长大二元杂交猪胎儿成纤维细胞的生物学特性 被引量：6

1

作者 李仕新 陈松玲 +2 位作者 李加琪 张豪 臧莹安 《四川农业大学学报》 CSCD 北大核心 2012年第2期220-225,共6页

【目的】研究长大二元杂交猪胎儿成纤维细胞的生物学特性。【方法】采用室温消化法从妊娠30d的长大二元杂母猪胚胎中分离胎儿成纤维细胞,利用MTT法检测第5、10、15、25、35、45、60、70代胎儿成纤维细胞的增殖能力,通过倒置显微镜观察... 【目的】研究长大二元杂交猪胎儿成纤维细胞的生物学特性。【方法】采用室温消化法从妊娠30d的长大二元杂母猪胚胎中分离胎儿成纤维细胞,利用MTT法检测第5、10、15、25、35、45、60、70代胎儿成纤维细胞的增殖能力,通过倒置显微镜观察不同代数的细胞形态,流式细胞仪分析细胞周期变化,DAPI染色观察细胞核染色质的形态以及衰老相关β-葡糖苷酶活性的染色测定等方法来判断细胞的衰老程度。【结果】①采用消化液室温消化法成功分离到猪胎儿成纤维细胞,细胞具有典型的成纤维细胞形态。②猪胎儿成纤维细胞于生长初期1～6d呈对数增长,此后进入平台期。【结论】随着细胞代数的增加,细胞的增殖能力虽有所下降,但仍然呈稳定的增长状态,各代次猪胎儿成纤维细胞生长良好。 展开更多

关键词 猪胎儿成纤维细胞 体外分离培养 生物学特性

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借助慢病毒将EGFP基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞 被引量：6

2

作者 张晟 肖高芳 +5 位作者 黄黎珍 那顺巴雅尔 贾俊双 姚志芳 肖东 顾为望 《中国比较医学杂志》 CAS 2010年第4期34-36,55,88,共5页

目的借助慢病毒将EGFP基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEFs),以基于PEFs建立慢病毒介导的外源基因体外投递系统。方法取35d西藏小型猪胚胎,酶消化法分离培养西藏小型猪的PEFs;按Invitrogen公司推荐的... 目的借助慢病毒将EGFP基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEFs),以基于PEFs建立慢病毒介导的外源基因体外投递系统。方法取35d西藏小型猪胚胎,酶消化法分离培养西藏小型猪的PEFs;按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒(携带EGFP基因)包装(脂质体介导的瞬时转染),随后用病毒上清感染PEFs,24～48h后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功生产和成功感染PEFs。结果成功分离培养西藏小型猪的PEFs,按标准程序生产的携带EGFP基因慢病毒高效率感染西藏小型猪的PEFs。结论针对西藏小型猪的PEFs建立了相应的慢病毒介导的外源基因体外投递系统,为相关后续研究打下了良好基础。 展开更多

关键词 慢病毒 西藏小型猪胎儿成纤维细胞(PEFs) 绿色荧光蛋白

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稳定转染纤维素酶相关基因的猪胎儿成纤维细胞系的建立 被引量：1

3

作者 黄妙容 张献伟 +5 位作者 刘德武 邹娴 帅亮 袁玉娟 朱财林 吴珍芳 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期535-542,共8页

旨在构建带有双筛选标记的纤维素酶基因的腮腺特异性表达载体,筛选稳定转染该载体的猪胎儿成纤维细胞系,为制备转纤维素酶基因的转基因克隆猪提供核供体细胞。采用SOE-PCR和PCR方法,分别扩增获得筛选标记基因NEO-T2A-EGFP序列和纤维素... 旨在构建带有双筛选标记的纤维素酶基因的腮腺特异性表达载体,筛选稳定转染该载体的猪胎儿成纤维细胞系,为制备转纤维素酶基因的转基因克隆猪提供核供体细胞。采用SOE-PCR和PCR方法,分别扩增获得筛选标记基因NEO-T2A-EGFP序列和纤维素酶相关基因的融合序列SP-EGX-F2A-BGL1,构建腮腺特异性表达载体pPSP-SP-EGX-F2A-BGL1-CMV-NEO-T2A-EGFP,经PCR、酶切、测序鉴定正确后,通过脂质体转染猪胎儿成纤维细胞,利用G418抗性和绿色荧光蛋白进行稳定筛选,并利用PCR和Western blot进行检测。结果表明,成功构建了带双筛选标记的腮腺特异表达纤维素酶基因的表达载体,并获得稳定转染该载体的猪胎儿成纤维细胞系。该结果为生产腮腺特异表达纤维素酶的转基因克隆猪研究奠定基础。 展开更多

