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猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用 被引量：1
1
作者 周颖 赵硕 +10 位作者 覃国喜 梁龙华 肖婷 陈忠伟 卢冰霞 秦毅斌 林昌华 张胜斌 段群棚 胡庭俊 何颖 《动物医学进展》 北大核心 2024年第2期11-16,共6页
为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感... 为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10^(3)~10^(4)倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 猪鼻支原体 TaqMan荧光定量PCR
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猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：17
2
作者 武昱孜 熊祺琰 +5 位作者 刘蓓蓓 张珍珍 王佳 华利忠 韦艳娜 邵国青 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第8期1491-1498,共8页
建立同时检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体的双重荧光定量PCR方法。根据猪肺炎支原体P97序列和猪鼻支原体P37序列的特异性引物,分别标记FAM和Texas Red荧光报告基团的2条TaqMan探针,建立和优化双重实时荧光定量PCR反应条件和体系,同时检测... 建立同时检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体的双重荧光定量PCR方法。根据猪肺炎支原体P97序列和猪鼻支原体P37序列的特异性引物,分别标记FAM和Texas Red荧光报告基团的2条TaqMan探针,建立和优化双重实时荧光定量PCR反应条件和体系,同时检测其敏感性、特异性和重复性。建立的双重荧光定量PCR对猪肺炎支原体和猪鼻支原体的最低检测值均为10copies·μL-1;与猪源致病菌、病毒和其他常见细菌均无交叉反应;各浓度标准品的Ct值变异系数小于5%,重复性好。检测72份临床样本,其中猪肺炎支原体的肺阳性率为80%,鼻拭子阳性率22%,支气管肺泡灌洗液阳性率58.33%;猪鼻支原体的肺阳性率为40%,鼻拭子阳性率66%,支气管肺泡灌洗液阳性率41.67%。建立的双重荧光定量PCR方法比普通PCR更加敏感,实用性强,可用于临床样品的检测。该方法能同时快速和定量地检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体,在短时间内获得样品的多个信息,快速地解决了多次检测所需的时间以及经济消耗,为猪肺炎支原体和猪鼻支原体的监测和防控提供了新型、可靠的检测技术。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 猪鼻支原体 双重荧光定量PCR
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胃癌组织中猪鼻支原体的分离培养与鉴定 被引量：11
3
作者 马华崇 马泓 +5 位作者 张艳丽 季加孚 王怡 李吉友 徐光炜 寿成超 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2003年第2期31-33,共3页
目的　获得胃癌组织中存在猪鼻支原体感染的直接证据。方法　收集新鲜的胃癌手术标本 2 0例 ,利用PPLO培养基从胃癌组织中分离培养猪鼻支原体 ,并用聚合酶链反应 (PCR)检测阳性培养产物中猪鼻支原体的特异性基因序列片段。结果　除 1例... 目的　获得胃癌组织中存在猪鼻支原体感染的直接证据。方法　收集新鲜的胃癌手术标本 2 0例 ,利用PPLO培养基从胃癌组织中分离培养猪鼻支原体 ,并用聚合酶链反应 (PCR)检测阳性培养产物中猪鼻支原体的特异性基因序列片段。结果　除 1例标本细菌污染外 ,1 9例胃癌组织中有 4例获得阳性培养产物 ,阳性率为 2 1 1 % ;该 4例阳性培养物中均扩增出猪鼻支原体的特异性序列片段。结论　胃癌组织中存在猪鼻支原体感染 ,说明猪鼻支原体对人亦具感染性。 展开更多
