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欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA检测方法的建立 被引量：3
1
作者 阮宝阳 王林 +6 位作者 宫晓倩 刘晓敏 张鹏 汪琪 李泽君 童光志 于海 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2016年第2期13-19,共7页
本研究利用原核表达并纯化的重组蛋白pCold TF-HA1作为包被抗原,建立欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体的间接ELISA检测方法。通过反应条件的优化,确定了间接ELISA最佳工作条件：抗原最佳包被浓度为800 ng/孔,血清稀释度为1：200,封闭时间... 本研究利用原核表达并纯化的重组蛋白pCold TF-HA1作为包被抗原,建立欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体的间接ELISA检测方法。通过反应条件的优化,确定了间接ELISA最佳工作条件：抗原最佳包被浓度为800 ng/孔,血清稀释度为1：200,封闭时间为1 h,一抗血清最佳作用时间为2 h,酶标二抗最佳稀释度为1：40 000,二抗最佳作用时间为1 h,TMB显色时间为7 min。阴/阳性血清的判断结果分别为OD450≤0.255和OD450≥0.292,介于两者之间为可疑。符合性试验结果显示,建立的间接ELISA方法与血凝抑制（haemagglutination inhibition,HI）检测的阳性率分别为53.27%和49.53%,两者总复合率达96.27%。特异性试验结果显示,该方法与古典H1N1亚型和H3N2亚型猪流感阳性血清无交叉反应。通过重复性试验表明,同一批制备的重组蛋白包被96孔酶标板,检测OD450值的批内变异系数为1.97%-7.85%,批间变异系数为1.94%-6.93%。总之,本研究建立的禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA方法,具有敏感性较高、特异性强、重复性好的特点,为猪流感抗体检测提供了一种准确、快捷、简便、有效的技术手段,可用于禽源H1N1亚型猪流感抗体检测和流行病学调查。 展开更多
关键词 欧洲禽源h1n1猪流感病毒 重组蛋白 间接ELISA 特异性
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H3N2亚型猪流感病毒HA1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
2
作者 司维 谭茜宇 +3 位作者 徐玲芸 罗廷荣 李晓宁 顾金燕 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第4期1739-1749,共11页
【目的】获得免疫原性良好的H3N2亚型猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)血凝素(haemagglutinin, HA)头部结构域HA1蛋白,并制备特异性多克隆抗体,用于HA1蛋白的鉴定及功能研究。【方法】本研究通过扩增A型SIV(A/swine/Guangdong/04... 【目的】获得免疫原性良好的H3N2亚型猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)血凝素(haemagglutinin, HA)头部结构域HA1蛋白,并制备特异性多克隆抗体,用于HA1蛋白的鉴定及功能研究。【方法】本研究通过扩增A型SIV(A/swine/Guangdong/04/2005(H3N2))毒株的HA1片段,采用同源重组方法构建原核表达载体pET-28a(+)-H3N2-HA1,经PCR和测序鉴定正确后将重组阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。对HA1蛋白表达条件(诱导温度、诱导时间、IPTG浓度)进行优化,通过镍柱亲和层析法纯化蛋白。将获得的重组蛋白与QuickAntibody-Mouse3W佐剂混合后以肌内注射方式免疫BALB/c小鼠,制备H3N2亚型SIV HA1蛋白多克隆抗体,并通过ELISA、Western blotting和免疫荧光试验(IFA)对多克隆抗体的效价、反应性及特异性进行鉴定。【结果】本研究成功构建原核表达载体pET-28a(+)-H3N2-HA1;H3N2亚型SIV HA1重组蛋白在1 mmol/L IPTG 26℃诱导10 h时表达量最高,且主要以包涵体形式表达,蛋白分子质量大小约为39.5 ku。成功制备5株H3N2亚型SIV HA1蛋白多克隆抗体,效价均为1∶1 638 400。Western blotting和IFA鉴定结果显示,制备的多克隆抗体可特异性识别真核表达的H3N2亚型SIV HA1蛋白,与H1N1亚型SIV、H7N9亚型禽流感病毒(AIV)等其他亚型流感病毒的HA1蛋白均不发生反应,具有良好的反应性及特异性。【结论】本研究成功表达并纯化了免疫原性良好的H3N2亚型SIV HA1蛋白,制备了反应性及特异性良好的鼠源多克隆抗体,为深入研究H3N2亚型SIV HA1蛋白的生物学功能提供了重要工具。 展开更多
