以特异性靶向HBV共价闭合环状DNA，有效抑制HBV DNA复... 缺乏有效根除乙型肝炎病毒（HBV）的药物及技术手段是限制HBV感染无法治愈的瓶颈。成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9系统是近年来新兴的对特定基因位点进行编辑的技术，可以特异性靶向HBV共价闭合环状DNA，有效抑制HBV DNA复制、调控HBV功能蛋白表达，有望成为彻底根除HBV的强有力基因治疗工具。如何利用成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9系统实现对HBV基因组高效靶向修饰，从而达到根治HBV感染的目的已经成为当前国内外学者关注的焦点。现结合国内外最新研究成果，重点总结成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9基因编辑技术在抗HBV感染治疗中应用的最新进展，阐述其作为彻底根治HBV感染方案的潜在可能和挑战。 展开更多
关键词 肝炎病毒 乙型 基因编辑 共价闭合环状DNA 成簇的规律间隔短回文重 复序列及其相关蛋白9
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基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的建立 被引量：1
10
作者 王俊文 田原 +7 位作者 范子豪 徐玲 高耀 曹亚玲 潘桢桢 张向颖 宋岩 任锋 《中华实验和临床感染病杂志（电子版）》 CAS 2022年第5期320-327,共8页
目的建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)检测方法。方法提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA... 目的建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)检测方法。方法提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后,使用HindⅢ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶(PSAD)分别进行酶切;根据松弛环状DNA(rcDNA)和cccDNA的结构差异,设计特异性扩增HBV cccDNA的引物,对酶切后的产物进行滚环扩增(RCA)和PCR扩增;并筛选crRNA,建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果利用α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和HBV表面抗原(HBsAg)引物对双重酶切后的产物进行扩增,验证产物中HBV基因组的存在;利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增,验证了产物中只存在HBV cccDNA;利用RCA后的阳性样本作为模板梯度稀释,然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测,计算出检测下限为10拷贝/μl。结论本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法,可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测,为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。 展开更多
关键词 肝炎病毒 乙型 共价闭合环状DNA 规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白 微滴数字聚合酶链反应 荧光定量聚合酶链反应
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成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因9系统在干细胞研究中的应用进展
11
作者 孙苏静 霍嘉慧 +2 位作者 耿志军 孙晓艳 付小兵 《中华烧伤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期253-256,共4页
随着对DNA碱基精确识别的核酸酶研究的深入，第3代基因编辑技术，如锌指核酸酶（ZFN）技术、类转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术等发展迅速，由于该类技术能够精确地进行DNA水平的特定位点敲除、插入及替换，加深研究者对生物... 随着对DNA碱基精确识别的核酸酶研究的深入，第3代基因编辑技术，如锌指核酸酶（ZFN）技术、类转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术等发展迅速，由于该类技术能够精确地进行DNA水平的特定位点敲除、插入及替换，加深研究者对生物基因组变化的了解，从而进一步探讨调控生物表型的内源性基因位点，最大限度在体外细胞模型中模拟疾病状态，因此越来越受到研究者的重视。这些技术在真核细胞中的应用也被证实是简便有效且具有位点特异性的，目前已成为实验室的一种常规基因编辑手段。虽然这些技术已进入临床应用阶段，但其脱靶率高、细胞毒性大及基因修饰类型单一等不足也亟待解决。 展开更多
关键词 干细胞 成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因9 基因编辑
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成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因系统的发展及应用研究进展 被引量：1
12
作者 谭晶洁 彭毅志 黄广涛 《中华烧伤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期681-687,共7页