关键词 胃癌 猪鼻支原体 分离培养 鉴定 癌组织
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猪肺炎支原体与猪鼻支原体分离鉴定及鉴别检测 被引量：7
4
作者 李海利 邓祖丽颖 +8 位作者 徐引弟 王治方 张青娴 朱文豪 方剑玉 游一 侯自花 郎利敏 王克领 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2017年第11期148-151,共4页
为建立猪肺炎支原体与猪鼻支原体的鉴别诊断方法,对从河南省及周边地区猪场采集的患呼吸道疾病的猪只样品进行支原体的分离培养,针对猪肺炎支原体与猪鼻支原体设计了2对引物,扩增片段大小分别为480 bp和360 bp,对所分离纯化的病原微生... 为建立猪肺炎支原体与猪鼻支原体的鉴别诊断方法,对从河南省及周边地区猪场采集的患呼吸道疾病的猪只样品进行支原体的分离培养,针对猪肺炎支原体与猪鼻支原体设计了2对引物,扩增片段大小分别为480 bp和360 bp,对所分离纯化的病原微生物进行了菌落形态观察及分子鉴定。结果显示,分离的病原微生物为支原体,菌落呈典型的"煎蛋样"特征;通过单一PCR扩增反应,分别得到了猪肺炎支原体与猪鼻支原体相应的目的扩增片段。表明分离到了猪肺炎支原体与猪鼻支原体。在单一扩增的基础上,建立了猪肺炎支原体与猪鼻支原体二重PCR反应方法,可同时得到2条目的条带,与单一PCR扩增结果一致。表明建立的二重PCR方法可用于猪肺炎支原体与猪鼻支原体的同时检测和鉴别诊断。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 猪鼻支原体 鉴别诊断 二重PCR
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猪鼻支原体表面可变脂蛋白vlpA黏附宿主细胞功能研究 被引量：6
5
作者 张必雄 熊祺琰 +6 位作者 王佳 纪燕 倪博 韦艳娜 冯志新 刘茂军 邵国青 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期1897-1904,共8页
猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)可引起猪的多发性浆膜炎、关节炎、肺炎及中耳炎等多种慢性炎症,感染率极高,且与人类肿瘤的发生有关,对人类健康构成威胁。已有研究表明猪鼻支原体表面可变脂蛋白(vlp)家族参与支原体黏附宿主细胞的过... 猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)可引起猪的多发性浆膜炎、关节炎、肺炎及中耳炎等多种慢性炎症,感染率极高,且与人类肿瘤的发生有关,对人类健康构成威胁。已有研究表明猪鼻支原体表面可变脂蛋白(vlp)家族参与支原体黏附宿主细胞的过程,本试验主要详细研究vlp家族成员之一vlpA的黏附细胞功能,特别是其Ⅲ区重复片段重复次数变化对其黏附能力的影响。根据GenBank中已公布的vlpA的基因序列,设计引物,从菌体DNA中扩增获得vlpA基因,或者人工合成Ⅲ区重复片段重复次数不等的一系列vlpA基因,均克隆至pET-32a(+)质粒中进行表达,获得目的蛋白质。同时利用固相合成法制备含两段Ⅲ区重复片段的多肽。利用间接免疫荧光试验和微孔板黏附试验检测所制备的各种重组vlpA蛋白和多肽的黏附功能。通过诱导表达和镍柱亲和层析纯化,成功获得纯度较高的各个目的蛋白质。利用间接免疫荧光试验证实vlpA可以黏附宿主细胞;利用微孔板黏附试验定量检测不含Ⅲ区的重组vlpA0蛋白及Ⅲ区重复片段多肽的黏附能力,结果发现vlpA0可黏附细胞,而Ⅲ区重复片段多肽无明显黏附能力;进一步利用微孔板黏附试验检测含Ⅲ区重复片段次数分别为3、6、9、12次的重组蛋白vlpA3、vlpA6、vlpA9、vlpA12的黏附能力,结果显示四种重组蛋白质均可黏附细胞,但黏附水平均低于不含Ⅲ区的重组vlpA0蛋白,且随着Ⅲ区重复片段重复次数的增加黏附能力下降。本研究结果提示vlpA为猪鼻支原体黏附因子之一,其Ⅱ区含有黏附位点,而整体分子的黏附能力随着Ⅲ区重复片段重复次数的增加明显减弱。本研究结果有助于进一步研究猪鼻支原体的黏附及致病机制。 展开更多
