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循环排列的增强型绿色荧光蛋白的构建及性能表征
1
作者 王丹 宋天宇 韦敏 《南宁师范大学学报（自然科学版）》 2025年第1期86-93,共8页
荧光蛋白的自催化稳健荧光和无细胞毒性特性,使其成为监测细胞内信号分子的关键工具。然而,循环排列的荧光蛋白(Circularly Permuted Fluorescent Proteins,cpFPs)仍存在着自身强度弱和无法适用于复杂细胞环境内检测等问题,因此,获得更... 荧光蛋白的自催化稳健荧光和无细胞毒性特性,使其成为监测细胞内信号分子的关键工具。然而,循环排列的荧光蛋白(Circularly Permuted Fluorescent Proteins,cpFPs)仍存在着自身强度弱和无法适用于复杂细胞环境内检测等问题,因此,获得更多类型的循环排列荧光蛋白并研究其光学活性和物理性能具有重要意义。构建一种新型的循环排列荧光蛋白——cpEGFP,并探究不同温度下cpEGFP在Escherichia coli BL21菌株的表达效果,同时比较其与超折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)的光学特性,发现cpEGFP的发色团环境已经被改变,且荧光寿命有所延长。另外,尽管cpEGFP具有可观的荧光强度,但其亮度及量子产率比sfGFP都有所降低,后续需要进一步对其性能进行优化。研究结果为循环排列荧光蛋白cpEGFP的性能优化以及在细胞内信号分子检测中的应用奠定了基础,对于发展更为高效、特异的荧光探针具有重要意义。 展开更多
关键词 循环排列绿色荧光蛋白 超折叠绿色荧光蛋白 诱导表达 相对荧光量子产率 荧光寿命
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绿色荧光蛋白标记的表达载体pHis-EGFP的构建 被引量：3
2
作者 王伟 孟超 +1 位作者 朱平 程克棣 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第9期35-39,共5页
为对重组蛋白的表达进行直观检测并简化蛋白纯化的步骤,构建了能在大肠杆菌中表达融合蛋白的通用表达载体pHis-EGFP。该载体含有源自表达载体pET-32a的T7启动子、终止子和源自质粒pUC18的ColE1复制子与绿色荧光蛋白报告基因。应用该载... 为对重组蛋白的表达进行直观检测并简化蛋白纯化的步骤,构建了能在大肠杆菌中表达融合蛋白的通用表达载体pHis-EGFP。该载体含有源自表达载体pET-32a的T7启动子、终止子和源自质粒pUC18的ColE1复制子与绿色荧光蛋白报告基因。应用该载体成功地表达并纯化了酵母GGDP(geranylgeranyldiphosphate,GGDP)合酶融合蛋白,结果表明所构建的载体是一个实用的表达载体,并建立了离子交换层析和亲和层析两步纯化融合蛋白的方法。 展开更多
关键词 表达载体 绿色荧光蛋白(egfp) GGDP合酶 绿色荧光蛋白标记 构建 蛋白纯化 融合蛋白 离子交换层析 T7启动子 PUC18
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含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的家蚕同源重组质粒载体的构建 被引量：3
3
作者 桂慕燕 叶向群 +1 位作者 吴春旭 熊秀芳 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期628-633,共6页
以含家蚕丝心蛋白重链基因同源片段的质粒pG35 0为出发质粒 ,插入增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,构建成以EGFP为报告基因的同源重组质粒载体 pMD Fib IE EGFP ,通过PCR及酶切鉴定表明EGFP以正确的方式插入到原始质粒中 ,通过脂质体介... 以含家蚕丝心蛋白重链基因同源片段的质粒pG35 0为出发质粒 ,插入增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,构建成以EGFP为报告基因的同源重组质粒载体 pMD Fib IE EGFP ,通过PCR及酶切鉴定表明EGFP以正确的方式插入到原始质粒中 ,通过脂质体介导法转染胃癌细胞能发出很强的绿色荧光 ,表明该质粒能够在真核细胞中表达 。 展开更多
关键词 egfp 家蚕 同源重组质粒载体 增强型绿色荧光蛋白基因 转基因蚕 载体构建 基因表达
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绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子表达载体pEGFP-C1-hri的构建及鉴定 被引量：4