关键词 猪流感病毒(SIV) h3n2亚型 hA1蛋白 原核表达 多克隆抗体
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重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒疫苗株的构建及免疫保护效力 被引量：2
3
作者 阮宝阳 宫晓倩 +8 位作者 刘晓敏 汪琪 张鹏 汪秀会 王振勇 李泽君 王林 童光志 于海 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期2106-2112,2118,共8页
以国内欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒流行株A/swine/Shanghai/1/2014(H1N1)(SH1)为材料,RT-PCR扩增HA和NA基因并将其克隆至PBD载体中,构建HA和NA基因的重组质粒。将HA和NA基因重组质粒及来源于流感病毒高产株PR8的6个内部基因(PB2、PB1、P... 以国内欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒流行株A/swine/Shanghai/1/2014(H1N1)(SH1)为材料,RT-PCR扩增HA和NA基因并将其克隆至PBD载体中,构建HA和NA基因的重组质粒。将HA和NA基因重组质粒及来源于流感病毒高产株PR8的6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)重组质粒共转染293T细胞,从而成功构建了重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒疫苗株SH/PR8。以相同病毒剂量接种MDCK细胞,检测不同时间点的血凝效价,绘制病毒生长曲线,结果表明,重组病毒SH/PR8相对于原始野生株SH1在MDCK细胞上具有更高的病毒滴度。重组病毒SH/PR8制备的灭活疫苗经过一免和二免小鼠后,检测血清中血凝抑制抗体、中和抗体和IgG抗体,结果显示首免后抗体效价持续升高,4周后抗体效价达到峰值。小鼠攻毒试验结果表明,免疫组体质量下降不明显且未出现死亡,而非免疫组小鼠体质量持续下降并且于攻毒后6d小鼠出现100%死亡。肺脏组织病毒含量滴定以及组织病理学观察结果显示,免疫组能够有效抑制SH1病毒在肺脏中的复制,减轻肺脏病理变化。总之,本研究表明重组SH/PR8疫苗候选株相对于原始毒株SH1在MDCK细胞上具有更高的复制能力,制备的重组灭活疫苗能够诱导机体产生高水平的抗体,能够针对欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒的攻击提供很好的免疫保护。 展开更多
关键词 h1n1亚型 猪流感病毒 反向遗传 抗体效价 免疫保护
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中国“人-猪-禽”基因重排H1N2亚型猪流感病毒全基因克隆及遗传进化的研究 被引量：15
4
作者 陈义祥 蒙雪琼 +7 位作者 刘棋 黄夏 黄胜斌 刘翠权 施开创 郭建刚 陈芳芳 胡丽萍 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期466-472,共7页
【目的】为了研究2006年从广西病猪肺组织中分离的H1N2亚型猪流感病毒(SIV)A/Swine/Guangxi/13/2006(H1N2)(Sw/GX/13/06)的遗传学特性和8个基因的来源。【方法】运用RT-PCR方法对其全基因进行了克隆并运用分子生物学软件对其基因序列进... 【目的】为了研究2006年从广西病猪肺组织中分离的H1N2亚型猪流感病毒(SIV)A/Swine/Guangxi/13/2006(H1N2)(Sw/GX/13/06)的遗传学特性和8个基因的来源。【方法】运用RT-PCR方法对其全基因进行了克隆并运用分子生物学软件对其基因序列进行了遗传进化分析。【结果】血凝素(HA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)基因来源于猪古典H1N1亚型流感病毒;神经氨酸酶(NA)和聚合酶蛋白(PB1)基因来源于人的H3N2亚型流感病毒;聚合酶蛋白(PA)和聚合酶蛋白(PB2)基因来自于禽流感病毒。【结论】可见Sw/GX/13/06是一株"人-猪-禽"三源基因重排H1N2亚型SIV,且与美国(1999?2001年)和韩国(2002年)分离到该型病毒的有明显的亲缘关系。据我们所知,这是中国首次报道含有禽流感病毒基因片段的重排H1N2SIV,该病毒是否对养猪业和人类公共卫生健康具有潜在的威胁,有待于进一步研究。 展开更多
关键词 猪流感病毒 h1n2亚型 基因重排 遗传进化
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一株人源H1N1亚型猪流感病毒的进化分析与生物学特性研究 被引量：16
5