关键词 双筛选标记 纤维素酶 2A 猪胎儿成纤维细胞

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大载体转染猪胎儿成纤维细胞的电转条件优化

4

作者 钟翠丽 李国玲 +7 位作者 王豪强 莫健新 全绒 张献伟 李紫聪 吴珍芳 顾婷 蔡更元 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期530-538,共9页

【背景】随着生物技术发展,研究的生理机制和生物功能日益复杂,提高大载体的转染效率对多基因共表达系统、基因编辑技术、转基因育种等具有重要的意义。在转基因育种中,使用的转基因载体相对较大,而且转基因动物的制备效率也与供体细胞... 【背景】随着生物技术发展,研究的生理机制和生物功能日益复杂,提高大载体的转染效率对多基因共表达系统、基因编辑技术、转基因育种等具有重要的意义。在转基因育种中,使用的转基因载体相对较大,而且转基因动物的制备效率也与供体细胞猪胎儿成纤维(porcine Fetal Fibroblasts,PFFs)细胞的转染效率有关。【目的】研究主要从转染参数、质粒用量和拓扑结构三方面,比较3种电转仪ECM~?830/NEPA21/Nucleofector^(TM)2b的大载体转染效率,以探索大载体转染PFFs的最佳条件。【方法】使用3种不同电转仪将长达26 kb的携带增强型绿荧光蛋白基因的pPXAT-EGFP质粒转染1×10~6个PFFs,48 h后使用流式细胞仪测定荧光细胞比例,从电转参数、质粒用量和拓扑结构三方面分别比较瞬时转染效率。【结果】首先比较电转仪不同参数的转染效率,结果显示当电转参数为脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,NEPA 21转染PFFs的效率最高,为13.24%±1.63%,而Nucleofector^(TM) 2b的最佳电转参数为U-023,其转染效率高达46.36%±3.95%。然后在最佳电转参数下分别比较6、8、10和12μg的26 kb超螺旋质粒的转染效率,ECM~?830和Nucleofector^(TM) 2b转染PFFs的最佳质粒用量为12μg,其转染效率分别为8.44%±0.90%(电转参数:脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次)和14.63%±3.21%(电转参数:U-023),而NEPA 21使用10μg质粒转染PFFs时效率达到最高(6.09%±0.72%)。最后比较不同质粒拓扑结构的转染效率,结果显示线性化质粒的转染效率较低,仅为超螺旋质粒转染效率的34.96%—48.39%。【结论】因此Nucleofector^(TM) 2b转染PFFs的最佳条件为:U-023程序、12μg超螺旋质粒;NEPA 21为:脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次、10μg超螺旋质粒;ECM~?830则在脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次条件下转染12μg超螺旋质粒可获得最佳转染效率。综合比较上述3种电转仪,26 kb大载体转染PFFs的最佳电转仪是Nucleofector^(TM) 2b。 展开更多

关键词 电转染 大载体 猪胎儿成纤维细胞 ECM^(■)830 NEPA 21 Nucleofector^(TM) 2b

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GPRASP2基因编辑猪胎儿成纤维细胞系的建立

5

作者 张敏 姚俊 +6 位作者 鲁雅洁 王红顺 王盈 杨海元 魏钦俊 曹新 戴一凡 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期4-10,共7页

目的:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G蛋白偶联受体相关分选蛋白2(G protein-coupled receptor associated sorting protein 2,GPRASP2)基因敲除的猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF),为构建GPRASP2基因敲除巴马小型猪... 目的:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G蛋白偶联受体相关分选蛋白2(G protein-coupled receptor associated sorting protein 2,GPRASP2)基因敲除的猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF),为构建GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型提供相应的供体细胞。方法:采用生物信息学方法对人与猪GPRASP2基因进行亲缘性和同源性分析,预测人与猪GPRASP2基因编码的氨基酸序列和蛋白二级结构;设计合成靶向巴马猪GPRASP2基因编码区上游和下游的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以p X330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组打靶质粒,并将此重组质粒转染至PFF中,G418药物筛选阳性单克隆细胞,测序分析其基因型。结果:生物信息学分析提示人/猪GPRASP2亲缘关系相近,同源性较高,且主要功能结构域Arm2的二维和三维结构相似。构建了靶向猪GPRASP2基因的重组打靶质粒并转染PFF,通过药物筛选、基因型分析和Western blot验证,成功获得GPRASP2基因敲除单克隆PFF。结论:人/猪GPRASP2基因亲缘关系相近且高度同源;采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术成功构建GPRASP2基因敲除的单克隆PFF,为建立GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型奠定了前期基础。 展开更多