4
作者 李坤 田余祥 +3 位作者 于丽华 樊建慧 杨帆 崔秀云 《中国微生态学杂志》 CAS CSCD 2006年第5期371-372,共2页
目的构建表达绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的表达载体pEGFP-C1-hri,为探讨人核糖核酸酶抑制因子抗肿瘤作用的分子机制打下基础。方法用亚克隆法,将目的片段从表达载体pGEX-6p-1-hri克隆到pEGFP-C1上,用双酶切筛选得到阳性重组... 目的构建表达绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的表达载体pEGFP-C1-hri,为探讨人核糖核酸酶抑制因子抗肿瘤作用的分子机制打下基础。方法用亚克隆法,将目的片段从表达载体pGEX-6p-1-hri克隆到pEGFP-C1上,用双酶切筛选得到阳性重组质粒pEGFP-C1-hri,用脂质体法将其瞬时转染到小鼠黑色素瘤细胞B16中,在荧光显微镜下检测其表达。结果pEGFP-C1-hri中插入了hri序列,绿色荧光高效表达于B16细胞浆中。结论pEGFP-C1-hri表达载体已成功构建。 展开更多
关键词 人核糖核酸酶抑制因子 绿色荧光蛋白 载体 构建
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绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-C_1-hri的构建及鉴定 被引量：3
5
作者 李坤 李琳 +3 位作者 王福强 田余祥 曲淑贤 崔秀云 《辽宁师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2007年第2期213-215,共3页
构建表达重组绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-c1-hri,为探讨人核糖核酸酶抑制因子抗肿瘤作用机制打下基础.用亚克隆法,将目的片段egfp-c1-hri从表达载体pEGFP-C1-hri克隆到pLNCX上,用酶切筛选得到阳... 构建表达重组绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-c1-hri,为探讨人核糖核酸酶抑制因子抗肿瘤作用机制打下基础.用亚克隆法,将目的片段egfp-c1-hri从表达载体pEGFP-C1-hri克隆到pLNCX上,用酶切筛选得到阳性克隆后,用脂质体法将其转染到小鼠黑色素瘤细胞B16中,用800 mg/L G418筛选2周后,在荧光显微镜下检测其表达.双酶切鉴定得到pLNCX-EGFP-C1-hri阳性克隆,荧光显微镜显示绿色荧光在B16细胞质中高效表达.成功构建逆转录病毒表达载体pLNCX-EGFP-C1-hri. 展开更多
关键词 人核糖核酸酶抑制因子 绿色荧光蛋白 逆转录病毒载体 构建
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真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-B7-2的构建 被引量：1
6
作者 路静 王明臣 +8 位作者 赵军 宋谦 崔自由 赵继敏 杨洪艳 黄幼田 汤黎明 赵国强 董子明 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2005年第4期583-585,共3页
目的:构建含人B7-2基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-B7-2。方法:应用RT-PCR、巢式PCR方法从重症肌无力患者胸腺组织中扩增出人B7-2cDNA基因片段,经回收、纯化、酶切后,依次连接到质粒pGEM-T和pEGFP-C3上。结果与结论:酶切及测序证... 目的:构建含人B7-2基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-B7-2。方法:应用RT-PCR、巢式PCR方法从重症肌无力患者胸腺组织中扩增出人B7-2cDNA基因片段,经回收、纯化、酶切后,依次连接到质粒pGEM-T和pEGFP-C3上。结果与结论:酶切及测序证实成功构建了克隆载体pGEM-B7-2和真核绿色荧光表达载体pEGFP-C3-B7-2。 展开更多
关键词 人B7分子 绿色荧光蛋白 真核表达载体 克隆
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构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组反转录病毒表达载体pLXSN-Kozak-EGFP及鉴定 被引量：1
7
