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Rab32对禽偏肺病毒C型复制的影响
1
作者 冯旭飞 亓宇翔 +4 位作者 于瀚哲 张正洲 王如嘉 孟闯 董魁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期4041-4050,共10页
为探究Rab32对禽偏肺病毒C型(aMPV/C)复制的影响,将A549细胞接种aMPV/C后进行激光共聚焦显微镜观察,并用Image J软件对所采集图像的共定位系数进行分析;将pCMV-Flag-Rab32、pCMV-Flag、siRab32以及siNC分别转染A549细胞后接种aMPV/C,分... 为探究Rab32对禽偏肺病毒C型(aMPV/C)复制的影响,将A549细胞接种aMPV/C后进行激光共聚焦显微镜观察,并用Image J软件对所采集图像的共定位系数进行分析;将pCMV-Flag-Rab32、pCMV-Flag、siRab32以及siNC分别转染A549细胞后接种aMPV/C,分别采用荧光定量PCR(qPCR)、Western blot和TCID 50检测收集样品中aMPV/C N基因转录水平、aMPV/C N和Rab32蛋白的表达水平以及病毒效价;将pCMV-mcherry-Rab32分别与可融合表达GFP的aMPV/C结构蛋白的重组载体共转染A549细胞,24 h后采用激光共聚焦显微镜观察;将pCMV-Flag-Rab32分别与可融合表达GFP的aMPV/C结构蛋白的重组载体共转染HEK293T细胞,36 h后收集细胞样进行免疫共沉淀试验。结果显示,Rab32与aMPV/C在细胞质中存在明显的共定位;Rab32与aMPV/C的共定位系数极显著高于未接毒组(P<0.01);过表达Rab32后aMPV/C N基因转录水平,Rab32和N蛋白表达水平以及病毒效价均极显著升高(P<0.01);而干扰Rab32表达后,N基因的转录水平,Rab32和N蛋白的表达水平以及病毒效价均极显著降低(P<0.01);Rab32可与多个aMPV/C蛋白(N、F、M、G、SH、P、M2-1、M2-2、L1、L2、L4)在细胞质中存在共定位,而与L3蛋白无明显共定位;IP样品中表达N和M2-2蛋白的样品出现特异性条带,其他蛋白无特异性条带。综上表明Rab32可能通过与aMPV/C N和M2-2蛋白之间的互作从而调控病毒的复制。相关研究结果可为深入阐明Rab32调控aMPV/C复制的分子机理提供研究基础。 展开更多
关键词 Rab32 禽偏肺病毒c型 复制 表达水平 互作
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Rab5对禽偏肺病毒C型复制影响的研究
2
作者 冯旭飞 亓宇翔 +4 位作者 于瀚哲 张正洲 王如嘉 孟闯 董魁 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期447-454,共8页
为探究禽偏肺病毒C型(aMPV/C)感染A549细胞后,脑内Ras类似物5(Rab5)对病毒复制的影响,本研究将重组质粒p GFP-Rab5和负显性突变的Rab5(pGFP-Rab5-DN)分别转染A549细胞,24 h后分别以MOI 1的a MPV/C感染该细胞,48 h后进行激光共聚焦显微... 为探究禽偏肺病毒C型(aMPV/C)感染A549细胞后,脑内Ras类似物5(Rab5)对病毒复制的影响,本研究将重组质粒p GFP-Rab5和负显性突变的Rab5(pGFP-Rab5-DN)分别转染A549细胞,24 h后分别以MOI 1的a MPV/C感染该细胞,48 h后进行激光共聚焦显微镜观察,结果显示Rab5、Rab5-DN和aMPV/C N蛋白均分布于细胞质中,且Rab5与aMPV/C N蛋白存在明显的共定位。进一步采用Image J软件对细胞内的荧光强度分析后发现,Rab5与aMPV/C N蛋白存在多处共定位,而Rab5-DN与aMPV/C N蛋白无明显共定位,表明Rab5参与aMPV/C的复制。将p CMV-Flag-Rab5和p CMV-Flag分别转染A549细胞,24 h后分别以MOI 1的aMPV/C感染该细胞,48 h后分别收集上清和细胞样品。分别采用western blot检测Rab5及aMPV/C N蛋白的表达水平、荧光定量PCR(qPCR)检测a MPV/C N基因转录水平、TCID_(50)检测细胞上清的病毒效价。