关键词 GPRASP2 CRISPR/Cas9 猪胎儿成纤维细胞 GPRASP2基因敲除细胞系

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不同电转仪的电转参数、质粒用量和拓扑结构对猪胎儿成纤维细胞转染效率的影响 被引量：7

6

作者 钟翠丽 李国玲 +5 位作者 莫健新 全绒 王豪强 李紫聪 吴珍芳 张献伟 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期930-938,共9页

为获得猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)最佳的电转染效率,本研究利用荧光激活细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting,FACS)辅助优化NEPA 21和Nucleofector?2b两种电转仪电转染PFFs细胞的参数,比较不同质... 为获得猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)最佳的电转染效率,本研究利用荧光激活细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting,FACS)辅助优化NEPA 21和Nucleofector?2b两种电转仪电转染PFFs细胞的参数,比较不同质粒用量和拓扑结构在ECM?830、NEPA 21和Nucleofector?2b中的转染效率。结果显示:NEPA 21电转PFFs的最佳穿孔参数为脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,脉冲电压衰减幅度10%;Nucleofector?2b在U-023的转染参数下达到最高转染效率。ECM?830和Nucleofector?2b的最适质粒用量都为10μg,而NEPA 21为8μg;超螺旋质粒比线性化质粒的转染效率更高,且3种仪器中Nucleofector?2b转染效果最佳。本研究综合考虑电转仪、电转参数、质粒用量和拓扑结构的影响因素以优化PFFs的电转条件,为高效制备转基因猪及基因编辑猪的研究奠定基础。 展开更多

关键词 电转染 猪胎儿成纤维细胞 ECM^(■) 830 NEPA 21 Nucleofector^(TM) 2b

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α-半乳糖苷酶A基因敲除猪胎儿成纤维细胞系的建立

7

作者 冷允俊 刘晓蕊 +3 位作者 李琳 王盈 杨海元 戴一凡 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期688-694,共7页

目的 基于CRISPR/Cas9技术构建α-半乳糖苷酶A (GLA)基因敲除的巴马公猪胎儿成纤维细胞(PFFs),为构建人类Fabry病猪模型提供实验材料。方法 利用生物信息学方法对人/猪GLA基因编码的α-Gal A的相似性进行分析,并鉴定出猪α-Gal A的催化... 目的 基于CRISPR/Cas9技术构建α-半乳糖苷酶A (GLA)基因敲除的巴马公猪胎儿成纤维细胞(PFFs),为构建人类Fabry病猪模型提供实验材料。方法 利用生物信息学方法对人/猪GLA基因编码的α-Gal A的相似性进行分析,并鉴定出猪α-Gal A的催化残基位置。通过在线工具在编码催化残基之前的外显子区设计单链向导RNA,构建CRISPR/Cas9打靶载体。将打靶载体与抗性质粒共转染至巴马公猪胎儿PFFs,用G418药物筛选出单克隆细胞,并PCR测序鉴定。结果 人/猪α-Gal A的氨基酸序列一致性为81%,相似性为89%;三维结构的均方根偏差值为0.012。猪α-Gal A的催化残基是第174位和第235位的天冬氨酸。成功构建CRISPR/Cas9打靶载体,并筛选出单克隆细胞,PCR测序鉴定其基因型。结论 用生物信息学方法验证了人/猪α-Gal A具有高度的相似性。利用CRISPR/Cas9技术获得了GLA基因敲除的巴马公猪PFFs细胞系,为构建人类Fabry病猪模型奠定了基础。 展开更多

关键词 FABRY病 α-半乳糖苷酶A基因 Α-半乳糖苷酶A CRISPR/Cas9 猪胎儿成纤维细胞

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利用CRISPR/Cas9技术建立OXTR基因敲除猪胎儿成纤维细胞系