作者 唐续 杨焕良 +8 位作者 鄢明华 李秀丽 陈艳 孟沙沙 尹航 辛晓光 步志高 乔传玲 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期270-273,336,共5页
为了解猪流感病毒(SIV)的变异情况,我们2009年11月从河北某养殖场采集呈流感症状的猪鼻拭子40份,接种10日龄SPF鸡胚,分离到一株猪流感病毒,通过RT-PCR和血凝抑制试验鉴定为H1N1亚型,命名为A/swine/Hebei/15/2009(H1N1),其全基因序列测... 为了解猪流感病毒(SIV)的变异情况,我们2009年11月从河北某养殖场采集呈流感症状的猪鼻拭子40份,接种10日龄SPF鸡胚,分离到一株猪流感病毒,通过RT-PCR和血凝抑制试验鉴定为H1N1亚型,命名为A/swine/Hebei/15/2009(H1N1),其全基因序列测定及同源性分析发现,8个基因片段均与2000年左右H1N1人流感病毒有较高的同源性。系统遗传演化显示,该病毒分离株是由2000年人源H1N1流感病毒A/Dunedin/2/2000(H1N1)进化而来。抗原性分析显示该株与甲型H1N1流感病毒和经典H1N1病毒株抗原性差异较大。对小鼠致病性试验表明该病毒株可以直接感染小鼠并导致小鼠轻微临床症状和组织病理学变化,但不致死小鼠,表现为低致病性。 展开更多
关键词 猪流感病毒 人源h1n1亚型 遗传演化分析 抗原性分析 致病性
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一株类禽型H1N1亚型猪流感病毒的反向遗传系统的建立 被引量：9
6
作者 孟沙沙 乔传玲 +5 位作者 陈艳 杨焕良 刘丽萍 尹航 辛晓光 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期91-94,共4页
为建立H1N1亚型猪流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(JS40)的反向遗传系统,本研究分别构建了JS40株8个基因节段的重组质粒,经转染293T和MDCK混合细胞,拯救出病毒R-JS40。序列测定结果表明,救获病毒与亲本病毒的核苷酸序列一致,无氨基酸变... 为建立H1N1亚型猪流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(JS40)的反向遗传系统,本研究分别构建了JS40株8个基因节段的重组质粒,经转染293T和MDCK混合细胞,拯救出病毒R-JS40。序列测定结果表明,救获病毒与亲本病毒的核苷酸序列一致,无氨基酸变异,可以稳定传代;抗原性未发生变化;对小鼠的致病性结果显示R-JS40与JS40对小鼠的组织嗜性以及在肺脏中复制的病毒滴度基本一致。以上结果表明R-JS40保持了亲本病毒JS40的生物学特性,该病毒反向遗传操作系统的建立,为进一步开展病毒的致病分子基础以及新型疫苗的研制提供有效的技术平台。 展开更多
关键词 猪流感病毒 类禽型 h1n1 反向遗传系统
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反向遗传操作技术产生全禽源致弱的H5N1亚型禽流感病毒的免疫保护性试验 被引量：7
7
作者 石火英 张小荣 +2 位作者 孙学辉 刘慧谋 刘秀梵 《中国家禽》 北大核心 2005年第17期11-13,共3页
利用反向遗传操作技术产生致弱的8基因全禽源的H5N1亚型禽流感病毒rgF-H5△N1,经甲醛灭活制成油苗免疫SPF鸡和有母源抗体的商品鸡。比较拯救的重配病毒rgF-H5△N1和野毒H5N1亚型禽流感病毒油苗免疫后的抗体应答水平、攻毒后发病率和死... 利用反向遗传操作技术产生致弱的8基因全禽源的H5N1亚型禽流感病毒rgF-H5△N1,经甲醛灭活制成油苗免疫SPF鸡和有母源抗体的商品鸡。比较拯救的重配病毒rgF-H5△N1和野毒H5N1亚型禽流感病毒油苗免疫后的抗体应答水平、攻毒后发病率和死亡率等指标,评价其免疫和交叉免疫保护作用。结果表明:反向遗传操作技术为构建新型的流感疫苗株提供了更好的方法。 展开更多
关键词 反向遗传操作技术 禽流感病毒 疫苗 免疫保护作用 h5n1亚型 操作技术 反向遗传 保护性试验 致弱 禽源
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欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立 被引量：2
8
作者 汪琪 杨海明 +13 位作者 汪秀会 刘晓敏 王帅勇 姚云 朱世强 单同领 童武 周艳君 李国新 郑浩 高飞 姜一峰 童光志 于海 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2018年第3期23-27,共5页