结果显示,与转染p CMV-Flag的细胞相比,转染p CMV-Flag-Rab5的细胞中Rab5的表达水平明显升高;此外,p CMV-Flag-Rab5转染组中的aMPV/C N蛋白表达水平和N基因的转录水平均极显著升高(P<0.01),病毒效价显著升高(P<0.05)。表明,过表达Rab5促进aMPV/C的复制。将siRab5和siNC分别转染A549细胞,24 h后分别以MOI 1的aMPV/C感染该细胞,48 h后分别收集上清和细胞样品。分别采用western blot检测Rab5及aMPV/C N蛋白的表达水平、q PCR检测aMPV/C N基因的转录水平、TCID_(50)检测细胞上清的病毒效价。结果显示,与转染si NC的细胞相比,转染siRab5的细胞中Rab5的表达水平明显降低;同时,siRab5转染组中aMPV/C N蛋白的表达水平和N基因的转录水平均极显著降低(P<0.01),病毒效价显著降低(P<0.05)。表明,干扰Rab5表达可抑制aMPV/C的复制。将p CMV-mcherry-Rab5与表达融合GFP的aMPV/C结构蛋白的重组质粒分别转染A549细胞,24 h后采用激光共聚焦显微镜观察发现Rab5蛋白与aMPV/C N、F、M、G、SH、P、M2-1、M2-2、L1、L2、L3蛋白均在细胞质中存在荧光信号重叠,但该蛋白与L4蛋白无该现象,表明Rab5蛋白可与多个aMPV/C蛋白共定位。将p CMV-Flag-Rab5分别与表达融合GFP的aMPV/C结构蛋白的重组质粒共转染HEK293T细胞,48 h后采用Co-IP试验检测Rab5与不同aMPV/C结构蛋白的相互作用。结果显示,IP样品中表达G和L2蛋白的位置出现了特异性条带,而其他蛋白无条带,表明Rab5与aMPV/C G和L2蛋白存在互作。上述结果首次证实,Rab5通过与aMPV/C多个蛋白(G和L2)的互作参与aMPV/C的复制机制。本研究为阐明Rab5调控aMPV/C复制的分子机理提供研究借鉴。 展开更多
关键词 脑内Ras类似物5 禽偏肺病毒c型 复制 表达水平 互作
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Rab7对禽偏肺病毒C型体外复制影响的研究
3
作者 冯旭飞 亓宇翔 +4 位作者 于瀚哲 张正洲 王如嘉 孟闯 董魁 《中国家禽》 北大核心 2024年第10期97-105,共9页
为探究禽偏肺病毒C型(aMPV/C)感染A549细胞后,Ras脑内类似物7(Rab7)对病毒复制的影响,试验将融合表达绿色荧光蛋白(GFP)的Rab7重组质粒(pGFP-Rab7)和融合表达GFP的显性负向突变Rab7重组质粒(pGFP-Rab7-DN)分别转染A549细胞并接种aMPV/C... 为探究禽偏肺病毒C型(aMPV/C)感染A549细胞后,Ras脑内类似物7(Rab7)对病毒复制的影响,试验将融合表达绿色荧光蛋白(GFP)的Rab7重组质粒(pGFP-Rab7)和融合表达GFP的显性负向突变Rab7重组质粒(pGFP-Rab7-DN)分别转染A549细胞并接种aMPV/C后,进行激光共聚焦成像,并用Image J软件对荧光图像进行荧光强度分析;随后将pCMV-FlagRab7和pCMV-Flag转染A549细胞并接种aMPV/C,分别采用实时定量PCR(qPCR)、蛋白免疫印记(Western blot)、组织半数感染量(TCID50)检测aMPV/C N基因转录水平、aMPV/C N蛋白表达水平以及病毒效价;将融合表达mcherry的Rab7重组质粒(pCMV-mcherry-Rab7)与表达融合GFP的aMPV/C各结构蛋白分别转染A549细胞,采用激光共聚焦显微镜观察定位情况;最后,将pCMV-Flag-Rab7分别与表达融合GFP的aMPV/C结构蛋白共转染HEK293T细胞进行免疫共沉淀试验,分析两者的互作情况。结果显示:与Rab7-DN相比,Rab7与aMPV/C核蛋白(N)在细胞质中存在多个明显的共定位荧光点;与转染pCMV-Flag组相比,pCMV-Flag-Rab7转染组中aMPV/C N基因的转录水平、N蛋白的表达水平以及病毒效价均显著升高(P<0.05)。相反,与转染无意siRNA(siNC)相比,转染Rab7特异性siRNA(siRab7)后aMPV/C N基因的转录水平、N蛋白的表达水平以及病毒效价均显著降低(P<0.05);Rab7蛋白与多个aMPV/C结构蛋白(N、F、M、G、SH、P、M2-1、M2-2、L1、L2、L3)在细胞质中存在共定位,而Rab7与L4蛋白无此现象;免疫沉淀的样品中只在G和L2蛋白的位置出现了特异性条带。综上所述,Rab7通过与多个蛋白(G和L2)互作从而影响aMPV/C的复制。 展开更多