8

作者 刘静静 刘晓蕊 +3 位作者 李琳 王盈 杨海元 戴一凡 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期272-278,共7页

利用CRISPR/Cas9系统建立催产素受体(oxytocin receptor,OXTR)基因敲除的巴马猪胎儿成纤维细胞系(porcine fetal fibroblasts,PFFs),为构建OXTR基因敲除巴马猪模型提供供体细胞。首先,对人和猪的OXTR基因进行了生物学信息分析。其次,利... 利用CRISPR/Cas9系统建立催产素受体(oxytocin receptor,OXTR)基因敲除的巴马猪胎儿成纤维细胞系(porcine fetal fibroblasts,PFFs),为构建OXTR基因敲除巴马猪模型提供供体细胞。首先,对人和猪的OXTR基因进行了生物学信息分析。其次,利用在线设计工具设计了2个靶向猪OXTR外显子区的sgRNA,并克隆至pX330骨架质粒中,最后将打靶质粒和Neomycin抗性质粒共转染至PFFs中,用G418药物筛选出抗性单克隆细胞,测序鉴定其基因型。生物信息学分析显示人和猪OXTR基因进化距离较近,氨基酸序列一致性达到91%,相似性为93%,三维结构的RMSD值为0.009。成功构建OXTR基因的Cas9/sgRNA打靶载体,转染PFFs细胞后,药物筛选获得OXTR基因敲除的单克隆细胞并测序证实了基因突变型。人和猪OXTR基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA表达载体高效实现了OXTR基因编辑,成功获得基因敲除的单细胞克隆,为后续构建OXTR敲除的巴马猪模型奠定了前期基础。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 OXTR基因 生物信息分析 猪胎儿成纤维细胞

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利用CRISPR/Cas9技术构建ACE2基因修饰的猪胎儿成纤维细胞系

9

作者 张成霖 方斌 +4 位作者 刘晓蕊 李琳 王盈 杨海元 戴一凡 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期1499-1506,共8页

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)基因编辑的长白猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)细胞系,为构建新型冠状病毒即严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe ac... 目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)基因编辑的长白猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)细胞系,为构建新型冠状病毒即严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2,SARS-CoV-2)不易感猪模型提供实验材料。方法:(1)利用生物信息学方法对大鼠和鸡的ACE2氨基酸序列进行比对,将大鼠ACE2与SARS-CoV-2 S蛋白相互作用的关键氨基酸残基替换为鸡ACE2的氨基酸残基,设计嵌合的ACE2基因并构建ACE2基因敲入供体。(2)设计并合成靶向猪ACE2基因的sgRNA,克隆到p X330载体上构建ACE2基因打靶载体。(3)将ACE2打靶载体和ACE2基因敲入供体以及Neomycin抗性质粒共转染至长白猪PFF细胞,筛选G418抗性单细胞克隆并进行测序鉴定。结果:根据氨基酸序列比对结果,将大鼠ACE2蛋白的第19、31、34、35、42、353、354位氨基酸残基替换为鸡ACE2的氨基酸残基,设计合成了嵌合的ACE2基因。G418抗性单细胞克隆基因型分析结果显示获得了阳性单细胞克隆。结论:利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源ACE2基因敲除、嵌合ACE2敲入的长白公猪PFF细胞系,为构建SARS-CoV-2不易感猪模型奠定了基础。 展开更多

关键词 ACE2 CRISPR/Cas9 SARS-CoV-2 猪胎儿成纤维细胞

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脂质体介导抗乙脑病毒载体转染猪胎儿成纤维细胞条件的优化

10

作者 唐元凤 李方正 +4 位作者 张莉平 周婧 曲洪磊 张文平 宋学雄 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2013年第4期9-11,14,I0002,共5页

