家蚕精子介导报告基因gfp和egfp转移技术的研究 被引量：4

1

作者 左正宏 吴春旭 +2 位作者 桂慕燕 陈元霖 洪满贤 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期580-584,共5页

探讨家蚕精子介导基因转移技术能否有效地将外源基因导入并整合到家蚕基因组中,使之稳定遗传.分别进行了含gfp报告基因的pG350载体和含egfp报告基因的pMD-Fib-IE-EGFP与pEGFP-N3载体的精子介导基因转移实验.结果表明,导入线性pG350载体,... 探讨家蚕精子介导基因转移技术能否有效地将外源基因导入并整合到家蚕基因组中,使之稳定遗传.分别进行了含gfp报告基因的pG350载体和含egfp报告基因的pMD-Fib-IE-EGFP与pEGFP-N3载体的精子介导基因转移实验.结果表明,导入线性pG350载体,在14个G0代实验蛾区的DNA样品中,有5个PCR检测为阳性,阳性率为35.7%;对G1代的PCR与Southern blot检测的结果证明,导入的gfp基因存在于G1代的家蚕基因组中.导入不同浓度或构型的pMD-Fib-IE-EGFP与pEGFP-N3载体时,对G0代的PCR检测结果表明,导入线性pMD-Fib-IE-EGFP组的PCR阳性率为61.2%,而导入环状质粒组的PCR阳性率为57.1%;导入环状pEGFP-N3组的PCR阳性率为46.2%;对部分PCR阳性蛾区进行Southern blot检测结果表明,导入的egfp基因整合在G0代家蚕基因组中.本研究的结果表明,家蚕精子介导基因转移能够将外源基因有效地导入、整合于家蚕基因组,并可遗传至G1代. 展开更多

关键词 精子介导基因转移 家蚕 绿色荧光蛋白

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精子介导GFP基因在小鼠早期胚胎中的表达 被引量：3

2

作者 董焕声 房勇卫 +5 位作者 李兰 李晓林 孙理兰 翟向玮 潘庆杰 沈伟 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期535-539,共5页

利用DIG末端标记技术和免疫组化技术分析了小鼠精子体外结合内化外源DNA的效率。试验结果表明,不同小鼠个体的精子结合外源DNA的阳性率有明显差异(P<0.01),平均为13%。利用考马斯亮蓝染色评价了小鼠精子顶体反应发生的情况,筛选出TY... 利用DIG末端标记技术和免疫组化技术分析了小鼠精子体外结合内化外源DNA的效率。试验结果表明,不同小鼠个体的精子结合外源DNA的阳性率有明显差异(P<0.01),平均为13%。利用考马斯亮蓝染色评价了小鼠精子顶体反应发生的情况,筛选出TYH培养液为较合适的体外受精液。利用小鼠体外受精技术,将体外转染GFP基因并获能的小鼠精子与成熟卵母细胞进行体外受精,受精卵进行体外培养,表达GFP胚胎的阳性率为4.7%。验证了精子介导制备转基因小鼠胚胎的可行性,并建立了利用精子载体法制备转基因小鼠胚胎的平台。 展开更多

关键词 转基因动物 精子介导基因转移 体外受精

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脂质体介导FecB基因转染太行山羊精子的研究

3

作者 崔凯 刘月琴 +2 位作者 张英杰 孙军龙 王鹏 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期97-100,110,共5页

以太行山羊为研究对象,探索精子作为外源基因载体建立转FecB目的基因山羊的可行性,以及脂质体对转染效率的影响。采用共培养与阳离子脂质体介导2种方法转染精子,用原位杂交等技术检测FecB目的基因片段在精子中的存在及存在部位,并对2种... 以太行山羊为研究对象,探索精子作为外源基因载体建立转FecB目的基因山羊的可行性,以及脂质体对转染效率的影响。采用共培养与阳离子脂质体介导2种方法转染精子,用原位杂交等技术检测FecB目的基因片段在精子中的存在及存在部位,并对2种方法进行分析。结果表明:太行山羊的精子具有主动捕获外源基因的能力,共培养法精子阳性率为18.3%,脂质体介导精子阳性率为38.7%,脂质体的存在显著提高了精子的转染效率。太行山羊的精子能够被脂质体包被的FecB目的基因片段转染,为精子载体法制备FecB转基因太行山羊提供依据。 展开更多