作者 杨天燕 王乃平 +2 位作者 王劲 刘冠达 韦锦斌 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2010年第37期6908-6912,共5页
背景:增强型绿色荧光蛋白作为报告基因可在活细胞中表达发光蛋白。研究表明通过促进表达增强的Kozak序列可促进基因编码的蛋白质在真核细胞中的表达。目的:构建含增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak... 背景:增强型绿色荧光蛋白作为报告基因可在活细胞中表达发光蛋白。研究表明通过促进表达增强的Kozak序列可促进基因编码的蛋白质在真核细胞中的表达。目的:构建含增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,并对此重组载体进行鉴定。方法:用聚合酶链反应方法从含增强型绿色荧光蛋白基因的表达载体pEGFP-N1上高保真克隆出EGFP基因,通过分子克隆技术将目的基因重组至反转录病毒表达载体pLXSN。用菌斑快速聚合酶链法筛选阳性重组子,针对目的基因插入载体的方向设计鉴别插入方向的引物,用聚合酶链反应法、限制性酶法鉴定目的基因及连接的正向性,并对pLXSN-Kozak-EGFP重组载体进行DNA测序分析。结果与结论:从pEGFP-N1载体中克隆出上游含Kozak序列的EGFP基因,目的条带大小约750bp。构建的pLXSN-Kozak-EGFP重组子经菌落PCR鉴定,750bp处有特异性条带。插入方向经PCR鉴定,350bp处有特异性条带。限制性内切酶法鉴定,750与6000bp处有特异性条带。DNA测序比对结果表明克隆的目的基因与Kozak-EGFP一致性为100%。结果提示实验成功构建了含EGFP报告基因与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,且插入方向为正向。 展开更多
关键词 增强型绿色荧光蛋白 报告基因 反转录病毒 载体 基因重组
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利用绿色荧光蛋白优化辣椒遗传转化体系 被引量：2
8
作者 董依萍 刘画 +3 位作者 刘丹 周迎佳 李峰 邓颖天 《广东农业科学》 CAS 2024年第3期103-113,共11页
【目的】农杆菌介导的辣椒遗传转化较为困难,至今仍未建立高效转化体系。绿色荧光蛋白(GFP)基因是植物遗传转化中常用的报告基因,以GFP为报告基因,优化农杆菌介导的辣椒遗传转化体系。【方法】利用GFP表达系统,统计3个辣椒品种(‘HP’‘... 【目的】农杆菌介导的辣椒遗传转化较为困难,至今仍未建立高效转化体系。绿色荧光蛋白(GFP)基因是植物遗传转化中常用的报告基因,以GFP为报告基因,优化农杆菌介导的辣椒遗传转化体系。【方法】利用GFP表达系统,统计3个辣椒品种(‘HP’‘8214’和‘L55’)中3种不同外植体(子叶、下胚轴和Flamingo-bill外植体)的不定芽分化率、不定根分化率与荧光阳性率,探究农杆菌侵染浓度、侵染时间、预培养时间和共培养时间等因素对不定芽、不定根分化率及荧光阳性率的影响。【结果】3个辣椒品种的Flamingo-bill外植体不定芽分化率均显著高于下胚轴与子叶外植体,其中‘L55’Flamingo-bill外植体的不定芽分化率最高、达77.59%,故选用‘L55’Flamingo-bill外植体进行后续研究。4种农杆菌不同侵染浓度和时间组合下,‘L55’Flamingo-bill外植体均可产生不定芽、不定根及表达GFP的愈伤组织,当农杆菌侵染浓度为OD_(600)=0.05,侵染时间为30 min时,不定芽分化率和荧光阳性率最高,分别达48.39%、4.84%。在6种不同预培养与共培养时间组合处理下,Flamingo-bill外植体也均产生不定芽和不定根,预培养1 d、共培养1~2 d处理下的不定芽分化率和荧光阳性率最高,分别达48.44%、12.50%。最后对表达GFP荧光的不定根与愈伤组织进行PCR检测,结果显示GFP、Kan和Cas9基因在荧光阳性的组织中均被检测到,表明农杆菌介导的T-DNA插入成功且转化稳定。【结论】辣椒的外植体类型、农杆菌侵染浓度、侵染时间、预培养和共培养时间均对辣椒遗传转化效率有影响。以GFP为报告基因,筛选合适的转化条件可提高农杆菌介导的辣椒遗传转化效率。 展开更多
关键词 辣椒 Flamingo-bill外植体 绿色荧光蛋白 遗传转化 农杆菌 组织培养
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真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1/PAK-1的构建及其在结直肠癌SW480细胞内的表达 被引量：1
9
