阳离子脂质体联合转铁蛋白介导肝癌组织特异性载体在人肝癌细胞株中的表达 被引量：1

1

作者 程香普 段芳龄 +6 位作者 张智清 陈庆华 马军 冯常炜 唐芙爱 赵治国 李振峰 《天津医药》 CAS 北大核心 2003年第8期483-485,共3页

目的 :研究阳离子脂质体联合转铁蛋白(transferrin,Tf)介导甲胎蛋白 (AFP)启动子/增强子载体对分泌AFP的人肝癌细胞株的双重靶向作用。方法:测定比较阳离子脂质体Lipofectin、Lipofectin联合含双铁的人转铁蛋白[HTf(Fe)2]介导质粒 pDR2... 目的 :研究阳离子脂质体联合转铁蛋白(transferrin,Tf)介导甲胎蛋白 (AFP)启动子/增强子载体对分泌AFP的人肝癌细胞株的双重靶向作用。方法:测定比较阳离子脂质体Lipofectin、Lipofectin联合含双铁的人转铁蛋白[HTf(Fe)2]介导质粒 pDR2luc、pEBAFluc转染分泌AFP的人肝癌细胞株 (HepG2)、不分泌AFP的人肝癌细胞株 (SMMC7721)、人肾癌细胞株 (GRC)及非洲绿猴肾细胞 (COS7)的转染效率 ,转染效率以液体闪烁计数仪单光子计数法测定荧光素酶活性估计。结果 :(1)除COS7 外 ,其余3株细胞以Lipofectin +HTf(Fe)2介导pDR2luc的转染效率均比单用Lipofectin的转染效率高 (均P<0.01)。(2)以Lipofectin介导 pEBAFluc转染4株细胞 ,荧光素酶活性仅在能分泌AFP的HepG2 中表达。 (3)比较Lipofectin、Lipofectin +HTf(Fe) 2 介导 pEBAFluc转染HepG2 的效率 ,后者较前者高8倍多 (P<0.01)。结论 :Lipofectin +HTf(Fe) 展开更多

关键词 原发性肝癌 阳离子脂质体 转铁蛋白 甲胎蛋白 特异性载体 基因治疗

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人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建及转染研究 被引量：4

2

作者 张晶晶 刘凤军 +2 位作者 彭淑英 宋红卫 张涌 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2007年第1期29-32,共4页

构建了携带人乳铁蛋白(LTF)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的乳腺特异性表达载体(pEBL),用脂质体法转染泌乳期莎能奶山羊乳腺上皮细胞,转染后于荧光显微镜下观察GFP表达情况。用G 418对转染细胞进行筛选,获得抗性细胞克隆,并对转染细胞进... 构建了携带人乳铁蛋白(LTF)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的乳腺特异性表达载体(pEBL),用脂质体法转染泌乳期莎能奶山羊乳腺上皮细胞,转染后于荧光显微镜下观察GFP表达情况。用G 418对转染细胞进行筛选,获得抗性细胞克隆,并对转染细胞进行PCR检测。结果显示,pEBL构建成功,转染6 h后可观察到细胞有GFP表达,PCR检测阳性克隆细胞转有LTF基因。表明pEBL载体已转染山羊乳腺上皮细胞,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了基础。 展开更多

关键词 山羊乳腺上皮细胞 人乳铁蛋白 绿色荧光蛋白 特异性载体

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甘蓝型油菜pep基因片段的克隆和种子特异性反义表达载体的构建 被引量：7

3

作者 张志刚 白德朗 +3 位作者 陈烈臣 熊兴华 李栒 官春云 《湖南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期249-252,共4页

丙酮酸羧化酶(PEP)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶,抑制种子中pepc基因的表达,使其底物(丙酮酸)更多地朝生成油脂的方向流动,对提高种子的含油量,增加油菜的经济价值具有重要的意义.利用PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因组... 丙酮酸羧化酶(PEP)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶,抑制种子中pepc基因的表达,使其底物(丙酮酸)更多地朝生成油脂的方向流动,对提高种子的含油量,增加油菜的经济价值具有重要的意义.利用PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因组中扩增了PEP基因片段,并将其克隆到pGEM-TEasy载体上进行测序.测序结果表明:扩增片段长576bp,与Yannai报道的PEP基因相应区域的同源性为95%.用扩增引物上设计的BamHI和SacI两位点酶将PEP基因片段切下,反向插入到pBI121.N质粒的Napin启动子之后,构建了种子特异性反义PEP表达载体,并通过农杆菌介导法将反义PEP基因转化到湘油15号中. 展开更多