关键词 FECB基因 脂质体 精子介导基因转移 太行山羊

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精子介导法生产转基因牦牛杂种胚胎的研究

4

作者 字向东 梁冠男 陈绍威 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期168-173,共6页

研究外源DNA转染对牦牛精子体外受精(IVF)、早期胚胎发育以及绿色荧光蛋白(GFP)基因在早期胚胎表达的影响。用构建融合人乳铁蛋白基因绿色荧光蛋白表达载体(pAcGFP1-hLF)转染的牦牛精子IVF黄牛卵母细胞,生产的胚胎在荧光显微镜下观察GF... 研究外源DNA转染对牦牛精子体外受精(IVF)、早期胚胎发育以及绿色荧光蛋白(GFP)基因在早期胚胎表达的影响。用构建融合人乳铁蛋白基因绿色荧光蛋白表达载体(pAcGFP1-hLF)转染的牦牛精子IVF黄牛卵母细胞,生产的胚胎在荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果显示,用环形质粒、线性质粒pAcGFP1-hLF转染的精子及未转染精子IVF后的卵裂率分别为56.4%、54.8%和61.0%,线性转染的囊胚率显著低于环形转染(17.7%与35.7%)。环形质粒转染的精子用DNaseⅠ消化、不消化及未转染的精子IVF后卵裂率分别为44.8%、55.2%和56.3%,囊胚率分别为33.3%、33.3%和30.2%。未经DNaseⅠ消化洗涤的环形质粒组GFP胚胎阳性率显著高于线性质粒组(99.3%与76.6%);DNaseⅠ消化组GFP胚胎阳性率极显著低于不消化组(25.4%与99.3%)。结果表明,用环形质粒DNA转染牦牛精子不会影响其受精及早期胚胎发育能力,但DNaseⅠ消化洗涤显著降低GFP胚胎阳性率。 展开更多

关键词 牦牛 精子介导基因转移 胚胎体外生产 绿色荧光蛋白

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精子介导法建立sFat-1转基因小鼠模型

5

作者 李小平 曾博 +2 位作者 邹方东 岳碧松 尹海林 《四川动物》 CSCD 北大核心 2008年第6期1003-1006,共4页

利用精子介导的基因转移(Sperm-mediated gene transfer,SMGT)方法,将sFat-1 DNA片段直接和小鼠精子孵育,再通过体外受精、胚胎移植等技术建立sFat-1转基因小鼠模型。经PCR检测,16只后代中发现2只阳性个体,Southern blot进一步鉴定的结... 利用精子介导的基因转移(Sperm-mediated gene transfer,SMGT)方法,将sFat-1 DNA片段直接和小鼠精子孵育,再通过体外受精、胚胎移植等技术建立sFat-1转基因小鼠模型。经PCR检测,16只后代中发现2只阳性个体,Southern blot进一步鉴定的结果显示有2只后代整合了sFat-1基因,成功建立sFat-1转基因小鼠模型,转基因率为12.5%。本研究运用精子介导的转基因方法将sFat-1基因整合到小鼠基因组中,为进一步研究sFat-1的生物学功能提供了实验动物模型。 展开更多

关键词 sFat-1基因 精子介导的基因转移 多不饱和脂肪酸

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外源基因对精子的影响及其在山羊早期胚胎中的表达 被引量：4

6

作者 叶华虎 董罡 +7 位作者 袁菊芳 隋丽华 胡娟峰 李瑞生 刘彦 马啸 陈振文 曾林 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期1421-1426,共6页

在前期实验中发现,山羊精子可自发结合外源DNA,但结合能力在不同动物个体之间差异显著。挑选结合能力明显不同的3只公羊,进一步探讨了外源DNA对精子的影响及其在早期胚胎中的表达,结果发现:外源基因与精子共同孵育后,精子的活率、顶体... 在前期实验中发现,山羊精子可自发结合外源DNA,但结合能力在不同动物个体之间差异显著。挑选结合能力明显不同的3只公羊,进一步探讨了外源DNA对精子的影响及其在早期胚胎中的表达,结果发现:外源基因与精子共同孵育后,精子的活率、顶体反应发生率和受精能力均呈下降态势,其降幅与精子的结合能力密切相关。利用与DNA共育后的精子进行体外受精,外源基因可被导入卵母细胞并在早期胚胎中获得表达,但胚胎阳性率因精子供体不同而差异显著(P<0.05);其中来源于高、中结合能力供体生产的胚胎,分别有16.2%(25/154)和5.3%(4/76)可检测到外源基因存在,但表达仅见于高结合能力供体生产的早期胚胎,表达率为6.5%(10/154);低结合能力供体生产的胚胎无外源基因。研究表明,在以精子载体方法生产转基因动物的实验过程中,筛选对DNA结合能力较强的精子供体是提高转基因效率的前提,但需要考虑外源DNA对精子受精能力的影响。 展开更多

关键词 精子介导基因转移 精子 胚胎 山羊

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脂质体法介导山羊精子转染外源DNA最适条件的研究 被引量：5

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作者 孙新明 魏泓 +1 位作者 赵永聚 王爱平 《西南大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期77-82,共6页