作者 武金宝 党彤 +3 位作者 陈学清 张振书 张宏权 宋于刚 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2011年第26期2730-2734,共5页
目的:构建重组p21-activated kinase-1(PAK1)基因绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1/PAK1,并转染入结直肠癌细胞SW480中表达.方法:在南方医科大学附属南方医院消化研究所实验室,从人类结直肠癌细胞株SW620细胞提取总RNA,经逆转录聚合酶链式... 目的:构建重组p21-activated kinase-1(PAK1)基因绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1/PAK1,并转染入结直肠癌细胞SW480中表达.方法:在南方医科大学附属南方医院消化研究所实验室,从人类结直肠癌细胞株SW620细胞提取总RNA,经逆转录聚合酶链式反应获得人PAK1 cDNA片段,经过限制性内切酶进行酶切,T4连接酶进行连接,将目的基因克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1上,然后转染结直肠癌细胞株SW480,观察其在细胞中表达.结果:重组载体经限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列分析验证,显示插入载体的序列与目的基因一致,而且该重组载体能够在SW480细胞中表达.结论:成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1/PAK1,为研究PAK1在结直肠癌中的生物学功能奠定了基础. 展开更多
关键词 p21-activated kinase-1 结直肠癌 真核表达 绿色荧光蛋白 基因克隆
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表达增强型绿色荧光蛋白的C型禽偏肺病毒反向遗传系统的构建及优化 被引量：1
10
作者 郭禹 程晶 +2 位作者 左玉柱 范京惠 姜海军 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2091-2100,共10页
【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protei... 【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)插入C型aMPV(aMPV/C)基因组中,构建表达EGFP的重组aMPV,并使用不同的载体及启动子构建aMPV迷你基因组,来优化aMPV反向遗传操作系统(reverse genetic system,RGS)的构建。【方法】将EGFP插入pBluescript-aMPV RGS的P和M蛋白之间非编码区并进行拯救,观察绿色荧光蛋白的表达情况,同时测定重组病毒滴度及遗传稳定性。为优化RGS的构建,采用含有T7启动子的pBluescript SK(+)和含有T7、CMV启动子的pcDNA3.1两种载体构建aMPV迷你基因组。首先将aMPV/C基因组两端的先导区(leader)和尾随区(trailer)与EGFP的cDNA进行PCR扩增,并切胶回收;其次将各胶回收片段按照leader-EGFP-trailer的顺序进行无缝克隆连接,并测序验证;最后将连接完整的迷你基因组反向插入两个载体中,构建aMPV/C的迷你基因组(pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C)。在拯救迷你基因组的试验中,将两个aMPV/C迷你基因组与3个表达N、P和L蛋白的质粒共转染到BHK-21细胞中,观察绿色荧光蛋白的表达情况。【结果】拯救的aMPV-EGFP重组病毒测序结果显示,EGFP已成功插入aMPV基因组中,并在前3代aMPV-EGFP重组病毒中稳定表达。aMPV-EGFP重组病毒滴度在感染96 h后达到105.5 TCID 50/mL。而pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个重组质粒的测序结果也证明了含有EGFP的aMPV迷你基因组构建完成。将3个重组质粒分别与辅助质粒共转染至BHK-21细胞中,转染24 h后观察到细胞中绿色荧光蛋白表达,证明aMPV-EGFP重组病毒及pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个aMPV迷你基因均都成功表达了EGFP。【结论】本研究成功构建了两个aMPV迷你基因组并拯救了aMPV-EGFP重组病毒,重组病毒具有良好的遗传稳定性。而CMV和T7作为aMPV/C RGS中的启动子时,二者的拯救效率相同。pBluescript SK(+)和pcDNA3.1均可用于aMPV/C RGS的构建,本研究为aMPV/C RGS的构建提供了多种方法。 展开更多