关键词 Rab7 禽偏肺病毒c型 复制 表达 互作
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Rab10对禽偏肺病毒C型复制影响的研究
4
作者 亓宇翔 于瀚哲 +3 位作者 张正洲 王如嘉 孟闯 冯旭飞 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期292-299,共8页
为探究Rab10对禽偏肺病毒C型(aMPV/C)在A549细胞中复制的影响,将pCMV-GFP-Rab10转染A549细胞后接种aMPV/C,并进行激光共聚焦显微镜观察,结果显示,Rab10和aMPV/C在细胞质中存在多个共定位荧光点,而未接毒对照中未观察到aMPV/C信号和共定... 为探究Rab10对禽偏肺病毒C型(aMPV/C)在A549细胞中复制的影响,将pCMV-GFP-Rab10转染A549细胞后接种aMPV/C,并进行激光共聚焦显微镜观察,结果显示,Rab10和aMPV/C在细胞质中存在多个共定位荧光点,而未接毒对照中未观察到aMPV/C信号和共定位荧光点。用Image J软件进行共定位系数分析,结果显示,Rab10与aMPV/C的共定位系数极显著高于未接毒组(P<0.05);将pCMV-Flag-Rab10、p CMV-Flag、siRab10以及siNC分别转染A549细胞后接种aMPV/C,48 h后收集上清和细胞样品,分别采用荧光定量PCR(q PCR)、Western-blot和TCID50检测aMPV/C N基因转录水平、aMPV/C N和Rab10蛋白的表达水平以及病毒效价。结果显示,过表达Rab10后aMPV/C N基因转录水平、Rab10和N蛋白表达水平以及病毒效价均极显著升高(P<0.05);相反,干扰Rab10表达后N基因的转录水平、Rab10和N蛋白的表达水平以及病毒效价均极显著降低(P<0.05)。这些结果表明,Rab10调控aMPV/C的复制。将pCMV-mcherry-Rab10分别与可融合表达GFP的aMPV/C结构蛋白的重组载体共转染A549细胞,24 h后采用激光共聚焦显微镜观察。结果显示,Rab10可与多个aMPV/C蛋白(N、F、M、G、SH、P、M2-1、M2-2、L1、L2、L3)在细胞质中存在共定位荧光信号,而与L4蛋白无明显共定位。将pCMV-Flag-Rab10分别与可融合表达GFP的aMPV/C结构蛋白的重组载体共转染HEK293T细胞,36 h后收集细胞样进行免疫共沉淀试验。结果显示,IP样品中表达P和M2-1蛋白的样品出现了特异性条带,其他蛋白无特异性条带。上述结果表明,Rab10与aMPV/C P和M2-1蛋白存在互作。综上所述,Rab10通过与aMPV/C P和M2-1蛋白互作从而调控病毒的复制,相关研究结果可为深入阐明Rab10调控aMPV/C复制的分子机理提供研究基础。 展开更多
关键词 Rab10 禽偏肺病毒c型 复制 表达水平 互作
原文传递
Rab18调控禽偏肺病毒C型复制的研究
5
作者 张正洲 王如嘉 +3 位作者 亓宇翔 于瀚哲 孟闯 冯旭飞 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期433-440,共8页
为探究Rab18调控禽偏肺病毒C型(aMPV/C)复制的分子机制,将aMPV/C感染A549细胞后进行激光共聚焦显微镜观察并用Image J软件分析共定位系数。结果显示,Rab18与aMPV/C N蛋白均在细胞质中表达并存在共定位,而未接毒组无明显的N蛋白荧光信号... 为探究Rab18调控禽偏肺病毒C型(aMPV/C)复制的分子机制,将aMPV/C感染A549细胞后进行激光共聚焦显微镜观察并用Image J软件分析共定位系数。结果显示,Rab18与aMPV/C N蛋白均在细胞质中表达并存在共定位,而未接毒组无明显的N蛋白荧光信号,接毒组共定位系数极显著高于未接毒组(P<0.01)。将pCMV-Flag-Rab18、pCMV-Flag、siRab18以及siNC分别转染A549细胞,接种aMPV/C后收集细胞和细胞上清,分别用qPCR、Western-blot以及TCID50检测aMPV/C N基因的转录水平、N蛋白的表达水平以及病毒效价。结果显示,过表达Rab18后aMPV/C N基因的转录水平、N蛋白的表达水平以及病毒效价均极显著升高(P<0.01),而干扰Rab18表达后N基因的转录水平、N蛋白的表达水平以及病毒效价均极显著降低(P<0.01)。