研究了阳离子脂质体介导山羊精子转染外源DNA的方法、效果及其影响因素以确定其最适转染条件,为进一步用此方法生产转基因动物提供参考.结果显示:①脂质体介导法可用于山羊精子转染外源DNA;②脂质体介导转染1、2、3号公羊的精子消化后... 研究了阳离子脂质体介导山羊精子转染外源DNA的方法、效果及其影响因素以确定其最适转染条件,为进一步用此方法生产转基因动物提供参考.结果显示:①脂质体介导法可用于山羊精子转染外源DNA;②脂质体介导转染1、2、3号公羊的精子消化后阳性率分别为25.2%,22.6%,27.5%,差异不显著(p>0.05).③脂质体介导转染的精子消化前后阳性率在充分洗涤组为41.3%和25.5%,极显著高于原精液直接加入1∶10∶1转染液不洗涤处理组的25.6%和11.4%及原精液加入不含缓冲液的转染液处理组的17.2%和7.8%(p<0.01).④离心洗涤后精液分别与在转染缓冲液中加入0、0.1%、0.3%、0.6%BSA(质量/体积)的转染液共同孵育后的消化前后阳性率分别为41.3%和25.5%、35%和21.4%、27.5%和15.3%及11.2%和8.2%;⑤用不同缓冲液配制的转染液进行脂质体介导山羊精子转染外源DNA的效率有差异,其中以mDM液转染精子的消化前、后阳性率最高(为41.3%和25.5%).研究表明:脂质体介导转染外源DNA的独特机制使供精个体间精子转染效率趋于一致;精子与脂质体-DNA复合物混合前将精子充分离心洗涤可显著提高脂质体介导精子转染外源DNA的效率;血清白蛋白能降低脂质体对精子介导的转染效率;脂质体法介导山羊转染外源DNA的最适转染条件为用mDM液充分洗涤精子后再与脂质体-DNA复合物混合转染. 展开更多

关键词 精子介导基因转移 脂质体 山羊

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猪精子结合和内化外源基因的影响因素研究 被引量：3

8

作者 杜欢 杨继山 +5 位作者 翟向玮 孙理兰 柳丽华 沈伟 闵令江 潘庆杰 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期933-938,共6页

精子介导基因转移（SMGT）是目前转基因动物研究中简单而高效的方法之一，其中精子结合和内化外源基因的效率是精子介导转基因成功的关键。本试验以DIG标记的线性化EGFP作为示踪基因来检测猪精子结合和内化外源基因的影响因素，结果表... 精子介导基因转移（SMGT）是目前转基因动物研究中简单而高效的方法之一，其中精子结合和内化外源基因的效率是精子介导转基因成功的关键。本试验以DIG标记的线性化EGFP作为示踪基因来检测猪精子结合和内化外源基因的影响因素，结果表明：猪精子能够自发结合外源基因，结合部位主要在精子顶体后区。精子结合外源DNA的阳性率随共孵育时间延长而增加，在37℃或39℃时孵育60min后，阳性率不再增加；在17℃时孵育90min后，阳性率不再增加。在检查的15只公猪样本中，精子与外源DNA的结合率为6．57％～35．81％，内化率为2．99%～24．66％，个体间差异显著（P〈0．01）。精浆能够强烈抑制外源基因的结合和内化，脂质体及DMSO能够显著提高转染效率。死精子能够结合外源基因，但不能将其内化；反复冻融导致质膜破裂的精子对外源基因有更高的结合率，且不受个体影响。 展开更多

关键词 精子介导基因转移 猪 精子 外源基因

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磁小体介导制备转基因猪模型

9

作者 陈克研 陈振文 +1 位作者 董婉维 郑志红 《实验动物与比较医学》 CAS 2015年第4期288-293,共6页

目的以磁小体（BMP）和聚乙烯亚胺（PEI）为载体，通过睾丸注射精子介导法建立转基因猪模型。方法将实验室保存的脂蛋白磷脂酶A2（Lp．PLA2）绿色荧光蛋白（GFP）质粒与BMP和PEI混匀，制备BMP—PEI-PLA2-GFP混合物，采用睾丸多点注射法... 目的以磁小体（BMP）和聚乙烯亚胺（PEI）为载体，通过睾丸注射精子介导法建立转基因猪模型。方法将实验室保存的脂蛋白磷脂酶A2（Lp．PLA2）绿色荧光蛋白（GFP）质粒与BMP和PEI混匀，制备BMP—PEI-PLA2-GFP混合物，采用睾丸多点注射法接种巴马小型猪，于接种后第2周、4周、6周至第20周采集精液，分别用RT—PCR和免疫荧光鉴定外源基因的表达情况；取阳性精液，对母猪实施人工授精；PCR及RT—PCR对所产仔猪进行鉴定。结果精液中GFP基因于接种后第4周首现并持续至第16周；荧光显微镜检查可观察到GFP蛋白主要表达于精子项体后区及精子尾颈部；经人工授精所产21头仔猪中，9头猪用PCR可检测GFP片段，用RT—PCR检测PLA2表达，该9头猪的表达量明显高于其它猪，总阳性率达42．86％。结论BMP和PEI结合可作为良好的携带外源基因的非病毒性载体，用该载体通过精子介导法可以达到迅速制备转基因猪的目的，其成本低、方法简单、便捷。 展开更多