关键词 猪鼻支原体 可变脂蛋白vlpA 细胞黏附 重复次数
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猪鼻支原体与猪地方性肺炎 被引量：10
6
作者 王占伟 熊琪琰 邵国青 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1036-1039,共4页
猪鼻支原体(Mhr)是小猪呼吸道的常在菌,在猪群中的检出率很高,可引起猪发生肺炎、多浆膜炎、关节炎和中耳炎,一定程度上影响了猪的生长和生产性能,并可继发其它病原感染,加重呼吸道症状。Mhr也是细胞培养的常见污染物和多种癌症的诱发... 猪鼻支原体(Mhr)是小猪呼吸道的常在菌,在猪群中的检出率很高,可引起猪发生肺炎、多浆膜炎、关节炎和中耳炎,一定程度上影响了猪的生长和生产性能,并可继发其它病原感染,加重呼吸道症状。Mhr也是细胞培养的常见污染物和多种癌症的诱发因素。Mhr引起猪肺炎的机理除了在病理变化方面有介绍外,其深层次的机制还未见报道,其在呼吸道移行及诱导全身性疾病的机制也不清楚。本文将从猪地方性肺炎(SEP)及主要致病原、可能的致病机理和研究方法方面进行阐述Mhr肺炎,为该病的研究和防治提供新思路与新手段,同时也为Mhr和其它病原共感染的研究提供借鉴。 展开更多
关键词 猪鼻支原体 猪地方性肺炎 猪肺泡巨噬细胞 体外感染 致病机理
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猪鼻支原体3种核酸检测方法的临床应用比较 被引量：4
7
作者 武昱孜 张旭 +4 位作者 白方方 刘茂军 华利忠 杜改梅 邵国青 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期985-988,共4页
为研究猪鼻支原体(Mhr)核酸检测方法的优越性及在临床应用中的价值,本实验比较了常规PCR、套式PCR和荧光定量PCR 3种方法的敏感性,并进行了临床样品的检测。常规PCR敏感性为104拷贝/μL,套式PCR和荧光定量PCR敏感性均为10拷贝/μL;对74... 为研究猪鼻支原体(Mhr)核酸检测方法的优越性及在临床应用中的价值,本实验比较了常规PCR、套式PCR和荧光定量PCR 3种方法的敏感性,并进行了临床样品的检测。常规PCR敏感性为104拷贝/μL,套式PCR和荧光定量PCR敏感性均为10拷贝/μL;对74份肺组织、36份气溶胶、99份鼻拭子和47份气管支气管灌洗液样品进行检测,常规PCR、套式PCR、荧光定量PCR检出率分别为18.0%(46/256)、53.9%(138/256)和55.1%(141/256)。常规PCR与套式PCR、荧光定量PCR方法的检出率差异极显著(p<0.01),而套式PCR与荧光定量PCR方法的检出率差异无显著性(p>0.05)。结果表明,套式PCR敏感性高,具有较高的临床实用价值;荧光定量PCR敏感性高,最具有实验室诊断价值,但对操作者要求较高;常规PCR方法敏感性稍低,可能造成漏检,但易于操作,对条件简单的基层实验室仍有一定的实用性。在检测临床样品时,推荐采用套式PCR结合荧光定量PCR,结果更为准确可靠,可以提高Mhr的检出率。 展开更多
关键词 猪鼻支原体 常规PCR 套式PCR 荧光定量PCR 临床应用
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猪鼻支原体TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法的建立 被引量：5
8
作者 白方方 武昱孜 +5 位作者 刘茂军 冯志新 熊祺琰 韦艳娜 马庆红 邵国青 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期833-836,共4页