关键词 甘蓝型油菜 PCR 反义PEP 种子特异性表达载体

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内蒙古白绒山羊VEGF164基因毛囊特异性表达载体的构建及胎儿成纤维细胞的稳定转染 被引量：4

4

作者 鲍文蕾 李彬 +4 位作者 侯鑫 刘俊娥 郭旭东 王志钢 刘东军 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第22期4756-4762,共7页

【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164(vascular endothelial growth factor 164,VEGF164)基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【... 【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164(vascular endothelial growth factor 164,VEGF164)基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV(6.3 kb)。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】在构建的表达载体pCDsRed2-KV中,VEGF164基因被正确连接在毛囊特异性启动子KAP6-1下游,基因下游按顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因;外源KAP6-1启动子和VEGF164基因整合到细胞基因组中。【结论】成功构建稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164的真核表达载体,稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过克隆技术获得转VEGF164基因绒山羊提供了条件。 展开更多

关键词 内蒙古白绒山羊 VEGF 毛囊特异性表达载体 稳定转染

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tPA乳腺组织特异性表达载体构建及转基因小鼠建立 被引量：2

5

作者 赵宝全 张守峰 +3 位作者 赵君 扈荣良 章金钢 殷震 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期125-127,共3页

以 p KB、pc DNA 3和 p CPA为原始质粒 ,构建 BL G启动子调控的组织型纤溶酶原激活剂 (t PA)乳腺组织特异性表达载体 p BTA。以 Sal I酶切质粒 p BTA,回收 5 .45 kb基因片段 BL G- t PA- b GHpoly A,通过显微注射 ,导入昆明小鼠受精卵... 以 p KB、pc DNA 3和 p CPA为原始质粒 ,构建 BL G启动子调控的组织型纤溶酶原激活剂 (t PA)乳腺组织特异性表达载体 p BTA。以 Sal I酶切质粒 p BTA,回收 5 .45 kb基因片段 BL G- t PA- b GHpoly A,通过显微注射 ,导入昆明小鼠受精卵的雄原核内。共注 136 5枚 ,将存活的 10 5 3枚移植到 5 0只同期发情假孕母鼠的输卵管内。怀孕 2 4只 ,共产仔79只 ,上述仔鼠通过 PCR检测 ,结果 19只阳性。Southern blotting检测上述 19份 PCR阳性小鼠基因组 ,其中 4只为整合阳性 ,说明已获得了乳球蛋白启动子调控下的 t PA转基因小鼠 ,为 t PA在小鼠体内表达研究提供了必要条件。 展开更多

关键词 TPA 转基因 小鼠 乳腺生物反应器 乳腺组织特异性表达载体 溶栓药物

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口蹄疫病毒O/China/99株VP1基因植物种子特异性表达载体的构建及农杆菌的导入 被引量：4

6

作者 潘丽 张永光 +7 位作者 王永录 王宝琴 王文秀 方玉珍 蒋守田 王炜 孙元 谢庆阁 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2005年第6期413-417,共5页

根据植物组成型表达质粒pBin438的限制性酶切位点及FMDVVP1的核苷酸序列设计并合成引物,从种子特异性启动子7S质粒pU82质粒中扩增7S启动子,经HindⅢ和BamHⅠ酶切,与经同样双酶切的植物组成型表达载体pBin438大片段连接,经酶切、PCR鉴定... 根据植物组成型表达质粒pBin438的限制性酶切位点及FMDVVP1的核苷酸序列设计并合成引物,从种子特异性启动子7S质粒pU82质粒中扩增7S启动子,经HindⅢ和BamHⅠ酶切,与经同样双酶切的植物组成型表达载体pBin438大片段连接,经酶切、PCR鉴定及序列分析,种子特异性表达载体p7SBin438构建完成。从FMDVVP1基因的pGEMVP1质粒中扩增VP1基因,经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后,与p7SBin438质粒酶切后的大片段连接,经酶切、PCR及测序鉴定,FMDVVP1基因已置于种子特异性启动子7S下游,成功构建了FMDVVP1基因的种子特异性表达载体p7SBin438VP1。通过三亲交配法,将表达载体p7SBin438VP1导入根癌农杆菌,为研究FMD可饲疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 植物组成型表达载体 种子特异性表达载体 根癌农杆菌 VP1基因 疫苗