关键词 猪 转基因 磁小体(BMP) 聚乙烯亚胺(PEI) 精子介导的基因转移

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转基因动物技术研究进展 被引量：2

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作者 谷瑞环 陈学进 郭毅 《实验动物与比较医学》 CAS 2009年第5期347-351,共5页

转基因动物技术起始于上个世纪七十年代末，随着生物科学的飞速发展，此技术也得到很大的进步。转基因动物技术在生物医药、农业等领域具有重要的作用。本文就转基因动物技术的发展、方法、应用及面临的问题做一综述。

关键词 转基因动物 显微注射 精子介导基因转移 核移植

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通过睾丸内注射转染外源DNA在小鼠精子的表达 被引量：7

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作者 谢畅 于明举 +3 位作者 惠楠 王岭斌 李文杰 赵永聚 《动物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期151-157,共7页

为研究睾丸内注射外源DNA法生产转基因小鼠(Mus musculus)的可行性,并探讨注射DNA的最佳浓度。将环形的质粒DNA pEGFP-N1与脂质体混合制备DNA-脂质体复合物,按DNA浓度不同分为0.08μg/μl、0.12μg/μl和0.24μg/μl3组,分别注射入成年... 为研究睾丸内注射外源DNA法生产转基因小鼠(Mus musculus)的可行性,并探讨注射DNA的最佳浓度。将环形的质粒DNA pEGFP-N1与脂质体混合制备DNA-脂质体复合物,按DNA浓度不同分为0.08μg/μl、0.12μg/μl和0.24μg/μl3组,分别注射入成年SPF级昆明小鼠睾丸内,同时设空白对照;每组处理公鼠2只,注射5d后每只与3只成年母鼠同笼,20d后在荧光显微镜下检测公鼠附睾精子,并制作睾丸石蜡切片,检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达;PCR法检测各组后代阳性率。结果显示,3组小鼠附睾荧光精子比例分别为9.09%、47.06%和27.78%。3组小鼠的睾丸石蜡切片中均可看到不同强度的GFP表达。后代经PCR检测阳性率分别为17.26%、47.61%和22.11%。本实验证实了睾丸注射法能使外源DNA整合进入精子基因组,并能在自身和后代中得到表达,本研究中外源DNA注射浓度以0.12μg/μl效果为最佳。 展开更多

关键词 PEGFP 睾丸注射 精子介导基因转移 转基因小鼠

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乳腺组织特异表达h—LTF转基因山羊研究

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作者 潘庆杰 柳林 +4 位作者 李兰 闵令江 李美玉 孙玉江 沈伟 《中国科技成果》 2010年第21期32-36,共5页

该研究以改构的hLTF基因为目的基因，利用基因打靶技术将其定位敲入到山羊胎儿成纤维细胞的β-casein基因座，检测阳性的基因打靶克隆扩增后用于体细胞核移植，核移植胚胎体外培养发育到2-细胞期后进行胚胎移植。结果表明，通过研究首... 该研究以改构的hLTF基因为目的基因，利用基因打靶技术将其定位敲入到山羊胎儿成纤维细胞的β-casein基因座，检测阳性的基因打靶克隆扩增后用于体细胞核移植，核移植胚胎体外培养发育到2-细胞期后进行胚胎移植。结果表明，通过研究首次建立了山羊胎儿成纤维细胞和乳腺上皮细胞乳蛋白基因座高效基因打靶的技术体系以及基因打靶体细胞核移植技术体系。经过G418药物抗性筛选后获得了稳定整合人lactoferrin基因的转基因阳性细胞克隆14个，体内成熟卵母细胞作受体的核移植囊胚率为64．8％，体外成熟卵母细胞作受体的核移植囊胚率为51．7％。利用DMSO-SMGT技术制备转基因动物高阳性率为56．5％，获得了转基因小鼠8只、转基因兔155只、转基因山羊2只。在转基因后代的乳腺里，外源基因得到了表达，并且具有生物活性，建立了DMSO-SMGT技术体系。 展开更多

关键词 h-LTF 核移植 精子介导基因转移 转基因山羊 乳腺生物反应器

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