为建立快速检测猪鼻支原体(M.hyorhinis)的荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的p37基因序列设计并合成引物及MGB探针,构建含有p37基因的重组质粒,以其为标准品绘制标准曲线,并检测该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示该方... 为建立快速检测猪鼻支原体(M.hyorhinis)的荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的p37基因序列设计并合成引物及MGB探针,构建含有p37基因的重组质粒,以其为标准品绘制标准曲线,并检测该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示该方法具有良好的特异性,与猪肺炎支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体、鸡毒支原体、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒、猪瘟病毒及猪流感病毒无交叉反应,对M.hyorhinis的检测敏感性为10拷贝/μL,并且稳定性好,变异系数小于2%。利用建立的荧光定量PCR方法对55份临床样品进行检测,阳性检出率为87.3%(48/55),而分离培养方法和普通PCR的阳性检出率分别为41.8%(23/55)和29.1%(16/55)。该结果表明,建立的方法特异性强、敏感性高、稳定性好,可以用于M.hyorhinis临床样品的检测,对M.hyorhinis的快速和定量检测具有重要意义。 展开更多
关键词 猪鼻支原体 p37基因 荧光定量PCR
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猪鼻支原体抗原在人结肠腺癌细胞表达的研究 被引量：4
9
作者 刘斌波 刘先洲 +2 位作者 刘东瀛 汤纪路 江哲珍 《武汉大学学报（医学版）》 CAS 2001年第1期6-7,17,共3页
目的 :通过研究猪鼻支原体 (Mhy)相关抗原在人肿瘤细胞的表达情况 ,以初步探讨Mhy与肿瘤的关系。方法 :通过培养Mhy提取其抗原 ,免疫家兔后获得其特异性抗血清 ,然后使用链霉亲和素 生物素过氧化物酶(SABC)方法 ,检测 32例人结肠腺癌... 目的 :通过研究猪鼻支原体 (Mhy)相关抗原在人肿瘤细胞的表达情况 ,以初步探讨Mhy与肿瘤的关系。方法 :通过培养Mhy提取其抗原 ,免疫家兔后获得其特异性抗血清 ,然后使用链霉亲和素 生物素过氧化物酶(SABC)方法 ,检测 32例人结肠腺癌和 5例胚胎不同组织细胞标本。结果 :Mhy相关抗原在 2 9例癌细胞胞膜及胞浆中有表达 ,在癌周正常组织细胞和胚胎细胞无表达 ,阳性率 90 .6 %。结论 :人某些恶性肿瘤细胞胞浆及胞膜存在Mhy相关抗原 ,作为一种新的肿瘤标志物用于恶性肿瘤的检测以及在研究支原体与人恶性肿瘤的关系方面具有一定的理论和实际意义。 展开更多
关键词 抗原 结肠腺癌 癌细胞 猪鼻支原体 Mhy
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猪鼻支原体表面可变脂蛋白VlpB黏附宿主细胞功能研究 被引量：3
10
作者 胡永婷 张必雄 +3 位作者 王佳 冯志新 邵国青 熊祺琰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第11期1049-1054,共6页
猪鼻支原体表面可变脂蛋白(Vlp)家族在黏附宿主细胞中起重要作用。为研究Vlp家族成员VlpB的黏附细胞功能,包括不同区段的黏附能力,以及其Ⅲ区重复片段的重复次数对黏附能力的影响。本研究利用间接免疫荧光和微孔板黏附试验验证了VlpB的... 猪鼻支原体表面可变脂蛋白(Vlp)家族在黏附宿主细胞中起重要作用。为研究Vlp家族成员VlpB的黏附细胞功能,包括不同区段的黏附能力,以及其Ⅲ区重复片段的重复次数对黏附能力的影响。本研究利用间接免疫荧光和微孔板黏附试验验证了VlpB的黏附细胞能力。然后根据GenBank中登录的vlpB基因序列,构建了仅含Ⅱ区基因的重组质粒pET-32a(+)/vlpBn,诱导表达后纯化,获得纯度较高的重组蛋白Vlp B0;同时化学合成Ⅲ区重复片段PepVlpB并与KLH偶联;进一步合成Ⅲ区重复次数分别为3、6、9、12的一系列vlpB基因,构建pET-VlpB,诱导表达获得相应的重组蛋白VlpB3、VlpB6、VlpB9和VlpB12。