成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因(CRISPR/Cas)系统,作为一种新兴的基因编辑系统,根据Cas蛋白的数量可分为一类系统和二类系统。二类系统中的CRISPR/Cas9仅借助Cas9蛋白和单链向导RNA即可对目标核酸进行切割,是目前应用最为... 成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因(CRISPR/Cas)系统,作为一种新兴的基因编辑系统,根据Cas蛋白的数量可分为一类系统和二类系统。二类系统中的CRISPR/Cas9仅借助Cas9蛋白和单链向导RNA即可对目标核酸进行切割,是目前应用最为广泛的CRISPR/Cas系统。除了基因编辑在遗传病治疗中的应用,CRISPR/Cas系统衍生出的多种技术在疾病相关基因的筛查、基因表达调控、病原微生物的快速检测和防治等领域也展现了巨大的应用前景。本文就CRISPR/Cas系统的发现历程及其衍生的几个主要技术的应用进行总结,旨在为生命科学领域研究人员提供参考。 展开更多
关键词 基因 成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因系统 基因编辑 衍生技术
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基于CRISPR-Cas12a系统的病原体核酸床旁检测技术方法研究的最新进展
13
作者 王思琦 吴泽 余楠 《现代检验医学杂志》 2025年第1期213-220,共8页
病原体核酸检测是精准诊断、治疗和预防感染性疾病的重要环节,即时、简便的床旁检测(POCT)的研制对于实现病原体核酸高效检测意义重大。一种基因编辑工具被发现应用于核酸检测方法高效而实用,此即成簇的规则间隔的短回文重复序列及其相... 病原体核酸检测是精准诊断、治疗和预防感染性疾病的重要环节,即时、简便的床旁检测(POCT)的研制对于实现病原体核酸高效检测意义重大。一种基因编辑工具被发现应用于核酸检测方法高效而实用,此即成簇的规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR-Cas)系统,其中,结构简单的CRISPR-Cas12a因其强大的靶向结合、反式切割基因片段功能而得以广泛应用。基于CRISPR-Cas12a系统的病原体核酸检测方法,利用等温或变温核酸扩增技术以及光学信号作为检测介质的POCT技术,具有高灵敏度、高特异度和检测流程简化等特点。该文主要介绍基于CRISPR-Cas12a系统的病原核酸检测POCT技术方法的最新研究进展,为研制快速、准确的病原体核酸检测方法提供新思路。 展开更多
关键词 成簇的规则间隔的短回文重复序列相关蛋白系统 病原体核酸检测 床旁检测
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规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白系统在传染病病原体核酸检测中的应用
14
作者 田原 张向颖 任锋 《中华传染病杂志》 CAS CSCD 2021年第9期579-582,共4页
作为新一代的基因编辑技术,规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated proteins,CRISPR/Cas)系... 作为新一代的基因编辑技术,规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated proteins,CRISPR/Cas)系统具有强大的基因编辑功能,已被应用于许多领域。目前,已开发的规律成簇的间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein,Cas)9、Cas12、Cas13和Cas14检测系统被广泛应用于传染病病原体的核酸检测,具有检测成本低、操作简单、灵敏度高等优点。本研究介绍了CRISPR/Cas系统的发展史、作用机制,以及几种Cas蛋白在传染病相关病原核酸检测中的应用。 展开更多
关键词 规律成簇的间隔短回文重复序列 crispr相关蛋白质类 核酸检测 附带切割
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应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统核糖核蛋白复合物技术基因修正威尔森氏症的体外研究
15
作者 史啸立 杨人杰 +1 位作者 李相成 俞悦 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第12期2226-2228,共3页
目的应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR/Cas9)体外实验研究修正威尔森氏症(WD)基因。方法选用来源于DL近交系小鼠的Toxic milk小鼠(购自美国Jackson Laboratory公司)作WD模型,设计3个CRISPR来源的RNA(crRNA)-cr... 目的应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR/Cas9)体外实验研究修正威尔森氏症(WD)基因。方法选用来源于DL近交系小鼠的Toxic milk小鼠(购自美国Jackson Laboratory公司)作WD模型,设计3个CRISPR来源的RNA(crRNA)-crRNA001/002/003,应用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)方法转染WD肝细胞,48 h后提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率,筛选出效率最高者crRNA001,并设计相应的单链寡核苷酸(ssODN)修复模板;用crRNA001和ssODN共转染肝细胞,模板特异性引物行PCR,验证ssODN掺入。组间比较采用Student’S t检验。结果Sanger测序结果显示,crRNA001的编辑效率为(57.8±5.1)%。用ssODN共转染细胞后,模板特异性引物行PCR,能扩增出修正后的铜离子转运ATP酶β肽(ATP7B)基因条带;二代测序结果显示,ATP7B基因修复效率为(7.45±2.54)%。结论CRISPR/Cas9 RNP转染能达到较高编辑效率,相应的ssODN可以高效修复缺陷ATP7B基因,为进一步的体内实验提供理论和实验基础。 展开更多