关键词 C型禽偏肺病毒 迷你基因组 反向遗传系统 CMV启动子 增强绿色荧光蛋白 T7启动子
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低稳定性绿色荧光蛋白EGFP-PEST的载体构建及表达验证 被引量：1
11
作者 袁龙 郑幽 +7 位作者 范杰 梁剑青 牛祖彪 高丽华 黄红艳 陈昭烈 管静芝 孙强 《生物技术通讯》 CAS 2017年第4期405-409,共5页
目的:构建含有蛋白降解基序PEST序列的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因表达载体pQCXIP-EGFPPEST-N1,并检测其对蛋白稳定性的调节。方法:以NFATx6-mPro-EGFP-PEST-YES为模板,PCR扩增EGFP-PEST序列,克隆入逆转录病毒载体pQCXIP-EGFP-N1... 目的:构建含有蛋白降解基序PEST序列的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因表达载体pQCXIP-EGFPPEST-N1,并检测其对蛋白稳定性的调节。方法:以NFATx6-mPro-EGFP-PEST-YES为模板,PCR扩增EGFP-PEST序列,克隆入逆转录病毒载体pQCXIP-EGFP-N1构建pQCXIP-EGFP-PEST-N1,病毒包装后感染293FT细胞获得稳定细胞系;用蛋白酶体抑制剂MG-132处理细胞,Western印迹检测EGFP的表达变化。结果:构建获得逆转录病毒载体pQCXIP-EGFP-PEST-N1,感染293FT细胞后,与对照组相比,EGFP表达显著降低,并且该降低可被MG-132处理逆转。结论:构建了EGFP-PEST蛋白的表达载体,PEST可以介导EGFP蛋白发生蛋白酶体依赖的降解。为实现基因编辑效果的可视化筛选奠定了基础。 展开更多
关键词 PEST序列 基因编辑 蛋白酶体 绿色荧光蛋白
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表达绿色荧光蛋白的坦布苏病毒的构建与鉴定
12
作者 章丽娇 田宇杰 +9 位作者 张兰香 赵冬敏 韩凯凯 黄欣梅 杨婧 吴凤瑶 刘青涛 刘宇卓 张小飞 李银 《动物医学进展》 北大核心 2024年第6期44-50,共7页
报告病毒在高通量抗病毒药物筛选、活体动物体内成像及新型疫苗研发等方面具有重要应用价值。通过反向遗传操作技术,以坦布苏病毒JXSP株感染性克隆为基础,采用两种策略构建报告病毒,即分别在病毒基因组5′UTR和C蛋白基因、N S5基因和3′... 报告病毒在高通量抗病毒药物筛选、活体动物体内成像及新型疫苗研发等方面具有重要应用价值。通过反向遗传操作技术,以坦布苏病毒JXSP株感染性克隆为基础,采用两种策略构建报告病毒,即分别在病毒基因组5′UTR和C蛋白基因、N S5基因和3′UTR间引入外源基因EGFP,通过融合PCR获得全长cDNA PCR产物,体外转录生成mRNA,转染至BHK-21拯救重组病毒并研究其生长特性。结果显示,利用5′UTR-C位点构建的报告病毒mRNA转染BHK-21细胞后能观察到明显的绿色荧光;报告病毒P0接种DEF细胞后可高强度表达绿色荧光蛋白,在BHK-21和DEF细胞上增殖速度略微低于亲本毒株,但差异不显著。结果表明,成功构建了1株坦布苏绿色荧光报告病毒rJXSP-5′EGFP,在BHK-21和DEF细胞上均能有效增殖。 展开更多
关键词 坦布苏病毒 绿色荧光蛋白 报告病毒
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一种诱导表达绿色荧光蛋白穿梭质粒的构建及其在荧光示踪中的应用
13
作者 左东 李子晨 +5 位作者 尹伊 胡海 王少辉 祁晶晶 田明星 于圣青 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第4期25-31,共7页
细菌的荧光标记是一种重要的常用实验标记技术,用于研究细菌生理生化特性、感染宿主体内示踪、感染细胞示踪等研究。细菌的荧光标记通常通过质粒表达荧光蛋白来实现,而不同类型的细菌,由于菌种特性不同,构建的质粒往往不能通用。本研究... 细菌的荧光标记是一种重要的常用实验标记技术,用于研究细菌生理生化特性、感染宿主体内示踪、感染细胞示踪等研究。细菌的荧光标记通常通过质粒表达荧光蛋白来实现,而不同类型的细菌,由于菌种特性不同,构建的质粒往往不能通用。本研究构建了一种可诱导表达增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒pBT-iEGFP,该质粒可通过添加无水四环素诱导表达绿色荧光蛋白。诱导表达和传代稳定性试验表明,pBT-iEGFP质粒可在禽致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌和马耳他布鲁菌中成功诱导表达绿色荧光蛋白,在五代盲传中该质粒能在细菌中稳定遗传。胞内布鲁菌诱导表达试验证实,pBT-iEGFP质粒可成功示踪细胞感染过程中活的布鲁菌。总之,本研究构建的pBT-iEGFP质粒可作为细菌的荧光示踪研究工具,应用于多种实验研究。 展开更多