利用微孔板黏附试验定量检测上述重组蛋白和偶联蛋白的细胞黏附能力。结果显示,仅含Ⅱ区的重组蛋白Vlp B0及含Ⅲ区重复片段的偶联蛋白KLH-PepVlpB可黏附宿主细胞;比较不同Ⅲ区重复次数的VlpB蛋白的黏附水平,结果显示,随着Ⅲ区重复次数增多,VlpB黏附能力逐渐下降。本研究证实Vlp B作为猪鼻支原体的黏附因子之一,其Ⅱ区和Ⅲ区均含有黏附位点,而整体分子的黏附能力随Ⅲ区重复次数增加而降低。本研究结果为猪鼻支原体黏附及致病机制研究提供启示。 展开更多
关键词 猪鼻支原体 可变脂蛋白B(vlpB) 黏附能力 重复次数
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用乙基环丙沙星重建受猪鼻支原体污染的BHK-21细胞的研究 被引量：3
11
作者 高林 廖德芳 +4 位作者 姚俊 肖雷 李华春 张念祖 李志华 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第12期45-49,共5页
为重建受猪鼻支原体人为污染的BHK-21细胞,本研究采用含10mg/L乙基环丙沙星的培养液,对受污染的BHK-21细胞进行物理、化学相结合的循环处理,并用DNA荧光染色法和PCR法对处理进行全程监测。结果发现,4次循环处理并再传3代后,猪鼻支原体... 为重建受猪鼻支原体人为污染的BHK-21细胞,本研究采用含10mg/L乙基环丙沙星的培养液,对受污染的BHK-21细胞进行物理、化学相结合的循环处理,并用DNA荧光染色法和PCR法对处理进行全程监测。结果发现,4次循环处理并再传3代后,猪鼻支原体污染已被彻底清除,细胞恢复了健康。此方法为抢救受支原体污染的细胞提供了参考。 展开更多
关键词 乙基环丙沙星 猪鼻支原体 BHK-21细胞 清除污染
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猪鼻支原体血清抗体间接ELISA检测方法的建立 被引量：2
12
作者 王佳 熊祺琰 +6 位作者 华利忠 刘蓓蓓 甘源 冯志新 刘茂军 武昱孜 邵国青 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期1932-1938,共7页
猪鼻支原体是猪体内的一种常在菌,可引发猪的多发性浆膜炎、肺炎、关节炎、心包炎等炎症。由于猪鼻支原体与猪其他支原体有较高的交叉反应,目前并没有特异性的血清学诊断方法的报道。本试验以建立猪鼻支原体特异性ELISA检测方法为目的,... 猪鼻支原体是猪体内的一种常在菌,可引发猪的多发性浆膜炎、肺炎、关节炎、心包炎等炎症。由于猪鼻支原体与猪其他支原体有较高的交叉反应,目前并没有特异性的血清学诊断方法的报道。本试验以建立猪鼻支原体特异性ELISA检测方法为目的,将猪鼻支原体的表面可变脂蛋白Vlp的特定肽段作为包被抗原,优化该方法检测条件,最终确定:其抗原的最佳包被浓度为0.312 5μg·mL^(-1);一抗的最佳稀释度为1∶100,作用时间为30min;二抗的最佳稀释浓度为1∶20 000,最佳作用时间为30min;显色时间为10min;阴阳性的判定值为0.27。交叉性试验结果显示,Vlp抗原与猪其他支原体阳性血清及猪常见传染病阳性血清均无交叉反应。在重现性试验中,批内及批间的变异系数均低于10%,证明重现性良好。利用所建立的方法对已知阴性及阳性样本进行检测,结果显示特异性和灵敏度均良好。最后,用建立的方法对人工感染后28d的猪血清和247份临床样品进行检测,感染猪血清抗体呈阳性,建立的Vlp-ELISA方法、吐温20膜蛋白-ELISA方法对不同猪群临床样品检测的阳性率趋势相同。综上所述,建立的Vlp-ELISA方法特异性、稳定性良好,可以广泛用于临床猪鼻支原体血清抗体检测,为该病的检测和防控提供了重要工具。 展开更多
关键词 间接ELISA 猪鼻支原体 血清学诊断 VLP
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抗猪鼻支原体单克隆抗体的研制及双抗体夹心ELISA检测法的建立 被引量：11
13