关键词 威尔森氏症 成簇的规律间隔的短回文重复序列 基因治疗 铜离子转运ATP酶β肽 核糖核蛋白体
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规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因编辑技术在感染性疾病诊断中的应用及其进展 被引量：1
16
作者 于佳佳 张旭霞 +2 位作者 李传友 刘毅 唐神结 《中华诊断学电子杂志》 2021年第1期62-66,共5页
规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)与相关蛋白Cas(CRISPR-Cas)系统是近来的研究热点,除在基因编辑方面有重要作用外,其应用于感染性疾病诊断方面也有很好的发展前景。传统感染性疾病检测及分子检测诊断技术在操作、检测周期及敏感度... 规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)与相关蛋白Cas(CRISPR-Cas)系统是近来的研究热点,除在基因编辑方面有重要作用外,其应用于感染性疾病诊断方面也有很好的发展前景。传统感染性疾病检测及分子检测诊断技术在操作、检测周期及敏感度、特异度等方面存在不足。随着对CRISPR-Cas系统的深入研究,针对其特异核酸的识别和遗传修饰功能,可开展对感染性病原体检测技术的应用,目前发现可应用于检测的主要有Cas9、Cas12a和Cas13核酸酶。利用该检测技术的高效性、特异性和可编程性,可开展对寨卡病毒、登革热病毒、疟疾菌株、结核分枝杆菌、人乳头瘤病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒及严重急性呼吸综合征冠状病毒2等一系列感染性疾病病原体的检测。CRISPR-Cas基因编辑技术可能成为一种快速、灵敏、特异、低廉和可靠的诊断技术,为感染性疾病的诊断提供重要的理论依据。笔者主要对Cas9、Cas12a、Cas13等在感染性疾病诊断中的应用及其进展进行综述。 展开更多
关键词 规律成簇间隔短回文重复序列 Cas蛋白 传染病 病原体 基因编辑
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规律成簇间隔短回文重复序列及相关蛋白9基因编辑技术在肝脏疾病中的应用
17
作者 姚建妮 袁观斗 何松青 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期1729-1734,共6页
近年来,基因编辑技术得到快速发展,基因编辑工具越来越多,且效率越来越高,其中以锌指核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶以及规律成簇间隔短回文重复序列及相关蛋白(CRISPR/Cas)技术的应用最为广泛.尤其是CRISPR/Cas9技术及相关应用,... 近年来,基因编辑技术得到快速发展,基因编辑工具越来越多,且效率越来越高,其中以锌指核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶以及规律成簇间隔短回文重复序列及相关蛋白(CRISPR/Cas)技术的应用最为广泛.尤其是CRISPR/Cas9技术及相关应用,自从面世以来已经连续3年被《自然》杂志评为“年度十大科学突破”,掀起前所未有的基因编辑研究热潮.“基因编辑婴儿”的诞生所引发的基因编辑相关医学伦理问题,进一步使基因编辑技术成为公众讨论和关注的焦点.CRISPR/Cas9技术因易于操作、效率高及成本低等优点使其在生物医疗领域中得到广泛应用.本文对近年来CRISPR/Cas9基因编辑技术在肝脏疾病中的应用研究进展进行综述. 展开更多
关键词 基因编辑 类转录激活因子效应物核酸酶以及规律成簇间隔短回文重复序列及相关蛋白9 肝脏疾病 肝脏损伤与修复
原文传递
CRISPR系统相关Cas蛋白研究进展
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作者 于佳佳 张旭霞 +2 位作者 李传友 唐神结 刘毅 《结核病与胸部肿瘤》 2020年第4期328-335,共8页
规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)最早发现于20世纪80年代末到90年代初,研究者在细菌与古细菌基因组中观察到存在CRISPR。Cas(CRISPR-associated proteins)蛋白是在基... 规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)最早发现于20世纪80年代末到90年代初,研究者在细菌与古细菌基因组中观察到存在CRISPR。Cas(CRISPR-associated proteins)蛋白是在基因组上CRISPR序列附近的基因表达的相关蛋白,是模块化的DNA结合或RNA结合蛋白;CRISPR和Cas蛋白构成CRISPR-Cas系统。 展开更多
关键词 RNA结合蛋白 规律成簇的间隔短回文重复序列 细菌基因组 DNA结合 模块化
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成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9敲除Ku80基因提高HEK293T细胞对阿霉素的敏感性
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作者 赖永平 曾金华 +2 位作者 谭雄红 柯坤 赵必星 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期1437-1440,共4页