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甘蓝型油菜PEP基因片段的克隆和种子特异性反义表达载体的构建及转基因油菜的获得 被引量：3

7

作者 张燕 刘桂珍 +1 位作者 陈正华 安黎哲 《激光生物学报》 CAS CSCD 2007年第3期315-321,348,共8页

丙酮酸羧化酶(PEP)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶,抑制PEP基因的表达,可提高种子的含油量。本研究利用PCR法从甘蓝型油菜花油5号(H045)克隆了PEP基因片段,并与载体pBI121-B构建了反义PEP基因的种子特异性植物表达载体,通... 丙酮酸羧化酶(PEP)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶,抑制PEP基因的表达,可提高种子的含油量。本研究利用PCR法从甘蓝型油菜花油5号(H045)克隆了PEP基因片段,并与载体pBI121-B构建了反义PEP基因的种子特异性植物表达载体,通过激光微束穿刺法将其转化到甘蓝型油菜中,目前已获得了转基因植株。 展开更多

关键词 丙酮酸羧化酶 反义PEP PCR 种子特异性表达载体 激光微束穿刺法

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NS特异性siRNA真核表达载体的构建 被引量：15

8

作者 蔡子微 刘思金 +2 位作者 胡国法 魏影允 劳为德 《牡丹江医学院学报》 2003年第3期1-4,共4页

目的 :构建nucleostemin(核干细胞因子 ,NS)特异性siRNA真核表达载体。方法 :以小鼠组织基因组DNA为模板 ,PCR方法克隆小鼠编码U6snRNA基因的启动子 ,将NS -siRNA表达序列、PolⅢ识别的终止信号与U6启动子连接起来 ,并将其插入 pcDNA4 /... 目的 :构建nucleostemin(核干细胞因子 ,NS)特异性siRNA真核表达载体。方法 :以小鼠组织基因组DNA为模板 ,PCR方法克隆小鼠编码U6snRNA基因的启动子 ,将NS -siRNA表达序列、PolⅢ识别的终止信号与U6启动子连接起来 ,并将其插入 pcDNA4 /C载体中。 结果 :(1 )从小鼠基因组DNA中克隆到编码U6snRNA基因的启动子 ,(2 )构建了含有U6启动子、NS -siRNA表达序列和PolⅢ识别终止信号的NS -siRNA表达的片段 ,(3)将NS -siRNA表达片段插入了 pcDNA4 /C真核表达载体。 结论 :构建了针对NS特异性的siRNA真核表达载体 pcDNA4 /C -NS -Silencer。 展开更多

关键词 核干细胞因子 NS SIRNA 特异性真核表达载体 小鼠 U6启动子 基因 克隆

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甘蓝型油菜WRI1基因cDNA克隆与种子特异性表达载体的构建

9

作者 施春霖 刘聪 +3 位作者 肖旦望 邬克彬 陈社员 熊兴华 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期120-125,共6页

WRI1基因所编码的转录因子参与糖酵解和脂肪酸合成,在种子油的积累过程中起着关键作用。在种子中超表达WRI1基因,对提高油菜种子含油量具有重要意义。本研究利用RT-PCR技术,从甘蓝型油菜湘油15号cDNA中分离克隆了5个WRI1基因全长cDNA序... WRI1基因所编码的转录因子参与糖酵解和脂肪酸合成,在种子油的积累过程中起着关键作用。在种子中超表达WRI1基因,对提高油菜种子含油量具有重要意义。本研究利用RT-PCR技术,从甘蓝型油菜湘油15号cDNA中分离克隆了5个WRI1基因全长cDNA序列,选取2种存在明显差异(碱基缺失)的cDNA序列构建植物种子特异性表达载体。为后续转基因研究这种差异是否会造成WRI1基因在提高含油量作用上的差异作准备。通过双酶切和连接反应,分别将WRI1基因和napin启动子基因插入到pBI121载体的GUSA基因和CaMV35启动子基因位置。酶切及PCR检测结果显示,napin启动子和WRI1已插入相应位置,完成2种载体种子特异性表达WRI1基因重组载体pBI121+napin+WRI1的构建,命名为pBI121NW2、pBI121NW4。 展开更多

关键词 甘蓝型油菜 懈朋 克隆 种子特异性表达载体

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山羊α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的构建及核供体细胞的转染