本试验旨在探索脂质体Lipofectamine TM2000介导抗猪乙脑病毒(Anti-JEV)载体转染猪胎儿成纤维细胞(PFF)的最适条件,为构建Anti-JEV转基因胚胎提供供核细胞。从妊娠大白母猪获取10～15cm猪胎儿,采集背部皮肤用于组织块法培养分离PFF。结... 本试验旨在探索脂质体Lipofectamine TM2000介导抗猪乙脑病毒(Anti-JEV)载体转染猪胎儿成纤维细胞(PFF)的最适条件,为构建Anti-JEV转基因胚胎提供供核细胞。从妊娠大白母猪获取10～15cm猪胎儿,采集背部皮肤用于组织块法培养分离PFF。结果显示,细胞培养至P7代,生长曲线正常;P5-7代细胞用于抗猪乙脑病毒载体转染,当质粒DNA量设定为0.35、0.7、1.05μg和1.4μg时,转染率分别为12.75%、36.82%、24.12%和8.85%;当脂质体量设定为0.7、1.4、2.1、2.8μL和3.5μL时,转染率分别为13.08%、21.71%、37.15%、24.21%和9.21%;当转染时间设定为2.5、4.5、6.5h和8.5h时,转染率分别为3.97%、38.48%、17.54%和12.47%。这些结果表明,2.1μL脂质体介导0.7μg质粒DNA转染4.5h转染效率最高。 展开更多

关键词 抗乙脑病毒载体 猪胎儿成纤维细胞 脂质体 转染

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脂质体介导抗猪瘟病毒基因转染猪胎儿成纤维细胞的条件优化

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作者 曲洪磊 李方正 +2 位作者 张莉平 周婧 宋学雄 《青岛农业大学学报（自然科学版）》 2012年第3期176-180,共5页

本研究以组织块法分离大白猪胎儿成纤维细胞(Porcine fetus fibroblasts,PFF),通过脂质体将含有抗猪瘟病毒基因及绿色荧光蛋白基因(GFP)的重组质粒转入猪胎儿成纤维细胞,探讨转染猪胎儿成纤维细胞的影响因素,如DNA质量、脂质体用量及转... 本研究以组织块法分离大白猪胎儿成纤维细胞(Porcine fetus fibroblasts,PFF),通过脂质体将含有抗猪瘟病毒基因及绿色荧光蛋白基因(GFP)的重组质粒转入猪胎儿成纤维细胞,探讨转染猪胎儿成纤维细胞的影响因素,如DNA质量、脂质体用量及转染时间。实验发现脂质体2.5uL、质粒1.2μg、转染时间6h时转染率最高,为32.5%。过量的脂质体、质粒及过长的转染时间(>6h)会引起细胞的皱缩及死亡。本研究旨在为构建抗猪瘟病毒转基因克隆猪提供核供体。 展开更多

关键词 脂质体 抗猪瘟病毒 猪胎儿成纤维细胞

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PIN1基因敲除的长白猪胎儿成纤维细胞系的建立 被引量：1

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作者 王万义 袁益琳 +3 位作者 李琳 王盈 戴一凡 杨海元 《陆军军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第13期1349-1355,共7页

目的利用成簇的规律间隔短回文重复序列和相关蛋白9(clustered regular interval short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除长白猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)的PIN1基... 目的利用成簇的规律间隔短回文重复序列和相关蛋白9(clustered regular interval short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除长白猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)的PIN1基因,以构建PIN1基因敲除长白猪胎儿成纤维细胞系。方法对人和猪的PIN1基因进行同源性分析。利用在线工具设计2个靶向猪PIN1基因第二个外显子区的sgRNAs,并克隆至pX330骨架质粒中。将构建成功的打靶质粒和Neomycin抗性质粒共转染至PFFs中,用G418药物筛选出抗性单细胞克隆,测序鉴定其基因型并从转录和翻译水平鉴定PIN1的表达。结果同源性分析显示人和猪PIN1蛋白的氨基酸序列一致性和相似性均为98%,二者三维结构的均方根偏差(RMSD)值为0.014。获得15个PIN1基因敲除的纯合单克隆细胞系,并且证实PIN1蛋白在翻译水平被完全敲除。结论利用双sgRNAs引导的CRSIPR/Cas9系统在PFFs中高效实现PIN1基因的双等位基因敲除,成功建立PIN1基因敲除的长白猪胎儿成纤维细胞系。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 PIN1基因 猪胎儿成纤维细胞 猪疾病模型

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CRISPR/Cas13d介导猪胎儿成纤维细胞SUV39H1/SUV39H2基因敲降

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作者 毕登峰 王煜 +1 位作者 姚婧 赵建国 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第6期1957-1966,共10页