为了构建猪流感病毒A/swine/Tian Jin/6/2013(H1N1)的反向遗传操作技术平台,通过RT-PCR技术分别扩增了欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的8个基因片段,并分别连接至双向转录表达载体p BD上。纯化8个重组质粒,共转染到293T细胞。54 h后收集上... 为了构建猪流感病毒A/swine/Tian Jin/6/2013(H1N1)的反向遗传操作技术平台,通过RT-PCR技术分别扩增了欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的8个基因片段,并分别连接至双向转录表达载体p BD上。纯化8个重组质粒,共转染到293T细胞。54 h后收集上清,并接种到MDCK细胞。待细胞病变明显时,进行血凝试验检测收集到的上清,测得血凝效价为1∶32。测定拯救病毒的全基因组序列,结果显示,在核苷酸序列上,拯救病毒与野生病毒完全一致。细胞病变情况显示,拯救毒株与野生毒株无明显差别。本研究成功拯救了欧洲类禽H1 N1亚型猪流感病毒,为猪流感病毒的致病机理、基因功能研究以及H1N1亚型猪流感病毒新型疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 猪流感病毒 病毒拯救 生长曲线 h1n1亚型
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H1N1亚型猪流感病毒SW/HN/405/10株神经氨酸酶基因来源的探究
9
作者 王俊亚 周云飞 +4 位作者 朱春平 刘媛媛 张晓娟 崔保安 李新生 《中国农学通报》 CSCD 2013年第14期21-25,共5页
为了研究H1N1亚型猪流感遗传演化与变异的特性,2010年2月从河南省某发病猪场采集疑似猪流感的病猪鼻拭子,通过鸡胚尿囊腔传代接种法分离病毒,利用血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)及RT-PCR方法对病毒分离株进行鉴定,并对分离株的NA基因... 为了研究H1N1亚型猪流感遗传演化与变异的特性,2010年2月从河南省某发病猪场采集疑似猪流感的病猪鼻拭子,通过鸡胚尿囊腔传代接种法分离病毒,利用血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)及RT-PCR方法对病毒分离株进行鉴定,并对分离株的NA基因进行了序列扩增及遗传进化分析。结果表明:分离到一株H1N1病毒,命名为A/swine/Henan/405/2010(H1N1)(SW/HN/405/10);同源性分析结果发现:分离毒株NA基因与GeneBank中登录的类禽型H1N1流感病毒代表株有较高的同源性(92.1%～99.4%),与A/swine/HongKong/NS62/2005的同源性最高;NA核苷酸序列分析发现:没有核苷酸插入或缺失,其酶活性中心,二硫键及糖基化位点高度保守,但抗原位点有变异;系统进化树分析发现:该分离株的NA基因与类禽型H1N1猪流感病毒进化关系最近且处于同一分支上。由此推测该分离株NA基因可能来源于类禽型H1N1猪源谱系,遗传特征相对稳定,但同时也发生了一定的变异,说明该分离株还在不断地变异和演化。 展开更多
关键词 猪流感病毒 h1n1亚型 nA基因 分离鉴定 序列分析
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一株类禽H1N1亚型猪流感病毒的进化研究
10
作者 唐续 贺东生 +5 位作者 裴仉福 李琳 刘好朋 张显浩 李冰 陈瑞爱 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第11期142-145,共4页
为了解猪流感病毒(SIV)的变异情况,2013年1月份从山西某养殖场采集呈流感症状的猪鼻拭子10份,采用常规方法接种10日龄SPF鸡胚,进行RT-PCR鉴定及全基因序列分析。结果表明:分离到1株类禽H1N1亚型猪流感病毒,命名为A/swine/Shanxi/02/2013... 为了解猪流感病毒(SIV)的变异情况,2013年1月份从山西某养殖场采集呈流感症状的猪鼻拭子10份,采用常规方法接种10日龄SPF鸡胚,进行RT-PCR鉴定及全基因序列分析。结果表明:分离到1株类禽H1N1亚型猪流感病毒,命名为A/swine/Shanxi/02/2013(H1N1);全基因序列测定及同源性分析发现,8个基因片段均与2011年江苏地区流行的类禽型H1N1亚型猪流感病毒有较高的同源性;系统遗传演化发现,该病毒株是由2011年类禽型H1N1流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)进化而来的;HA1氨基酸位点差异分析发现,该病毒株与2009年人群中流行的甲型H1N1流感和经典H1N1毒株抗原性差异较大,其HA裂解位点基序为PSIQSRGLF,呈低致病性特征。 展开更多
关键词 猪流感病毒(SIV) 类禽h1n1亚型 遗传演化分析 抗原性分析
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H1N1亚型猪流感病毒HA1基因原核表达及鉴定 被引量：1
11
作者 阮宝阳 王林 +10 位作者 宫晓倩 汪秀会 刘晓敏 汪琪 单同领 李泽君 刘芹防 陈鸿军 滕巧泱 童光志 于海 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2015年第4期14-18,共5页