10

作者 任春环 曹鸿国 +2 位作者 程箫 冯颖 张子军 《安徽农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期735-738,共4页

为了构建α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体及提供山羊乳腺生物反应器α-乳清蛋白核移植供体细胞,提取乳腺组织中的总RNA,采用RT-PCR技术获得α-乳清蛋白基因cDNA,测序酶切后连接乳腺特异性表达载体pBCⅠ-Neo,并对重组载体进行酶切测序鉴定... 为了构建α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体及提供山羊乳腺生物反应器α-乳清蛋白核移植供体细胞,提取乳腺组织中的总RNA,采用RT-PCR技术获得α-乳清蛋白基因cDNA,测序酶切后连接乳腺特异性表达载体pBCⅠ-Neo,并对重组载体进行酶切测序鉴定;取重组正确的载体酶切线性化后利用脂质体介导转染至山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选培养转染了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞。结果显示:经过RT-PCR特异性扩增克隆出α-乳清蛋白基因;克隆的基因碱基组成序列经测序与预期完全一致,α-乳清蛋白基因片段正向插入乳腺特异性表达载体;重组载体在山羊胎儿成纤维细胞中稳定转染,转入α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞生长迅速,仍保持原有的细胞生长形态。成功构建了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体,获得稳定转染的山羊胎儿成纤维细胞可用于核移植。 展开更多

关键词 山羊 α-乳清蛋白基因 乳腺特异性表达载体 胎儿成纤维细胞 转染

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奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体的构建与鉴定

11

作者 曹随忠 姚学萍 +4 位作者 崔亚飞 杨德英 雍康 余树民 刘宗平 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2013年第6期1-7,18,共8页

【目的】构建奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体。【方法】根据GenBank中牛TAP基因cDNA序列(GenBank号:NM_174776)设计引物,从奶牛乳腺组织中RT-PCR扩增TAP基因编码序列,将其克隆到pMD19-T(simple)载体中测序。重组质粒pMD-TAP... 【目的】构建奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体。【方法】根据GenBank中牛TAP基因cDNA序列(GenBank号:NM_174776)设计引物,从奶牛乳腺组织中RT-PCR扩增TAP基因编码序列,将其克隆到pMD19-T(simple)载体中测序。重组质粒pMD-TAP经EcoRⅠ+KpnⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆到携带增强型绿色荧光蛋白的通用型乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP中,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(bMEC)、COS-7细胞,并注射泌乳家兔乳腺组织,荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检测家兔乳腺组织中TAP mRNA的表达。【结果】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,该载体可在bMEC中特异性地表达绿色荧光蛋白;半定量RT-PCR检测发现,转染pBLG-EGFP-TAP可显著提高家兔乳腺组织中TAPmRNA的表达水平。【结论】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,为进一步研究奶牛TAP基因的表达特性及利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供了重要材料。 展开更多

关键词 奶牛 乳房炎 Β-防御素 气管抗菌肽基因 乳腺特异性表达载体

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家稗Pdk基因叶片特异性表达载体的构建及农杆菌的导入

12

作者 王金明 赵明 +2 位作者 丁在松 张斌 郭志江 《中国农学通报》 CSCD 2007年第5期63-66,共4页

【研究目的】构建含家稗Pdk基因的叶片特异性表达载体;【方法】通过PstI和SalI单酶切分别从质粒pRGN及pUCm-Pdk上获得Rubisco小亚基启动子和Pdk基因,将其连入表达载体pCAMBI1301,并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105;【结果】... 【研究目的】构建含家稗Pdk基因的叶片特异性表达载体;【方法】通过PstI和SalI单酶切分别从质粒pRGN及pUCm-Pdk上获得Rubisco小亚基启动子和Pdk基因,将其连入表达载体pCAMBI1301,并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105;【结果】构建了由Rubisco小亚基启动子调控的Pdk基因植物表达载体p1301-Prbs-Pdk,选择标记基因为Hpt(潮霉素磷酸转移酶基因),经酶切和PCR鉴定,表达载体已成功导入农杆菌EHA105中;【结论】丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)是C4光合途径中的关键光合酶,本实验中构建了含有rbcs启动子的适于单子叶植物转化的Pdk基因表达载体,为提高转基因植物光合效率奠定了基础。 展开更多