关键词 诱导表达质粒 绿色荧光蛋白 大肠杆菌 沙门菌 布鲁菌
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重组小麦组蛋白H4介导绿色荧光蛋白基因(pEGFP/C1)的转染
14
作者 王春艳 郑梅竹 +4 位作者 时东方 郑伟 吴山力 孙号然 张玉静 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期1-3,共3页
利用在大肠杆菌体内表达的重组小麦组蛋白H4与质粒DNA形成复合体后,通过琼脂糖凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证重组蛋白与DNA的结合情况;MTT法检测蛋白对细胞的毒性作用;转染细胞后,激光共聚焦显微镜检测荧光蛋白的表达。此重组蛋白能很好... 利用在大肠杆菌体内表达的重组小麦组蛋白H4与质粒DNA形成复合体后,通过琼脂糖凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证重组蛋白与DNA的结合情况;MTT法检测蛋白对细胞的毒性作用;转染细胞后,激光共聚焦显微镜检测荧光蛋白的表达。此重组蛋白能很好地结合质粒DNA,且能有效地保护DNA分子不受核酸酶降解,并能高效地携带绿色荧光蛋白基因pEGFP/C1转染进入卵巢癌细胞株H08910。 展开更多
关键词 基因转移 重组小麦组蛋白H4 转染 非病毒载体 绿色荧光蛋白
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脑心肌炎增强型绿色荧光蛋白嵌合病毒的构建
15
作者 徐超 杨晓炼 朱书 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期218-224,共7页
携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的脑心肌炎(Encephalomyocarditis virus, EMCV)嵌合病毒是研究该病毒体内外生物学特性的有力工具。因此,本研究基于前期构建的巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)感... 携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的脑心肌炎(Encephalomyocarditis virus, EMCV)嵌合病毒是研究该病毒体内外生物学特性的有力工具。因此,本研究基于前期构建的巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)感染性克隆,在EMCV基因组2A蛋白序列之后插入EGFP基因片段,并将重组质粒转染BHK-21细胞,获得携带EGFP的嵌合病毒。通过荧光定量PCR(real-time PCR)、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay, IFA)及半数组织细胞感染量测定(Median tissue culture infective dose, TCID50)等方法对拯救病毒的基因组复制、蛋白表达及病毒粒子的感染性进行测定,结果证实嵌合病毒能够在BHK-21细胞上成功表达EGFP并产生完整的病毒粒子。然而,相较于野生型亲本拯救病毒,嵌合病毒在BHK-21细胞上的复制能力降低,并且在连续传代后逐渐失去绿色荧光信号,表明嵌合病毒中EGFP基因的插入对EMCV病毒粒子的组装释放具有不良影响,并在传代过程中逐渐累积导致EGFP功能丧失的缺失和突变。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 增强绿色荧光蛋白 嵌合病毒
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增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建 被引量：8
16
作者 徐洁杰 张伟娟 +1 位作者 王浩明 胡火珍 《四川大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期386-388,共3页
构建增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)基因的真核表达载体pCDNA3.1(+) EGFP,转染至培养的Hela细胞中成功表达,并发出绿色荧光,证明EGFP一种良好的报告基因和筛选标记.