本研究利用RT-PCR技术扩增禽源H1N1亚型猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的HA1基因片段,将其连接至p Cold-TF载体上,菌液鉴定为阳性的克隆经测序验证正确后,提取质粒转化至高表达的表达宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导并大量表达目... 本研究利用RT-PCR技术扩增禽源H1N1亚型猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的HA1基因片段,将其连接至p Cold-TF载体上,菌液鉴定为阳性的克隆经测序验证正确后,提取质粒转化至高表达的表达宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导并大量表达目的蛋白。表达产物经过纯化及SDS-PAGE电泳分析,表明重组蛋白以可溶性形式在上清中大量表达,大小约90 k Da,且在15℃、0.8 mmol/L IPTG条件下诱导24 h表达效果最好。通过Ni柱纯化后,经Western blot分析表明重组表达的蛋白能与禽源H1N1亚型SIV阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性。 展开更多
关键词 hA1基因 禽源h1n1亚型猪流感病毒 原核表达 可溶性 抗原性
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一株新型三源重配H1N2亚型猪流感病毒的进化分析及对小鼠的感染性研究 被引量：1
12
作者 钟秋 张丹丹 +6 位作者 宋祖晨 孟飞 陈艳 乔传玲 陈化兰 曹允考 杨焕良 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期861-866,共6页
为了研究我国广西地区流行的猪流感病毒分子特征和感染性,本研究对分离自广西临床健康猪群中的H1N2亚型猪流感病毒(SIV)A/swine/Guangxi/238/2018(H1N2)(简称GX238株)进行了分子进化分析和致病性研究。扩增该病毒株8个基因节段后进行分... 为了研究我国广西地区流行的猪流感病毒分子特征和感染性,本研究对分离自广西临床健康猪群中的H1N2亚型猪流感病毒(SIV)A/swine/Guangxi/238/2018(H1N2)(简称GX238株)进行了分子进化分析和致病性研究。扩增该病毒株8个基因节段后进行分子进化分析,结果显示其8个节段均与2015年~2016年在美国分离的H1N2亚型SIV有高度同源性(98.9%~99.7%),其中HA基因可能来自于2009年之前的人季节性H1N1亚型流感病毒,PB2、PB1、PA、NP、NA和NS可能来自北美三重配H1N2亚型SIV,M基因可能来自H1N1/2009。以106 EID50 SIV GX238株病毒鼻腔感染BALB/c小鼠后记录小鼠的体质量变化及死亡情况,感染后第3 d检测小鼠各脏器病毒复制情况。结果显示,感染组小鼠体质量与PBS对照组小鼠相比有明显下降趋势,感染小鼠40%死亡;在小鼠肺脏和鼻甲中病毒滴度分别达6.3 Log10EID50/mL、4.8 Log10EID50/mL,表明该病毒对小鼠表现出中等的致病力。本研究结果表明输入型SIV持续对我国猪群造成威胁,凸显了在世界范围内开展猪流感监测的必要性。 展开更多
关键词 猪流感病毒 h1n2亚型 序列分析 致病性
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H1N1亚型猪流感病毒中国分离株血凝素基因分子演化的研究 被引量：20
13
作者 陈君彦 李海燕 +3 位作者 申之义 陈化兰 于康震 毕英佐 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期13-17,共5页
对 2 0 0 1年中国华南及东北地区的 15株H1N1亚型猪流感病毒 (SIV)分离株的血凝素 (HA)基因进行了序列测定和分析 ,并绘制了进化树。研究结果表明 ,15株H1N1SIV和HA基因核苷酸全长为 1778bp ,共编码 5 6 6个氨基酸 ;而且 ,15株H1N1亚型... 对 2 0 0 1年中国华南及东北地区的 15株H1N1亚型猪流感病毒 (SIV)分离株的血凝素 (HA)基因进行了序列测定和分析 ,并绘制了进化树。研究结果表明 ,15株H1N1SIV和HA基因核苷酸全长为 1778bp ,共编码 5 6 6个氨基酸 ;而且 ,15株H1N1亚型SIV的HAI蛋白在 10、11、2 3、87、2 87位都存在高度保守的糖基化位点 ,此外 ,在 2 76位多了一个“_NTT_”糖基化位点 ,与参考毒株SW /IW / 93/ 0 1一致 ,这可能是近期H1N1亚型SIV的一个分子特征。本研究进一步发现 ,15株H1N1亚型SIV的HA基因切割位点氨基酸组成为IPSIQSR↓G ,具有非高致病力毒株分子特征 ;而其受体结合位点在HA蛋白上第 2 2 6位是Q ,第 2 2 8位是G ,可能具有感染禽的潜力。经同源性比较 ,15株H1N1亚型SIV的HA基因与古典型H1N1猪谱系中的WIS/ 4 75 4 / 94的同源性相对最高 ,核苷酸和氨基酸序列同源性分别达到 95 7%～ 96 1%和96 5 %～ 97 2 %。由同源性比较结果和进化树分析可见 。 展开更多