关键词 丙酮酸磷酸双激酶(PPDK) 叶片特异性表达载体 根癌农杆菌

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OsWRKY10基因特异性dsRNA干涉载体构建

13

作者 窦彩虹 陈应武 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第7期2682-2683,共2页

[目的]明确Osdg中T-DNA插入位点的基因是否为引起突变表型的基因。[方法]采用OsWRKY10基因5’端、不含WRKY保守域的长300 bp的cDNA片段,构建抑制OsWRKY10基因表达的特异性dsRNA干涉重组表达载体pCam-35SWInW。采用冻溶法将pCam-35SWInW... [目的]明确Osdg中T-DNA插入位点的基因是否为引起突变表型的基因。[方法]采用OsWRKY10基因5’端、不含WRKY保守域的长300 bp的cDNA片段,构建抑制OsWRKY10基因表达的特异性dsRNA干涉重组表达载体pCam-35SWInW。采用冻溶法将pCam-35SWInW载体导入根癌农杆菌超毒力菌株EHA105,对其进行PCR检测。[结果]该研究成功构建了重组表达载体pCam-35SWInW。采用相应限制性内切酶对重组表达载体进行酶切鉴定,其中以XhoⅠ消解重组质粒,可获得1 kb左右的DNA片段。在抑制基因表达方面,发卡结构比反义结构更为有效。[结论]该研究成功构建了抑制OsWRKY10表达的特异性dsRNA干涉载体,可用于进一步的基因功能研究。 展开更多

关键词 OsWRKY10基因 特异性dsRNA干涉载体 构建

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猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体的构建 被引量：1

14

作者 黎丽荣 黄海军 +7 位作者 高其双 董斌科 邓兵 刘艳 陶弼菲 向敏 吴建英 蒋思文 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期127-129,134,共4页

为构建猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体,采用PCR方法从质粒pcDNA3.1-BLG-HNP-1中扩增出山羊乳球蛋白(BLG)基因,插入到真核表达载体pIRES2-EGFP-PBD-1构建成乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和... 为构建猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体,采用PCR方法从质粒pcDNA3.1-BLG-HNP-1中扩增出山羊乳球蛋白(BLG)基因,插入到真核表达载体pIRES2-EGFP-PBD-1构建成乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,鉴定。结果成功构建了乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1。乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1的成功构建,为进一步研究PBD-1蛋白的抗菌活性、抗菌机理及将进一步该载体应用于动物乳腺生物反应器的研究奠定基础。 展开更多

关键词 猪β防御素1 山羊乳球蛋白 乳腺特异性表达载体 抗菌机理

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Lat52介导的特异性表达载体的构建及其鉴定

15

作者 许冠东 蔡民华 《首都师范大学学报（自然科学版）》 2001年第4期62-67,共6页

利用含花粉特异性启动子Lat5 2的质粒pLat5 2 7、含细胞毒素A链基因的质粒pGA96 8以及表达质粒载体pGA987,进行酶切连接 ,构建了含有Lat5 2特异性启动子和细胞毒素A链基因的表达载体 .经酶切和PCR进行鉴定 ,证明所构建的重组载体即为... 利用含花粉特异性启动子Lat5 2的质粒pLat5 2 7、含细胞毒素A链基因的质粒pGA96 8以及表达质粒载体pGA987,进行酶切连接 ,构建了含有Lat5 2特异性启动子和细胞毒素A链基因的表达载体 .经酶切和PCR进行鉴定 ,证明所构建的重组载体即为实验所需的载体质粒 。 展开更多

关键词 Lat52 特异性表达载体 酶切 PCR 花粉 生殖发育 生殖细胞 营养细胞

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奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒构建与鉴定 被引量：1

16

作者 张志鹏 江静宜 +3 位作者 夏海磊 冀德君 李明勋 杨章平 《家畜生态学报》 北大核心 2019年第5期24-28,共5页

研究旨在构建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特异性表达质粒,探索研制新型抗菌制剂,为利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供重要材料。根据GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank号:NM_180999.1)设计引物,从奶牛乳... 研究旨在构建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特异性表达质粒,探索研制新型抗菌制剂,为利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供重要材料。根据GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank号:NM_180999.1)设计引物,从奶牛乳腺上皮细胞中RT-PCR扩增Lyz基因编码序列,将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中测序。重组质粒pEGFP-N1-Lyz经AseI+HindIII双酶切除CMV启动子,将奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因(BLG)启动子同源重组替换到AseI和HindIII酶切位点,构建奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)、人肾脏上皮细胞(HEK293T),荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,重组表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz测序结果与目的片段长度相符,转染至BMEC细胞和HEK293T细胞,在奶牛乳腺上皮细胞观察到绿色荧光,HEK293T细胞未观察到绿色荧光,奶牛Lyz基因乳腺特异性表达质粒构建成功。 展开更多