将pCMV-mcherry-Rab18分别与可融合表达GFP蛋白的aMPV/C各基因的质粒共转染A549细胞后进行激光共聚焦显微镜观察。结果显示,Rab18均可与aMPV/C各蛋白在细胞质中发生共定位。将pCMV-Flag-Rab18分别与可融合表达GFP蛋白的aMPV/C各基因的质粒共转染HKE293T细胞后进行免疫共沉淀试验。结果显示,Rab18与aMPV/C N、M2-1和L2共表达的IP样品中出现特异性条带,其他蛋白无特异性条带。这些结果表明,Rab18通过与N、M2-1和L2蛋白的互作影响aMPV/C的复制。研究结果为进一步深入解析Rab18调控aMPV/C复制的分子机理奠定了基础。 展开更多
关键词 禽偏肺病毒c型 Rab18 病毒复制 相互作用 表达水平
原文传递
表达增强型绿色荧光蛋白的C型禽偏肺病毒反向遗传系统的构建及优化 被引量：1
6
作者 郭禹 程晶 +2 位作者 左玉柱 范京惠 姜海军 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2091-2100,共10页
【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protei... 【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)插入C型aMPV(aMPV/C)基因组中,构建表达EGFP的重组aMPV,并使用不同的载体及启动子构建aMPV迷你基因组,来优化aMPV反向遗传操作系统(reverse genetic system,RGS)的构建。【方法】将EGFP插入pBluescript-aMPV RGS的P和M蛋白之间非编码区并进行拯救,观察绿色荧光蛋白的表达情况,同时测定重组病毒滴度及遗传稳定性。为优化RGS的构建,采用含有T7启动子的pBluescript SK(+)和含有T7、CMV启动子的pcDNA3.1两种载体构建aMPV迷你基因组。首先将aMPV/C基因组两端的先导区(leader)和尾随区(trailer)与EGFP的cDNA进行PCR扩增,并切胶回收;其次将各胶回收片段按照leader-EGFP-trailer的顺序进行无缝克隆连接,并测序验证;最后将连接完整的迷你基因组反向插入两个载体中,构建aMPV/C的迷你基因组(pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C)。在拯救迷你基因组的试验中,将两个aMPV/C迷你基因组与3个表达N、P和L蛋白的质粒共转染到BHK-21细胞中,观察绿色荧光蛋白的表达情况。【结果】拯救的aMPV-EGFP重组病毒测序结果显示,EGFP已成功插入aMPV基因组中,并在前3代aMPV-EGFP重组病毒中稳定表达。aMPV-EGFP重组病毒滴度在感染96 h后达到105.5 TCID 50/mL。而pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个重组质粒的测序结果也证明了含有EGFP的aMPV迷你基因组构建完成。将3个重组质粒分别与辅助质粒共转染至BHK-21细胞中,转染24 h后观察到细胞中绿色荧光蛋白表达,证明aMPV-EGFP重组病毒及pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个aMPV迷你基因均都成功表达了EGFP。【结论】本研究成功构建了两个aMPV迷你基因组并拯救了aMPV-EGFP重组病毒,重组病毒具有良好的遗传稳定性。而CMV和T7作为aMPV/C RGS中的启动子时,二者的拯救效率相同。pBluescript SK(+)和pcDNA3.1均可用于aMPV/C RGS的构建,本研究为aMPV/C RGS的构建提供了多种方法。 展开更多
关键词 c型禽偏肺病毒 迷你基因组 反向遗传系统 cMV启动子 增强绿色荧光蛋白 T7启动子
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引起种(蛋)鸭输卵管积液综合征的新发病毒——C型禽偏肺病毒 被引量：2
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作者 傅秋玲 江南松 +12 位作者 梁齐章 刘荣昌 万春和 程龙飞 陈红梅 林琳 焦文龙 吴胜会 江斌 郑小兰 林建生 傅光华 黄瑜 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期1387-1394,共8页