作者 刘星 张丽芳 +1 位作者 杨玉萍 李红 《中国比较医学杂志》 CAS 2008年第3期55-58,共4页
目的制备多种抗猪鼻支原体的单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA方法用于该病原体的检测。方法用猪鼻支原体CVCC361免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术和酶联免疫吸附实验筛选出抗该病原体的单克隆抗体;运用免疫双向扩散试验、Western blottin... 目的制备多种抗猪鼻支原体的单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA方法用于该病原体的检测。方法用猪鼻支原体CVCC361免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术和酶联免疫吸附实验筛选出抗该病原体的单克隆抗体;运用免疫双向扩散试验、Western blotting确定IgG亚类及针对抗原的相对分子质量;筛选出配对抗体,建立双抗体夹心ELISA的检测方法,并评价其灵敏度和特异性。结果共筛选出17株单克隆抗体,抗体亚类分别为IgG1、IgG2aI、gG2bI、gG3,免疫印迹结果表明单抗ZB1、ZB2及ZB16与相对分子质量为35×103的抗原有特异性结合,而ZB3和ZB10与相对分子质量为70×103的抗原有特异性结合。确定了2个配对抗体(ZB1-ZB1-HRP和ZB1-ZB2-HRP),可检出最小抗原量为30 ng/mL,检出猪鼻支原体活菌8.34×102CFU/mL,与人呼吸道常见的致病菌及支原体均无非特异性反应。结论筛选的单克隆抗体具有较高的特异性和敏感性,应用双抗体夹心ELISA方法可用于猪鼻支原体的检测。 展开更多
关键词 猪鼻支原体 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA
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猪鼻支原体可变脂蛋白家族重组蛋白的构建表达及黏附细胞功能检测 被引量：2
14
作者 纪燕 熊祺琰 +6 位作者 王佳 张必雄 倪博 马庆红 冯志新 刘茂军 邵国青 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期338-343,共6页
目的本研究以猪鼻支原体表面的可变脂蛋白(vlp)家族为研究对象,鉴定其各成员对宿主细胞的黏附能力。方法根据已公布的猪鼻支原体vlp家族7种成员的基因序列设计引物,构建重组表达质粒pET-32a(+)/vlp,筛选获得阳性克隆。重组工程菌经IPTG... 目的本研究以猪鼻支原体表面的可变脂蛋白(vlp)家族为研究对象,鉴定其各成员对宿主细胞的黏附能力。方法根据已公布的猪鼻支原体vlp家族7种成员的基因序列设计引物,构建重组表达质粒pET-32a(+)/vlp,筛选获得阳性克隆。重组工程菌经IPTG诱导表达目的蛋白,经镍柱亲和层析获得7种纯化的vlp重组蛋白。利用间接免疫荧光法及微孔板定量法分别对vlp各个成员的黏附功能进行鉴定。结果成功构建了7种重组表达质粒pET-32a(+)/vlp,获得阳性重组工程菌。经IPTG诱导及镍柱亲和层析纯化,获得了较纯的7种vlp重组蛋白。间接免疫荧光及微孔板黏附定量试验检测结果显示,重组蛋白vlpA、vlpB、vlpC、vlpE、vlpG可黏附PK细胞,而重组vlpD和vlpF蛋白黏附能力不明显。结论本研究成功构建了猪鼻支原体7种vlp的重组蛋白,并对其黏附功能进行了初步鉴定,证明部分vlp属于猪鼻支原体的黏附因子。 展开更多
关键词 猪鼻支原体 可变脂蛋白 细胞黏附
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猪鼻支原体套式PCR诊断方法的建立及应用 被引量：4
15
作者 彭凌 刘博婷 杨旭夫 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2017年第4期121-123,共3页