目的利用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR/Cas9）技术将293T细胞中的Ku80基因敲除，建立Ku80敲除的293T细胞株，并验证Ku80缺失对DNA损伤修复的影响以及对293T细胞阿霉素耐药性的影响。方法首先，设计识别针对靶位点... 目的利用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR/Cas9）技术将293T细胞中的Ku80基因敲除，建立Ku80敲除的293T细胞株，并验证Ku80缺失对DNA损伤修复的影响以及对293T细胞阿霉素耐药性的影响。方法首先，设计识别针对靶位点的1对DNA Oligos，利用pSpCas9（BB）-2A-Puro （PX459）质粒构建表达导向RNA（sgRNA）载体。载体转染293T细胞。通过定点聚合酶链式反应（PCR）和T7E1内切酶酶切鉴定，确认所设计的sgRNA的有效性。进一步通过细胞有限稀释法和嘌呤霉素筛选，挑选单细胞克隆进行Western blot检测筛选出稳定敲除Ku80基因的293T细胞株。最后通过定点测序确认Ku80编码基因是否发生突变。使用阿霉素处理诱导DNA损伤，以磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）为指标检测DNA损伤，同时用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测Ku80敲除的293T细胞对阿霉素的药物敏感性。结果成功构建Ku80基因敲除的293T细胞，用阿霉素处理诱导DNA损伤并经过修复之后，对照组和Ku80敲除组γ-H2AX染色的阳性率分别为（30.67±2.49）%和（88.00±1.63）%（P=0.000），表明Ku80敲除的293T细胞的DNA损伤修复功能显著受到抑制。同时Ku80敲除显著提高293T细胞对阿霉素的敏感性，阿霉素对Ku80敲除组细胞和对照组细胞的生长抑制率分别为（53.99±1.29）%和（32.42±1.20）%（P=0.000）。结论293T细胞中敲除Ku80抑制了DNA损伤的修复和提高了细胞对阿霉素的敏感性。 展开更多
关键词 成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9技术 293T细胞 Ku80基因 阿霉素
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利用成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞株的研究
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作者 谢芳莘 蔡信平 +4 位作者 周建华 李霞 赖默温 张勇刚 马峰 《国际输血及血液学杂志》 CAS 2021年第6期520-529,共10页
目的探讨利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞(hPSC)株的方法。方法①选择GATA1基因为目的基因,利用CRISPR/Cas9技术构建共表达载体[Cas9和向导RNA(gRN... 目的探讨利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞(hPSC)株的方法。方法①选择GATA1基因为目的基因,利用CRISPR/Cas9技术构建共表达载体[Cas9和向导RNA(gRNA)]和打靶载体(重组臂),并且以电穿孔的方式将共表达载体、打靶载体及环化重组酶(Cre)导入hPSC的H1细胞系。经电穿孔后的H1细胞培养2 d后,选择24个H1细胞单克隆进行PCR扩增,以验证共表达载体和打靶载体是否被成功导入,以及Cre是否成功去除H1细胞单克隆中的筛选标志物。②挑取经PCR验证的条带大小正确的阳性H1细胞单克隆,进行细胞培养后,提取H1细胞单克隆基因组,并且分别采用引物对1/2(GATA15′端臂外引物/mCherry 3′端引物)和3/5(HygroR 5′端引物/GATA13′端臂外引物)对基因组进行PCR扩增,以验证该H1细胞单克隆是否具有GATA1和mCherry正确序列。③使用构建完成的H1∶GATA1-mCherry细胞进行造血功能验证实验,以确认基因编辑是否改变H1细胞特性,以及造血分化能力。选择未经基因编辑H1细胞和H1∶GATA1-mCherry细胞,置于相同的造血分化培养条件培养14 d后,分别于610 nm激发波长免疫荧光显微镜下观察,并采用流式细胞术(FCM)对细胞表面标志物CD34、CD43、CD45进行检测。选取培养至GATA1大量表达时期的H1∶GATA1-mCherry细胞,进行细胞甩片和免疫荧光染色实验。对经过基因编辑的H1∶GATA1-mCherry细胞,进行GATA1特异抗体染色体,观察其能否准确追踪并指示GATA1。结果①经电穿孔转入打靶载体和共表达载体后,H1细胞单克隆PCR扩增产物的电泳结果显示,H1细胞经电穿孔后,可获得2710和945 bp的PCR扩增产物电泳条带;电泳条带为2710 bp,说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列,但是Cre没有去除筛选标志物;条带大小为945 bp,说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列,并且Cre已去除筛选标志物,为目的H1细胞。选取24个H1细胞单克隆进行PCR验证结果显示,打靶载体和共表达载体成功敲入的H1细胞克隆、打靶载体和共表达载体成功敲入且Cre去除筛选标志的H1细胞克隆(目的细胞)及染色体纯合敲入的H1细胞比例分别为80%(20/24)、50%(10/20)和90%(18/20)。②H1∶GATA1-mCherry细胞进行造血诱导培养14 d时,荧光显微镜下GATA1表达时期可见大量红色荧光,FCM检测结果显示,未经基因编辑H1细胞与H1∶GATA1-mCherry细胞相比,造血干/祖细胞群比例相似,二者CD34^(+)CD45^(+)细胞比例分别为12.4%和14.1%,CD34^(+)CD45^(+)细胞比例分别为17.0%和20.2%,表明H1∶GATA1-mCherry细胞的造血分化能力没有改变。③GATA1高表达时期H1∶GATA1-mCherry细胞的免疫荧光染色实验结果显示,荧光显微镜下可见仅GATA1抗体染色阳性细胞有mCherry标志物,表明H1∶GATA1-mCherry细胞通过mCherry荧光蛋白对GATA1基因的标记是准确且特异的。结论本研究以GATA1为目的基因,在hPSC中快速、高效进行基因敲入,成功建立快速、实时示踪目的基因表达的方法。 展开更多
关键词 GATA1转录因子 多能干细胞 基因敲入技术 成簇规律间隔短回文重复序列 crispr相关蛋白 GATA1基因
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