采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从耐玉米穗粒腐病自交系R15中分离得到病程相关蛋白1(pathogenesis-related protein 1,PR1)基因的开放阅读框,命名为ZmPR1,测序结果显示该序列长为528bp,编码175个氨基酸,其蛋白质分子质量为18.7ku...采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从耐玉米穗粒腐病自交系R15中分离得到病程相关蛋白1(pathogenesis-related protein 1,PR1)基因的开放阅读框,命名为ZmPR1,测序结果显示该序列长为528bp,编码175个氨基酸,其蛋白质分子质量为18.7ku.利用NCBI/Blastp和Genedoc软件进行同源性比对显示,ZmPR1基因编码蛋白与水稻、小麦、拟南芥等高等植物中的PR1蛋白相似性较高,且具有相同的富含半胱氨酸蛋白(cysteine-rich secretory protein,CAP)的保守结构域.将构建的重组载体pET32a(+)-ZmPR1在宿主菌Escherichia coli BL21中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,在不同的诱导时间、诱导温度和IPTG诱导浓度下对诱导条件进行优化.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果表明,ZmPR1基因的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.6mmol爛L-1,诱导温度28℃,且诱导时间对表达量影响不大.免疫印迹(Western blot)检测证实有39ku的融合蛋白表达,表明ZmPR1基因在大肠杆菌中已成功表达,这为蛋白纯化及单克隆抗体的制备提供了一定的基础.展开更多
研究桑树抗病关键蛋白基因的启动子及其活性,对阐明基因的功能与表达调控机制十分重要。利用Tail-PCR技术成功地从桑树叶片基因组DNA模板中扩增得到病程相关蛋白基因MuP R1-2的启动子,将之命名为pM uP R1-2。利用PlantC ARE软件分析pM u...研究桑树抗病关键蛋白基因的启动子及其活性,对阐明基因的功能与表达调控机制十分重要。利用Tail-PCR技术成功地从桑树叶片基因组DNA模板中扩增得到病程相关蛋白基因MuP R1-2的启动子,将之命名为pM uP R1-2。利用PlantC ARE软件分析pM uP R1-2的核苷酸序列,发现其具有多个转录起始所必需的顺式作用元件以及多种转录因子结合位点,另外还包含多种环境因子响应元件。构建由pM uP R1-2启动GUS基因表达的植物表达载体,通过农杆菌介导的烟草瞬时表达及GUS组织化学染色分析pM uP R1-2具有启动子的功能,证实烟草叶片接种Pst DC3000菌液后能驱动下游报告基因GUS表达,pM uP R1-2具有病原菌诱导表达活性。进一步构建pM uP R1-2稳定表达的转基因拟南芥植株,通过GUS组织化学染色与GUS荧光定量分析发现pM uP R1-2不仅具有病原真菌和细菌诱导表达活性,同时具有可被多种激素诱导表达的特性和组织表达特异性。展开更多
以抗病能力强的伽师瓜和抗病能力较弱的86-1甜瓜作为实验材料,研究甜瓜果实应答链格孢侵染过程中对几丁质酶(CHT)、β-1,3-葡聚糖酶(GLU)活力变化的影响及基因表达规律。伽师瓜和86-1甜瓜接种浓度为1×106个/m L A.alternata孢子悬...以抗病能力强的伽师瓜和抗病能力较弱的86-1甜瓜作为实验材料,研究甜瓜果实应答链格孢侵染过程中对几丁质酶(CHT)、β-1,3-葡聚糖酶(GLU)活力变化的影响及基因表达规律。伽师瓜和86-1甜瓜接种浓度为1×106个/m L A.alternata孢子悬浮液20μL,置于6~8℃冷库贮藏,测定病斑大小,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活力及基因相对表达量。结果表明:损伤接种A.alternata后,伽师瓜和86-1甜瓜均在15 d发病,贮藏过程中伽师瓜果实的发病率及病斑大小均低于86-1甜瓜;甜瓜应答侵染过程中,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活力呈现先升高后下降的趋势,分别于21 d,18 d达到酶活高峰,且接种伽师瓜酶活力显著高于86-1甜瓜(p<0.05),伽师瓜通过增强病程相关酶活力来抵御链格孢的侵染;伽师瓜CHT1、CHT2、GLU基因表达量显著高于86-1甜瓜,分别在贮藏18、18、15 d表达量最大;贮藏0~21 d病程相关蛋白活力及基因相对表达量与病斑直径呈正相关,说明病程相关蛋白在植物抵御病原微生物侵染早期与中期中起到了关键作用,并且在侵染中期作用显著。展开更多
文摘研究桑树抗病关键蛋白基因的启动子及其活性,对阐明基因的功能与表达调控机制十分重要。利用Tail-PCR技术成功地从桑树叶片基因组DNA模板中扩增得到病程相关蛋白基因MuP R1-2的启动子,将之命名为pM uP R1-2。利用PlantC ARE软件分析pM uP R1-2的核苷酸序列,发现其具有多个转录起始所必需的顺式作用元件以及多种转录因子结合位点,另外还包含多种环境因子响应元件。构建由pM uP R1-2启动GUS基因表达的植物表达载体,通过农杆菌介导的烟草瞬时表达及GUS组织化学染色分析pM uP R1-2具有启动子的功能,证实烟草叶片接种Pst DC3000菌液后能驱动下游报告基因GUS表达,pM uP R1-2具有病原菌诱导表达活性。进一步构建pM uP R1-2稳定表达的转基因拟南芥植株,通过GUS组织化学染色与GUS荧光定量分析发现pM uP R1-2不仅具有病原真菌和细菌诱导表达活性,同时具有可被多种激素诱导表达的特性和组织表达特异性。