关键词 增强型绿色荧光蛋白(egfp) 真核表达载体 转染 HELA细胞
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斑马鱼Mylz2启动子的克隆与转绿色荧光蛋白基因鱼的构建 被引量：30
17
作者 简清 白俊杰 +3 位作者 叶星 夏仕玲 梁旭方 罗建仁 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期391-395,共5页
为获得能在肌肉表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼(Brachydaniorerio),采用PCR方法,从斑马鱼基因组DNA中分离了肌球蛋白轻链2启动子,序列分析表明,该启动子与国外文献报道的斑马鱼肌球蛋白轻链2启动子序列的相似性为98.6%。将改造后的启... 为获得能在肌肉表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼(Brachydaniorerio),采用PCR方法,从斑马鱼基因组DNA中分离了肌球蛋白轻链2启动子,序列分析表明,该启动子与国外文献报道的斑马鱼肌球蛋白轻链2启动子序列的相似性为98.6%。将改造后的启动子插入绿色荧光蛋白基因载体,构建成肌肉特异性表达载体。通过显微注射,将线性化的表达载体注入斑马鱼的受精卵,获得了转绿色荧光蛋白基因的斑马鱼。绿色荧光蛋白在胚胎期开始表达,随着鱼体的生长表达量有增加的趋势,成鱼在紫外灯下用肉眼即可观察到绿色荧光。转基因鱼绿色荧光蛋白的表达具有明显的肌肉特异性。本研究为下一步特定基因的表达研究和获得有特色的转基因观赏鱼奠定了基础。 展开更多
关键词 斑马鱼 绿色荧光蛋白 转基因 肌球蛋白 启动子
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Kozak序列+4G提高绿色荧光蛋白在HEK293细胞中的表达 被引量：21
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作者 杜明梅 叶玲 +2 位作者 刘建伟 刘静 杨立娜 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期491-494,共4页
构建含不同Kozak序列的绿色荧光蛋白(GFP)基因真核表达载体,并检测它们在HEK293细胞中的表达差异。通过设计突变的PCR引物改变目的基因GFP的Kozak序列,+4位碱基分别为A和G,且不改变氨基酸编码,将PCR扩增的GFP片段与载体pcDNA3.1进行酶... 构建含不同Kozak序列的绿色荧光蛋白(GFP)基因真核表达载体,并检测它们在HEK293细胞中的表达差异。通过设计突变的PCR引物改变目的基因GFP的Kozak序列,+4位碱基分别为A和G,且不改变氨基酸编码,将PCR扩增的GFP片段与载体pcDNA3.1进行酶切、连接、转化、鉴定。成功构建的pHGFP-A,pHGFP-G质粒采用脂质体法转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光表达,流式细胞术检测目的蛋白GFP的荧光表达阳性率,Western blot检测目的蛋白GFP的表达。构建的两质粒均能有效转染HEK293细胞,其中流式细胞术分析显示:pHGFP-A组GFP阳性率约为15%,pHGFP-G组GFP阳性率约为45%;Western blot显示pHGFP-G的GFP表达量约为pHGFP-A的GFP表达量3.87倍。结果表明,Kozak序列+4G(-3位为嘌呤碱基时)在蛋白表达中发挥重要作用,可以使绿色荧光蛋白GFP在HEK293细胞中的表达量提高约4倍。 展开更多
关键词 KOZAK序列 绿色荧光蛋白 WESTERN BLOT
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绿色荧光蛋白表达对检测胶质细胞瘤体内侵袭的意义 被引量：4