研究旨在利用CRISPR/Cas13d系统对猪胎儿成纤维细胞(PEF)中的胚胎发育相关基因SUV39H1/SUV39H2进行RNA水平的敲降,从而在猪上建立CRISPR/Cas13d介导的基因敲降系统。根据SUV39H1、SUV39H2基因的编码序列各设计3个靶向编码链的sgRNAs,并... 研究旨在利用CRISPR/Cas13d系统对猪胎儿成纤维细胞(PEF)中的胚胎发育相关基因SUV39H1/SUV39H2进行RNA水平的敲降,从而在猪上建立CRISPR/Cas13d介导的基因敲降系统。根据SUV39H1、SUV39H2基因的编码序列各设计3个靶向编码链的sgRNAs,并以单链寡核苷酸的形式合成,退火后与BspQⅠ线性化的sgRNA表达载体进行连接,构建SUV39H1-sgRNA和SUV39H2-sgRNA表达载体,用Sanger软件进行测序;将Cas13d表达载体和靶向SUV39H1/SUV39H2基因的sgRNA载体按照1∶1、1∶2、1∶4、2∶1和4∶1比例转染猪胎儿成纤维细胞,48 h后收集细胞,用流式细胞术分选检测细胞转染效率,用半定量PCR和实时荧光定量PCR检测敲降效率;用半定量PCR和免疫荧光检测敲降SUV39H1/SUV39H2基因后,靶基因转录水平及组蛋白H3K9me3水平的变化。测序结果表明,针对2个基因设计的各3条sgRNAs均成功连入载体中;流式细胞术分选结果显示,转染效率约70%;半定量PCR结果表明,与对照组相比,3个sgRNAs均极显著降低了SUV39H1和SUV39H2基因的表达(P<0.01),其中SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1均可使SUV39H1和SUV39H2的表达降低50%;Cas13d∶sgRNA为1∶1、1∶2和1∶4组细胞的存活率高于2∶1和4∶1组;实时荧光定量PCR结果表明,Cas13d∶sgRNA为1∶2、1∶4、2∶1和4∶1组敲降效率均显著高于1∶1组(P<0.05),且Cas13d∶sgRNA为1∶2组敲降效率最高(70%)。半定量PCR结果显示,转染SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1极显著降低SUV39H1和SUV39H2的表达,表达量为对照组的25%~30%(P<0.01)。免疫荧光检测结果表明,敲降SUV39H1和SUV39H2基因后,组蛋白H3K9me3水平显著降低(P<0.05)。因此,本研究利用CRISPR/Cas13d系统在猪胎儿成纤维细胞中成功敲降SUV39H1和SUV39H2,并下调其催化的H3K9me3水平。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas13d SUV39H1/SUV39H2基因 敲降 猪胎儿成纤维细胞

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一种无血清冻存液在猪胎儿成纤维细胞上的应用研究 被引量：3

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作者 游小燕 何琦琳 +1 位作者 刘雪芹 葛良鹏 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期69-73,共5页

在猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFF)冻存过程中,血清品质常常制约着细胞的冻存效果。为了解决这个问题,本研究旨在开发一种无血清冻存液应用于猪胎儿成纤维细胞冻存。用3种不同冻存液冻存猪胎儿成纤维细胞,每种冻存10... 在猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFF)冻存过程中,血清品质常常制约着细胞的冻存效果。为了解决这个问题,本研究旨在开发一种无血清冻存液应用于猪胎儿成纤维细胞冻存。用3种不同冻存液冻存猪胎儿成纤维细胞,每种冻存10管。冻存30 d后复苏细胞,测定冻存细胞存活率,细胞增殖活力以及电转后细胞活性。结果显示:自制无血清细胞冻存液,冻存猪胎儿成纤维细胞后存活率达95.33%;细胞增殖活力以及电转后细胞活性均显著高于标准胎牛血清冻存液(p<0.05),与特级胎牛血清冻存液效果相当(p>0.05)。因此,自制冻存液冻存猪胎儿成纤维细胞效果稳定,能够替代含血清冻存液,有良好的推广应用前景。 展开更多

关键词 猪胎儿成纤维细胞 胎牛血清 细胞冻存液

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猪胎儿成纤维细胞的分离与基因转染 被引量：1

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作者 于永生 曹阳 +3 位作者 罗晓彤 张立春 金海国 王晓阳 《吉林农业科学》 CSCD 北大核心 2014年第4期50-53,共4页

为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得... 为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。 展开更多

关键词 猪胎儿成纤维细胞 绿色荧光蛋白 基因转染 脂质体

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甜菜碱对猪胎儿成纤维细胞m6A甲基化修饰的影响 被引量：2