关键词 奶牛乳房炎 溶菌酶 乳腺特异性表达载体 基因治疗

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5种转基因油菜转化体特异性多重PCR检测方法 被引量：7

17

作者 鲁军 李刚 +2 位作者 赵建宁 杨殿林 修伟明 《生物安全学报》 2017年第3期244-250,共7页

【目的】全球转基因植物及其产品的数量和种类越来越多,迫切需要可同时精准高效检测多个转化载体的检测方法。【方法】针对RF1、MS8、Topas19/2、Oxy235和RF3等5个转基因油菜品系的侧翼序列及油菜内源基因cruciferin A(Cru A)序列设计... 【目的】全球转基因植物及其产品的数量和种类越来越多,迫切需要可同时精准高效检测多个转化载体的检测方法。【方法】针对RF1、MS8、Topas19/2、Oxy235和RF3等5个转基因油菜品系的侧翼序列及油菜内源基因cruciferin A(Cru A)序列设计多重聚合酶链式反应特异性引物,通过对转基因油菜、转基因大豆、转基因玉米、转基因水稻、转基因棉花等不同作物进行PCR扩增来测试所选择的引物特异性,优化多重PCR反应引物的浓度,用所建立的检测体系对不同混合比例的转基因油菜进行多重PCR扩增来测试所建立的检测方法的灵敏度。【结果】通过测试,仅在含有目标样品中检测出阳性结果,灵敏度达0.05%,表明所建立的6重PCR检测方法可同时精准检测RF1、MS8、Topas19/2、Oxy235和RF3等5种转基因油菜转化载体。【结论】所建立的6重转基因油菜转化体特异性PCR检测方法通量高、特异性好、灵敏度高,符合有关转基因产品检测的要求,可作为转基因油菜检测的有效方法。 展开更多

关键词 多重PCR 转基因油菜 转化载体特异性

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人凝血因子Ⅸ乳腺特异表达载体的构建及细胞转染 被引量：1

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作者 韩雪洁 萨日娜 +2 位作者 梁浩 李雪玲 李荣凤 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期769-778,共10页

【目的】人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFIX)是凝血过程中的关键因子,对临床治疗血友病有着极其重要的意义。研究旨在构建人凝血因子Ⅸ乳腺表达载体,在猪乳腺上皮细胞中验证其乳腺特异表达能力,获得hFIX转基因雌性乳腺上皮... 【目的】人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFIX)是凝血过程中的关键因子,对临床治疗血友病有着极其重要的意义。研究旨在构建人凝血因子Ⅸ乳腺表达载体,在猪乳腺上皮细胞中验证其乳腺特异表达能力,获得hFIX转基因雌性乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞,为克隆乳腺特异表达人凝血因子Ⅸ的转基因猪做准备。【方法】按照TaKaRa公司RNAiso Reagent和Prime Script RT-PCR试剂盒的说明书,从人胎儿肝脏中提取RNA并扩增出人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFIX)cDNA序列,利用PCR方法扩增牛生长激素(BGH)polyA序列,将hFIX的cDNA序列与BGH polyA序列分别连接到表达载体pbCSN2-RC的牛酪蛋白(CSN2)启动子之后,构建带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双筛选标记的乳腺特异性表达载体pbCSN2-hFIX-pA-RC。取本地屠宰的泌乳期猪乳房组织,利用组织块种植法培养猪乳腺细胞,并通过控时消化分离纯化猪乳腺上皮细胞,进行染色体分析后,挑选含有正常染色体数目的细胞,通过脂质体法将表达载体导入,经过G418筛选获得稳定表达红色荧光蛋白的转基因细胞,反转录、实时定量PCR验证乳腺表达载体构建的合理性和有效性。为了只对雌性胎儿成纤维细胞进行转基因操作,首先对培养的猪胎儿成纤维细胞进行SRY基因PCR扩增,确定其性别。之后,利用脂质体将证明有效的表达载体导入细胞,并进行G418和红色荧光蛋白表达筛选,对经过鉴定的阳性细胞进行扩大培养和冷冻保存,为下一步的体细胞克隆做准备。【结果】经PCR和酶切鉴定,人凝血因子ⅨcDNA和BGH PolyA成功克隆到载体pbCSN2-RC中,获得具有双筛选标记的pbCSN2-hFIX-pA-RC。转染后G418和红色荧光蛋白表达阳性的猪乳腺上皮细胞,经实时定量PCR鉴定,hFIX有高效表达,证明所构建载体具有指导人FIX在乳腺特异表达的能力,可以用于生产乳腺特异表达的动物。将构建的载体转入雌性猪胎儿成纤维细胞,经G418和红色荧光蛋白的表达筛选,成功获得hFIX转基因阳性细胞。【结论】pbCSN2-RC所含的牛β-酪蛋白启动子可以成功特异性诱导hFIX在猪乳腺细胞的特异表达,获得的hFIX转基因阳性猪胎儿成纤维细胞,为下一步通过体细胞克隆培育hFIX乳腺生物反应器奠定了基础。 展开更多