关键词 h1n1亚型 猪流感病毒 中国分离株 血凝素基因 分子演化 序列分析
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实时荧光定量PCR检测H1N1亚型猪流感病毒 被引量：21
14
作者 段廷云 陈红英 +3 位作者 崔保安 魏战勇 李新生 王学斌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期752-756,共5页
根据GenBank中H1N1亚型猪流感病毒NP基因的序列(DQ889686),利用Premier express设计并合成1对引物和相应的TaqMan探针,从猪流感病毒HN407株接种的鸡胚尿囊液中提取总RNA,经RT-PCR扩增NP基因。将鉴定正确的NP基因片段克隆入pGEM-T Easy... 根据GenBank中H1N1亚型猪流感病毒NP基因的序列(DQ889686),利用Premier express设计并合成1对引物和相应的TaqMan探针,从猪流感病毒HN407株接种的鸡胚尿囊液中提取总RNA,经RT-PCR扩增NP基因。将鉴定正确的NP基因片段克隆入pGEM-T Easy载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒。以该阳性重组质粒为荧光定量PCR标准品模板建立标准曲线。对探针浓度、引物浓度、镁离子浓度和退火温度进行优化,建立了最佳的荧光定量PCR反应体系和扩增程序。经临床应用表明荧光定量PCR的建立为早期诊断猪流感病毒、定量分析猪流感病毒感染程度奠定了基础。 展开更多
关键词 猪流感病毒 h1n1亚型 荧光定量PCR
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2009～2013年广西H1N1和H3N2亚型猪流感病毒血清学调查 被引量：8
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作者 陈樱 於庆雄 +9 位作者 银凤桂 薛辉 李法凯 莫彦宁 肖雄 杨文娟 韦祖樟 刘芳 蹇慧 黄伟坚 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期155-159,共5页
摘要：【目的】了解广西H1N1和H3N2亚型猪流感病毒（SIV）的存在形势及其流行规律，为下一步有效监测和防控猪流感（SI）提供理论依据和原始溯源。【方法】对2009～2013年于广西11个地级市的屠宰场、规模化养猪场和个体养殖户采集的117... 摘要：【目的】了解广西H1N1和H3N2亚型猪流感病毒（SIV）的存在形势及其流行规律，为下一步有效监测和防控猪流感（SI）提供理论依据和原始溯源。【方法】对2009～2013年于广西11个地级市的屠宰场、规模化养猪场和个体养殖户采集的1170份猪血清进行血凝抑制（Hr）试验检测，统计欧洲禽源H1N1（EA．H1N1）亚型和新型人源重组H3N2（Hu．H3N2）亚型4株毒株（LB144和BB2、NNXD和JGB4）的抗体阳性率，并分析H1N1和H3N2亚型毒株的存在形势及其流行规律。【结果】2009-2013年，EA．H1N1亚型LB144毒株的平均抗体阳性率高达20．68％，且保持稳定，是广西地区主要的流行毒株；Hu．H3N2亚型JGB4毒株从2010年开始流行，且呈逐渐蔓延的趋势，平均抗体阳性率为19．96％。广西北海、南宁、玉林、贺州、桂林、贵港和柳州市受到EA—H1N1和Hu—H3N2亚型毒株多重感染，且感染程度较严重；百色、河池和防城港市的感染程度相对较低。育肥猪最易感染SIV，尤其是BB2和JGB4毒株，其抗体阳性率分别达66．00％和40．00％。EA—H1N1亚型毒株间的交叉感染阳性率（21．52％）略低于Hu—H3N2亚型毒株间的交叉感染阳性率（27．45％），而两株不同亚型毒株交叉感染时以BB2与JGB4毒株的交叉感染阳性率最高（16．23％），3株交叉感染时以BB2、NNXD和JGB4毒株间的交叉感染阳性率最高（11．60％），4株同时交叉感染阳性率也有6．96％。【结论】广西猪群已普遍存在EA-H1N1和Hu．H3N2亚型毒株混合感染的现象，尤其是地处两省边界上的地级市感染更严重，并以育肥猪和保育猪较易感。因此在sI防控工作中，除做好哺乳仔猪和种猪的日常管理外，还应减少保育猪的外来应激，适当调整育肥猪的饲养密度，以减少新型SIV重组毒株的产生。 展开更多
关键词 猪流感病毒(SIV) h1n1亚型 h3n2亚型 血清学调查 重组毒株
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H1N1亚型猪流感病毒HA基因的表达及单克隆抗体的制备 被引量：7
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作者 张祥斌 谢青梅 +4 位作者 马静云 曹永长 冀君 李少璃 毕英佐 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期962-967,共6页