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作者 陈梦佳 李思佳 +4 位作者 闫茜 王燕新 陈莫斯楠 石德顺 陆凤花 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期2554-2560,共7页

旨在探究甜菜碱对猪胎儿成纤维细胞(PFFs)m6A甲基化修饰的影响,以期揭示甜菜碱与PFFs RNA表观遗传修饰的关系。取适宜体长的胎猪分离PFFs,添加不同浓度甜菜碱培养PFFs不同时间,利用CCK-8检测细胞增殖活性;并通过免疫荧光染色法检测细胞... 旨在探究甜菜碱对猪胎儿成纤维细胞(PFFs)m6A甲基化修饰的影响,以期揭示甜菜碱与PFFs RNA表观遗传修饰的关系。取适宜体长的胎猪分离PFFs,添加不同浓度甜菜碱培养PFFs不同时间,利用CCK-8检测细胞增殖活性;并通过免疫荧光染色法检测细胞整体m6A甲基化修饰水平;采用qRT-PCR检测细胞凋亡相关基因(Bcl,Bax)、m6A甲基转移酶基因(METTL3,METTL14,WYAP)、去甲基酶基因(ALKBH5,FTO)和阅读蛋白(YTHDC1,YTHDF1,YTHDF2)的表达情况。结果表明,添加20,50 mmol/L甜菜碱对细胞凋亡和增殖活性影响最小,高于100 mmol/L甜菜碱可抑制细胞增殖。免疫荧光染色结果显示,甜菜碱可显著提高PFFs中m6A修饰整体水平(P<0.05),且以剂量依赖模式增加m6A水平。qRT-PCR结果显示,20 mmol/L甜菜碱可抑制细胞凋亡,且显著改变m6A修饰酶基因的表达水平(P<0.05)。综上所述,甜菜碱通过改变m6A相关酶的表达,从而有效提升PFFs m6A甲基化修饰水平,为进一步挖掘RNA表观遗传修饰与体细胞克隆供体细胞重编程的关系提供理论依据。 展开更多

关键词 甜菜碱 猪胎儿成纤维细胞 m6A甲基化

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Plk1在猪胎儿成纤维细胞有丝分裂进程中的亚细胞定位和功能研究

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作者 林德凤 董妍 +4 位作者 石凤垚 曹伟 苗懋东 芮荣 剧世强 《畜牧与兽医》 北大核心 2018年第7期51-56,共6页

本研究旨在探究Plk1在猪胎儿成纤维细胞中的亚细胞定位及其作用。通过间接免疫荧光技术检测了Plk1在猪胎儿成纤维细胞有丝分裂进程中的亚细胞定位,并通过Plk1特异性抑制剂GSK461364处理进一步分析Plk1在细胞有丝分裂进程中的潜在作用。... 本研究旨在探究Plk1在猪胎儿成纤维细胞中的亚细胞定位及其作用。通过间接免疫荧光技术检测了Plk1在猪胎儿成纤维细胞有丝分裂进程中的亚细胞定位,并通过Plk1特异性抑制剂GSK461364处理进一步分析Plk1在细胞有丝分裂进程中的潜在作用。结果显示：Plk1在猪胎儿成纤维细胞有丝分裂各个时期都有分布,且在细胞核周围有相对较高水平的Plk1表达;经GSK461364处理后,细胞活力显著降低,细胞周期进程阻滞在G2/M期,出现细胞核碎裂,并伴随着α-微管蛋白结构紊乱。研究表明：Plk1参与了调控猪胎儿成纤维细胞有丝分裂的进程,并与G2/M期的细胞核分裂和微管组装密切相关。 展开更多

关键词 猪胎儿成纤维细胞 PLK1 有丝分裂 细胞核 Α-微管蛋白

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敲减FST基因对猪成纤维细胞中相关基因表达的影响 被引量：2

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作者 孙亚蒙 张冬杰 +3 位作者 汪亮 张旭 尹雪 刘娣 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期111-114,共4页