【目的】明确引起种(蛋)鸭特征性输卵管积液和产蛋下降的新发疫病[俗称种(蛋)鸭输卵管积液综合征]的病原。【方法】对自闽粤赣浙皖桂等地产蛋率较高的部分鸭群表现以输卵管内乳糜性积液、黏膜出血水肿增厚及不同程度产蛋下降为特征的病(... 【目的】明确引起种(蛋)鸭特征性输卵管积液和产蛋下降的新发疫病[俗称种(蛋)鸭输卵管积液综合征]的病原。【方法】对自闽粤赣浙皖桂等地产蛋率较高的部分鸭群表现以输卵管内乳糜性积液、黏膜出血水肿增厚及不同程度产蛋下降为特征的病(死)麻鸭、樱桃谷种鸭和种番鸭中采集的样品(输卵管积液、输卵管黏膜、卵巢和肝脾脏器),开展鸭已知病原核酸监测、病原分离鉴定和开产麻鸭人工感染试验。【结果】细菌分离显示,输卵管积液里未分离到细菌,排除细菌感染引起;经病毒核酸监测,只有C型禽偏肺病毒(Avain metapneumoviurs subgroup C,aMPV/C)阳性,未检测到其他引起禽产蛋异常的病毒;以aMPV/C单一阳性的样品经鸭胚进行病毒分离与传代,发现接种鸭胚未见死亡,但胚体表面稍水肿和出血、肝脏出血;对第5代鸭胚液进行RT-PCR检测,结果显示a MPV/C分离阳性率为72.2%;对获得的4株分离株(JX2126、FJ2228、FJ2375和GD2381株)的基因片段进行测序和序列分析发现,该片段与最早报道的番鸭a MPV/C法国分离株(Muscovy duck/1999/99178/France)同源性最高,为96.1%,而与A、B、D型禽偏肺病毒(Avain metapneumoviurs subgroup A,B,D,aMPV/A,B,D)分离株的同源性仅分别为67.8%~68.7%、66.1%~66.8%和71.4%,与人偏肺病毒(Human metapneumoviurs,hMPV)分离株的同源性为67.7%~68.3%;遗传进化分析表明,以上4株分离株与a MPV/C处于同一进化分支上,而与其他亚型aMPV和hMPV亲缘关系较远;经开产麻鸭人工感染试验,成功复制出与自然感染病例相同的临床病症,并能回收到病毒。【结论】明确引起种(蛋)鸭输卵管积液综合征的病原为C型禽偏肺病毒。本研究为该病的快速准确诊断和精准防控提供科学依据。 展开更多
关键词 种(蛋)鸭 输卵管积液综合征 产蛋下降 输卵管积液 c型禽偏肺病毒 分离与鉴定
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C型禽偏肺病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用 被引量：5
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作者 陈基明 张文 +5 位作者 赵长润 何怡宁 王海勇 韦平 韦天超 磨美兰 《中国家禽》 北大核心 2018年第17期17-21,共5页
根据GenBank发表的禽偏肺病毒(aMPV)F基因序列,设计一对特异性引物,建立C亚型aMPV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。对该反应体系进行条件优化,建立了标准曲线,并进行特异性、敏感性及重复性试验,然后将建立的方法应用于临床样品和... 根据GenBank发表的禽偏肺病毒(aMPV)F基因序列,设计一对特异性引物,建立C亚型aMPV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。对该反应体系进行条件优化,建立了标准曲线,并进行特异性、敏感性及重复性试验,然后将建立的方法应用于临床样品和攻毒样品的检测。结果显示:标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系;建立的方法只能检测出C亚型aMPV,最低可以检测到0.8×10~1拷贝/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于4%。应用建立的方法对43份临床样品检测,结果显示均为阴性;对42份35日龄SPF鸡人工感染后1～21 d的气管和肺脏样品进行检测,结果显示攻毒样品均为阳性。因此,研究建立的特异、灵敏、重复性好的C型aMPV实时荧光定量PCR方法,既可适合于该病的早期诊断和流行病学调查,又为该病毒的致病机制研究提供技术支撑。 展开更多
关键词 c型禽偏肺病毒 基因 SYBR Green Ⅰ 荧光实时定量PcR
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