采用RT-PCR方法扩增了H1N1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的血凝素(HA)基因,测序后对HA基因进行了生物信息学分析。将HA基因克隆到高效可溶表达载体pBCX上,成功构建重组表达质粒pBCX-HA。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进... 采用RT-PCR方法扩增了H1N1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的血凝素(HA)基因,测序后对HA基因进行了生物信息学分析。将HA基因克隆到高效可溶表达载体pBCX上,成功构建重组表达质粒pBCX-HA。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达。诱导表达的HA融合蛋白分子质量约为94.0 ku,表达产物占菌体总蛋白的29.5%。经Western-blot分析证实可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。用纯化的HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选,成功筛选到2株针对HA蛋白抗原表位的单克隆抗体;ELISA结果表明,制备的SIV单克隆抗体ⅢF6A4C10与H1N1亚型SIV抗原具有特异的免疫反应性,为H1N1 SIV的鉴别诊断奠定了基础。 展开更多
关键词 h1n1亚型猪流感病毒 血凝素 高效可溶表达 单克隆抗体
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表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及其免疫原性 被引量：5
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作者 吴运谱 乔传玲 +4 位作者 杨焕良 陈艳 展小过 辛晓光 陈化兰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期1363-1369,共7页
RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株的HA基因,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-H5 HA-EGFP。采用Ad-Max同源重组系统和共转染技术,构建了表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因的复制缺陷型重组腺病毒(rAd-H5 HA-EGFP)。经目的基... RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株的HA基因,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-H5 HA-EGFP。采用Ad-Max同源重组系统和共转染技术,构建了表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因的复制缺陷型重组腺病毒(rAd-H5 HA-EGFP)。经目的基因PCR检测及序列测定,结果表明:HA基因已经正确地插入到腺病毒的基因组中;通过RT-PCR检测与Western blot分析,结果表明:HA基因能够进行正确转录,并且所表达的蛋白具有相应的生物学活性。子代重组腺病毒rAd-H5 HA-EGFP经增殖、纯化后感染性滴度可达2.26×1010TCID50mL-1。rAd-H5 HA-EGFP免疫BALB/c小鼠能够诱导特异性的HI抗体产生,有效阻止病毒在体内的复制。 展开更多
关键词 猪流感病毒 h5n1亚型 hA基因 重组腺病毒
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2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒HA、NA及NS基因进化分析 被引量：4
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作者 张如胜 孙边成 +6 位作者 姚栋 叶文 陈静芳 黄政 刘晓蕾 欧新华 陈发明 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期85-88,80,共5页