为建立猪鼻支原体快速诊断方法,根据猪鼻支原体P69基因序列设计2对引物,建立了猪鼻支原体套式PCR诊断方法,对建立的方法进行特异性、敏感性检测,同时进行临床检测。结果表明,应用建立的套式PCR方法对猪鼻支原体DNA的检出限为1.4×10... 为建立猪鼻支原体快速诊断方法,根据猪鼻支原体P69基因序列设计2对引物,建立了猪鼻支原体套式PCR诊断方法,对建立的方法进行特异性、敏感性检测,同时进行临床检测。结果表明,应用建立的套式PCR方法对猪鼻支原体DNA的检出限为1.4×10^(-5)ng/μL,与常见感染猪的细菌、病毒均无交叉反应。利用建立的套式PCR方法对23份临床样品进行检测,阳性检出率为73.9%。本研究建立的猪鼻支原体套式PCR具有特异性强、敏感性高等优点,可用于猪鼻支原体的临床诊断。 展开更多
关键词 猪鼻支原体 套式PCR 诊断
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猪鼻支原体黏附宿主细胞间接免疫荧光检测方法的建立 被引量：2
16
作者 纪燕 熊祺琰 +5 位作者 韦艳娜 马庆红 白方方 冯志新 刘茂军 邵国青 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期239-243,共5页
目的猪鼻支原体是临床猪场的常见病菌,可引起猪多发性浆膜炎、肺炎、关节炎、中耳炎等慢性炎症,同时其与多种人类肿瘤有明显相关性,但其致病机理有待深入,其感染细胞机制的研究尚未明确,因此,本研究欲建立一种用间接免疫荧光技术检测猪... 目的猪鼻支原体是临床猪场的常见病菌,可引起猪多发性浆膜炎、肺炎、关节炎、中耳炎等慢性炎症,同时其与多种人类肿瘤有明显相关性,但其致病机理有待深入,其感染细胞机制的研究尚未明确,因此,本研究欲建立一种用间接免疫荧光技术检测猪鼻支原体黏附宿主细胞的方法。方法以猪鼻支原体和猪肾上皮细胞为研究对象,以兔抗猪鼻支原体纯化抗体为一抗,以FITC标记的羊抗兔IgG为二抗,通过反应条件的优化,建立猪鼻支原体黏附宿主细胞的间接免疫荧光检测方法(IFA)。结果最终确定最小黏附滴度为1∶107 CCU/mL,猪鼻支原体黏附PK15所需时间为6h以上,一抗的最佳工作浓度为1∶100,二抗的最佳工作浓度为1∶1 600。结论表明间接免疫荧光技术可以用来检测猪鼻支原体对宿主细胞的黏附作用。为猪鼻支原体的研究特别是感染细胞机制的体外研究提供基础方法,同时为疾病的诊断及疫苗的研发奠定基础。 展开更多
关键词 猪鼻支原体 黏附 间接免疫荧光技术
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猪鼻支原体攻毒模型研究进展 被引量：2
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作者 纪燕 熊祺琰 +3 位作者 韦艳娜 马庆红 刘占军 邵国青 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1115-1118,1123,共5页
猪鼻支原体是第一种从猪体内分离到的病原体,可引起猪的肺炎、多发性浆膜炎、关节炎、中耳炎等临床症状,对养殖业造成巨大危害。同时证实其与多种人类肿瘤有明显的相关性,也是人类和多种动物细胞培养中常见的污染物。目前对猪鼻支原体... 猪鼻支原体是第一种从猪体内分离到的病原体,可引起猪的肺炎、多发性浆膜炎、关节炎、中耳炎等临床症状,对养殖业造成巨大危害。同时证实其与多种人类肿瘤有明显的相关性,也是人类和多种动物细胞培养中常见的污染物。目前对猪鼻支原体的预防较为困难,暂无理想的抗生素和疫苗。猪鼻支原体攻毒模型是进行致病机理、疫苗评价及药物等研究的基础。本文就目前猪鼻支原体常用攻毒模型的研究进展进行综述。 展开更多
关键词 猪鼻支原体 攻毒模型 研究进展
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猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重PCR检测方法的建立与应用 被引量：11
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作者 刘茂军 王占伟 +4 位作者 韦艳娜 马庆红 杨莉莉 周勇岐 邵国青 《中国兽药杂志》 2012年第9期7-10,共4页