旨在获得敲减FST基因的猪胎儿成纤维细胞,并探讨对相关基因表达的影响。将构建成功并鉴定准确的发夹RNA真核表达载体FR1-shRNA利用脂质体转染至猪胎儿成纤维细胞中,并进行G418筛选,获得稳定转染细胞株,并利用Real-time检测了相关基因表... 旨在获得敲减FST基因的猪胎儿成纤维细胞,并探讨对相关基因表达的影响。将构建成功并鉴定准确的发夹RNA真核表达载体FR1-shRNA利用脂质体转染至猪胎儿成纤维细胞中,并进行G418筛选,获得稳定转染细胞株,并利用Real-time检测了相关基因表达的变化。结果表明,在稳定转染的细胞株中,FST基因的表达受到显著抑制,结果导致了ActivinRⅡA、Myostatin和Bmp4基因的表达出现下调趋势,并且极显著地降低MyoD基因的表达。 展开更多

关键词 卵泡抑素(FST) RNA干扰 猪胎儿成纤维细胞 相关基因

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体细胞核移植生产梅山猪 被引量：5

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作者 华再东 郑新民 +9 位作者 魏庆信 肖红卫 刘西梅 华文君 郭帅 张立苹 毕延震 任红艳 岑文 华升 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第10期192-197,共6页

本研究以中国优良地方品种梅山猪为材料,采用胰酶消化法获得猪胎儿成纤维细胞,通过使用Y染色体SRY基因引物SRY-1、SRY-2进行PCR扩增,结果发现,雄性胎儿样本能扩增出250bp的Y染色体特异性基因片段,而雌性胎儿样本未扩增出此条带;G1、G2... 本研究以中国优良地方品种梅山猪为材料,采用胰酶消化法获得猪胎儿成纤维细胞,通过使用Y染色体SRY基因引物SRY-1、SRY-2进行PCR扩增,结果发现,雄性胎儿样本能扩增出250bp的Y染色体特异性基因片段,而雌性胎儿样本未扩增出此条带;G1、G2、G3、G4和G5代的融合效率差异不显著(P>0.05),但G5代作为供体细胞核移植的重组胚胎卵裂率显著高于G1、G2、G3和G4代(P<0.05);使用G5代的胎儿成纤维细胞作为供核细胞,通过手术移植的方法,将重构胚胎移植到二元后备母猪体内,结果成功地获得了体细胞克隆梅山仔猪,并且仔猪全部为雄性胎儿,说明该性别鉴定方法不但操作简单,而且准确度高;经微卫星DNA多态性鉴定,确定克隆猪来自供核细胞,与代孕母猪无亲缘关系。本研究将为中国优质猪品种改良、保种、性别控制及建立人类疾病模型等研究提供有效可行的方法,为批量生产克隆优秀种猪提供了坚实的理论基础。 展开更多

关键词 梅山猪 克隆猪 核移植 猪胎儿成纤维细胞

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人/猪SERPING1同源性比较及猪SERPING1敲除细胞系的建立 被引量：1

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作者 王蒙 朱晓晗 +4 位作者 刘晓蕊 李琳 王盈 杨海元 戴一凡 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2022年第4期505-509,共5页

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SERPING1-/-猪胎儿成纤维细胞(PFFs)系,为构建遗传性血管性水肿模型提供细胞实验材料。方法首先比较人/猪SERPING1氨基酸同源性。其次,分析猪SERPING1基因有效的编码区,据此选择第八外显子为敲除靶... 目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SERPING1-/-猪胎儿成纤维细胞(PFFs)系,为构建遗传性血管性水肿模型提供细胞实验材料。方法首先比较人/猪SERPING1氨基酸同源性。其次,分析猪SERPING1基因有效的编码区,据此选择第八外显子为敲除靶点,设计并合成靶向猪SERPING1的单导向RNA(sgRNA),连接到含有Cas9核酸内切酶的pX330载体上,构建SERPING1打靶载体pX330sgRNA,将其转染至猪胎儿成纤维细胞中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,用T7E1酶切实验检测靶点编辑情况,测序验证单克隆细胞基因型。结果生物信息学分析结果提示人/猪SERPING1蛋白氨基酸同源性较高,氨基酸比对相似性达到65.87%。成功构建打靶SERPING1的载体,并转染到细胞,药物筛选获得SERPING1基因敲除的单克隆细胞,测序确认了突变的基因型。结论人/猪SERPING1蛋白同源性较高,适合用于构建遗传性血管性水肿模型。构建的Cas9/sgRNA表达载体实现了SERPING1基因编辑,获得基因敲除的单细胞克隆,为后续SERPING1-/-猪模型的构建提供了必需的实验材料。 展开更多

关键词 SERPING1 CRISPR/Cas9 猪胎儿成纤维细胞

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