目的分析2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)血凝素(Hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)及非结构蛋白(Non-structural,NS)基因进化特征。方法从2014年长沙市活禽市场采集501份环... 目的分析2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)血凝素(Hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)及非结构蛋白(Non-structural,NS)基因进化特征。方法从2014年长沙市活禽市场采集501份环境标本,利用Real-time PCR方法进行A型、H5、H7和H9亚型流感病毒核酸检测,并对单一H5阳性标本进行核苷酸测序,病毒HA、NA和NS基因测序结果进行在线BLAST分析,利用Mega5和Bioedit软件构建核苷酸进化树和氨基酸(Amino acids,aa)比对。结果从501份环境标本中检出A型H5亚型病毒阳性标本177份(检出率35.33%),其中8份标本经核苷酸测序鉴定为H5N1亚型病毒,进化分析表明大部分H5N1病毒HA基因位于2.3.2分支内,聚集形成一个新亚分支,NA及NS基因位于2.3.2.1b亚分支。HA蛋白受体结合位点aa为QSG,表现为禽流感病毒受体特征;NA蛋白未出现H275Y及N295Saa替换,对神经氨酸酶抑制剂敏感;HA、NA及NS蛋白关键分子位点表现为高致病性的分子特征。结论 2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒HA、NA和NS基因表现为高致病性的分子特征,但不具有对人易感的受体特征,需要进一步监测。 展开更多
关键词 活禽市场 环境 禽流感病毒 h5n1亚型 基因 进化
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猪流感病毒H1、H3、N1、N2亚型分型RT-PCR方法的建立 被引量：7
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作者 齐海涛 孔维立 张桂红 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第3期187-191,共5页
根据GenBank中H1N1和H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)和M基因保守序列,分别设计合成了5对特异性引物,利用RT-PCR技术对SIV的型和亚型进行鉴定。结果表明,该方法的型RT-PCR可以检测出104... 根据GenBank中H1N1和H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)和M基因保守序列,分别设计合成了5对特异性引物,利用RT-PCR技术对SIV的型和亚型进行鉴定。结果表明,该方法的型RT-PCR可以检测出104 EID50病毒量所提取的RNA;H1、H3、N1和N2的亚型RT-PCR均可以检测出104 EID50病毒量所提取的RNA。除每对特异性引物所对应的亚型外,对其他亚型及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CS-FV)的检测均为阴性,应用该方法对临床样品进行检测,其结果与病毒分离结果符合率为100%。结果表明,该方法特异性好、敏感性高,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的分型检测方法,为猪流感分子流行病学的调查奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 猪流感病毒 h1亚型 h3亚型 n1亚型 n2亚型 RT-PCR方法
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H_1N_1亚型猪流感病毒分离鉴定 被引量：4
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作者 鄢明华 李秀丽 +5 位作者 韩伟 高荣玲 申树权 陈龙宾 侯俊辉 王东 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2011年第2期58-62,共5页
用SPF鸡胚从2005-2006年采集自天津地区猪群样品中分离出3株猪流感病毒,测定了分离病毒的部分理化特性和生物学特性。3个猪流感病毒分离株均能凝集1%鸡红血球,将其制成琼脂扩散抗原与猪流感标准阳性血清反应均出现清晰白色沉淀线;经中... 用SPF鸡胚从2005-2006年采集自天津地区猪群样品中分离出3株猪流感病毒,测定了分离病毒的部分理化特性和生物学特性。3个猪流感病毒分离株均能凝集1%鸡红血球,将其制成琼脂扩散抗原与猪流感标准阳性血清反应均出现清晰白色沉淀线;经中国动物卫生与流行病学中心系统鉴定,3个毒株均为H1N1亚型,分别命名为A/Swine/Tianjin/TJ2/2005(H1N1)、A/Swine/Tianjin/TJ3/2005(H1N1)、A/Swine/Tianjin/TJ4/2006(H1N1)株。这3株病毒都为热不稳定型,60℃作用10 min即可使病毒失去感染能力,病毒对酸性环境(pH3.0)和乙醚均敏感。TJ2、TJ3、TJ4株的EID50依次为10-7.5/0.2 mL、10-7.17/0.2 mL和10-8.45/0.2 mL。人工感染试验结果表明,分离的3株病毒对鸡和小鼠无致病性,但对猪具有致病性,能引起部分感染猪发病,并产生明显的肺部病理变化,从发病猪体内均能分离到H1N1亚型猪流感病毒。 展开更多
关键词 猪流感病毒 h1n1亚型 分离鉴定
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