关键词 人凝血因子IX 乳腺特异性表达载体 猪乳腺上皮细胞 猪胎儿成纤维细胞 转染

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构建LEF1基因毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞

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作者 李彬 鲍文蕾 +5 位作者 张涛 侯鑫 郭旭东 王潇 王志钢 刘东军 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期141-145,共5页

旨在构建内蒙古白绒山羊(Capra hircus)淋巴样增强因子-1(Lymphoid enhancer factor,LEF1)基因真核表达载体并转染胎儿成纤维细胞,获得稳定表达红色荧光蛋白及毛囊特异性表达LEF1的转基因细胞克隆。以pCDsRed2载体为基本骨架将LEF1基因... 旨在构建内蒙古白绒山羊(Capra hircus)淋巴样增强因子-1(Lymphoid enhancer factor,LEF1)基因真核表达载体并转染胎儿成纤维细胞,获得稳定表达红色荧光蛋白及毛囊特异性表达LEF1的转基因细胞克隆。以pCDsRed2载体为基本骨架将LEF1基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,连接红色荧光蛋白表达元件,构建LEF1基因毛囊特异表达载体pCDsRed-KL。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KL序列中,LEF1基因正确连接在KAP6-1启动子下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。脂质体介导的稳定转染效率约为14.0%,经G418筛选得到高效表达红色荧光蛋白转基因细胞克隆。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和LEF1基因整合到胎儿成纤维细胞基因组中。 展开更多

关键词 内蒙古白绒山羊 淋巴样增强因子-1 毛囊特异性表达载体 稳定转染

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绵羊乳腺特异表达人肝细胞再生增强因子载体的构建及表达

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作者 马玉珍 张继英 +2 位作者 阿玫 白雁 扈廷茂 《内蒙古师范大学学报（自然科学汉文版）》 CAS 2005年第2期200-203,共4页

用PCR技术分别从人和绵羊基因组DNA中扩增人肝细胞再生增强因子(Humanaugmenterofliverregeneration,hALR)基因和绵羊β-乳球蛋白(sheepbeta-lactoglobulin,BLG)基因启动区序列,从pEGFP-C1质粒中扩增增强绿色荧光蛋白(EnhancedGreenfluo... 用PCR技术分别从人和绵羊基因组DNA中扩增人肝细胞再生增强因子(Humanaugmenterofliverregeneration,hALR)基因和绵羊β-乳球蛋白(sheepbeta-lactoglobulin,BLG)基因启动区序列,从pEGFP-C1质粒中扩增增强绿色荧光蛋白(EnhancedGreenfluorescenceprotein,EGFP)基因及其表达调控元件.由质粒p7zf(+)构建成ALR基因乳腺特异表达、EGFP基因非组织特异性表达载体.同时体外培养绵羊胎儿成纤维细胞(sheepfetalfibroblastcells,SFFCs),脂质体介导载体DNA转染SFFCs,激光共聚焦显微镜观察和PCR检测转基因细胞,结果表明,增强绿色荧光蛋白基因在SFFCs中表达,转基因细胞中可扩增出BLG、ALR、EGFP基因条带. 展开更多

关键词 乳腺特异表达 增强因子 细胞再生 绵羊 构建 增强绿色荧光蛋白 绿色荧光蛋白基因 EGFP基因 羊β-乳球蛋白 胎儿成纤维细胞 特异性表达载体 转基因细胞 基因组DNA 肝 PCR技术 Green DNA转染 脂质体介导 PCR检测 显微镜观察

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