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作者 李侠 fmmu.edu.cn +5 位作者 章翔 吴景文 高大宽 刘先珍 梁景文 王煊 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2000年第7期623-626,共4页
目的：利用体外转染绿色荧光蛋白基因的胶质瘤细胞大鼠移植瘤模型，研究胶质瘤体内侵袭行为。方法：携有增强型绿色荧光蛋白（EnhancedGreenFluorescentProtein，EGFP）基因的pEGFP-N3质粒体外转染C6胶质瘤细胞，筛选稳定表达绿色荧光... 目的：利用体外转染绿色荧光蛋白基因的胶质瘤细胞大鼠移植瘤模型，研究胶质瘤体内侵袭行为。方法：携有增强型绿色荧光蛋白（EnhancedGreenFluorescentProtein，EGFP）基因的pEGFP-N3质粒体外转染C6胶质瘤细胞，筛选稳定表达绿色荧光蛋白的细胞克隆，并作流式细胞仪和电镜检测，以立体定向法植入SD大鼠脑实质内建立大鼠移植瘤模型。4周后处死大鼠并作鼠脑连续石蜡切片，相邻切片分别作苏木素—伊红（HE）或免疫组化染色后荧光显微镜（紫外激发波长为488nm）检测。结果：EGFP于体内稳定表达，在荧光显微镜下可较容易区分肿瘤区与非肿瘤区界限，并能发现侵袭至远处的单个肿瘤细胞，其敏感性及特异性明显优于HE染色或免疫组化方法。结论：绿色荧光蛋白体外转染C6胶质瘤细胞并建立大鼠脑内移植瘤模型，是研究胶质瘤体内侵袭和转移的有效方法。 展开更多
关键词 胶质细胞瘤 绿色荧光蛋白 肿瘤侵袭 egfp
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绿色荧光蛋白嵌合体小鼠的建立和鉴定 被引量：8
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作者 招霞 马芸 +6 位作者 陈系古 葛坚 黄冰 邓新燕 喻瓴 赖英荣 黄春浓 《动物学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2004年第5期784-790,共7页
为研究嵌合体动物中供体胚胎干细胞 (ES)在宿主胚胎发育中的走向和定位 ,同时探讨绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因在转基因动物制作中的应用价值 ,本研究将pEGFP N1基因导入小鼠ES D3 细胞系 ,得到稳定表达GFP的胚胎干细胞亚系ES D3 ... 为研究嵌合体动物中供体胚胎干细胞 (ES)在宿主胚胎发育中的走向和定位 ,同时探讨绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因在转基因动物制作中的应用价值 ,本研究将pEGFP N1基因导入小鼠ES D3 细胞系 ,得到稳定表达GFP的胚胎干细胞亚系ES D3 GFP ,通过对昆明小鼠的囊胚腔注射 ,获得了 4只表达绿色荧光蛋白的嵌合体小鼠。其中 1只存活至成年 ,3只出生时死亡。荧光显像及组织PCR检测显示了绿色荧光蛋白在小鼠体内的嵌合情况。以绿色荧光为指标可实现活体水平的动态观察 ,本实验首次观察到以GFP为指标所示的机体嵌合情况与根据毛色嵌合推测的机体嵌合情况存在很大差异 ,以GFP为嵌合指标更加全面而准确 ;但不排除GFP对小鼠发育存在一定毒性的可能 ;另外 ,有结果显示供体ES细胞在宿主体内除了大片补丁状嵌合外 ,还存在细胞散在嵌合的情况 ,后者提示了在组织中利用GFP对ES细胞实施单细胞追踪和实时观察的可行性 。 展开更多
关键词 小鼠 嵌合体 体内 观察 供体 ES细胞 宿主 绿色荧光蛋白(GFP) 绿色荧光蛋白 体胚
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