根据猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的16S rRNA基因设计3条引物,建立Mhp和Mhr的双重PCR检测方法,并对该方法进行了特异性和敏感性试验。应用建立的方法检测了临床样品和疫苗样品。结果显示,该方法具有良好的特异性,最低可检测到0.6... 根据猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的16S rRNA基因设计3条引物,建立Mhp和Mhr的双重PCR检测方法,并对该方法进行了特异性和敏感性试验。应用建立的方法检测了临床样品和疫苗样品。结果显示,该方法具有良好的特异性,最低可检测到0.66 ng的Mhp基因组DNA和0.58 ng Mhr基因组DNA。临床样品和疫苗样品检测结果与普通PCR检测结果一致。该双重PCR方法可用于Mhp与Mhr的鉴别、诊断以及疫苗纯粹性检查,快速而准确。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 猪鼻支原体 PCR 检测
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用PCR检测长沙市猪肺炎支原体和猪鼻支原体的感染情况 被引量：11
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作者 王贵平 戴玮 +3 位作者 贾小雅 丁文格 胡仕凤 王亚楠 《养猪》 2011年第3期81-82,共2页
为对长沙市猪支原体肺炎病原流行病学进行初步调查,用PCR方法对从湖南省长沙市5个县(市、区)205头猪中收集的326份病料(205份猪肺和121份猪鼻拭子)分别进行了猪肺炎支原体和猪鼻支原体检测,并对部分基因进行了序列分析。结果发现,猪肺... 为对长沙市猪支原体肺炎病原流行病学进行初步调查,用PCR方法对从湖南省长沙市5个县(市、区)205头猪中收集的326份病料(205份猪肺和121份猪鼻拭子)分别进行了猪肺炎支原体和猪鼻支原体检测,并对部分基因进行了序列分析。结果发现,猪肺炎支原体检出率为24.4%(50/205),猪鼻支原体检出率为22.3%(27/121);长沙市每个县(市、区)的生猪中均存在这两种支原体,其中长沙县生猪阳性率最高(42.4%和31.5%);序列分析表明,检测出的基因序列与国内外相关序列有97%～100%的同源性。本试验证实了猪肺炎支原体和猪鼻支原体在长沙市猪场的存在。 展开更多
关键词 PCR 猪肺炎支原体 猪鼻支原体
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猪鼻支原体感染免疫胶体金快速检测卡的研制 被引量：6
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作者 杨玉萍 刘星 +1 位作者 张丽芳 李红 《中国比较医学杂志》 CAS 2007年第2期84-87,I0001-I0002,共6页
目的研制一种特异、敏感、快速的人猪鼻支原体(M.hyorhinis)感染的胶体金免疫层析法检测卡(GICAs)。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗猪鼻支原体单克隆抗体(McAb),选择并优化层析条件,研制双抗体夹心模式的免疫胶体金检测... 目的研制一种特异、敏感、快速的人猪鼻支原体(M.hyorhinis)感染的胶体金免疫层析法检测卡(GICAs)。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗猪鼻支原体单克隆抗体(McAb),选择并优化层析条件,研制双抗体夹心模式的免疫胶体金检测卡,评价其灵敏度、特异性和稳定性。结果其灵敏度检测限可达到1.72×103CFU/mL,50ng/100μL支原体全菌蛋白,与其他细菌和支原体无非特异性反应,检测用时约10min,4℃可保存6个月以上。结论本文研制的GICAs检测猪鼻支原体特异性强、灵敏度高,无需特殊仪器设备,可用于感染的流行病学调查和临床诊断。 展开更多
关键词 猪鼻支原体 单克隆抗体 胶体金 胶体金免疫层析法
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