2型腺伴随病毒基因治疗载体的构建 被引量：13

1

作者 杜绪仓 任惠民 +3 位作者 胡海涛 刘勇 杨广笑 王全颖 《西安医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期100-102,共3页

目的　构建一种适用于中枢神经系统疾病的基因治疗载体。方法　以野生型 2型腺伴随病毒 (AAV 2 )质粒pssv9int 及逆转录病毒载体质粒plxsn为基本元件 ,利用重组DNA技术 ,构建了一种通用型AAV载体质粒pssHG Neo。结果　该质粒除含有必备... 目的　构建一种适用于中枢神经系统疾病的基因治疗载体。方法　以野生型 2型腺伴随病毒 (AAV 2 )质粒pssv9int 及逆转录病毒载体质粒plxsn为基本元件 ,利用重组DNA技术 ,构建了一种通用型AAV载体质粒pssHG Neo。结果　该质粒除含有必备的原核细胞复制子及Ampr 筛选基因外 ,还含有真核细胞筛选基因———Neor 及供插入目的基因的多克隆位点 (MCS) ,在MCS的上游为逆转录病毒的长末端重复序列 (5’LTR) ,具有启动子的功能 ,启动定向插入到MCS的外源目的基因。质粒中的AAV反向末端重复序列 (ITR)具有定点整合于人基因组 1 9号染色体S1位点的特点。 展开更多

关键词 基因治疗 载体 Ⅱ型腺伴随病毒 重组DNA技术

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腺伴随病毒携带神经营养因子-3对庆大霉素致聋豚鼠耳蜗的保护作用 被引量：3

2

作者 姚小宝 李胜利 +3 位作者 朱宏亮 王晓侠 刘晖 闫利英 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期1642-1645,共4页

目的探讨采用腺伴随病毒(AAV)携带神经营养因子-3(NT-3)对庆大霉素(GM)致聋豚鼠的局部基因治疗及其对耳蜗功能及形态的保护作用。方法选用18只杂色健康豚鼠,用GM按80mg/kg·d连续肌肉注射4d后随机分为3组:AAV-NT-3治疗组(A组)7只,AA... 目的探讨采用腺伴随病毒(AAV)携带神经营养因子-3(NT-3)对庆大霉素(GM)致聋豚鼠的局部基因治疗及其对耳蜗功能及形态的保护作用。方法选用18只杂色健康豚鼠,用GM按80mg/kg·d连续肌肉注射4d后随机分为3组:AAV-NT-3治疗组(A组)7只,AAV对照组(B组)7只,GM对照组(C组)4只。A、B组动物在埋植微量渗透泵后继续肌肉注射GM10d,C组动物继续注射GM10d。AAV-NT-3及空白AAV载体滴度均为1.1×1010pfu/ml。对A、B两组注射GM前及术后10d、C组注射GM后14d进行听性脑干反应测听(ABR)及畸变产物耳声发射(DPOAE)测定。而后将动物麻醉处死取听泡,行基底膜铺片和毛细胞计数,计算外毛细胞损失率。结果实验组与对照组相比听功能(ABR及DPOAE)及耳蜗毛细胞生存率均有显著性差异(P<0.05)。结论腺伴随病毒介导NT-3转基因治疗可用于保护受氨基甙类药物损害的豚鼠听功能和耳蜗毛细胞;在行局部耳蜗转基因治疗中应严格遵循无菌原则。 展开更多

关键词 腺伴随病毒 神经营养因子-3 基因治疗 耳蜗 庆大霉素

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人脑源性神经营养因子重组腺伴随病毒的制备 被引量：3

3

作者 马东亮 胡海涛 +3 位作者 王建明 任惠民 刘勇 杨广笑 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期431-433,437,共4页

目的　构建并产生人脑源性神经营养因子 (humanbrain derivedneurotrophicfactor ,hBDNF)重组腺伴随病毒(adeno associatedvirus,AAV)载体。方法　将目的基因hBDNF插入载体质粒pSSHG Neo的EcoRI BamHI位点 ,构建重组质粒pSSHG Neo/hBDN... 目的　构建并产生人脑源性神经营养因子 (humanbrain derivedneurotrophicfactor ,hBDNF)重组腺伴随病毒(adeno associatedvirus,AAV)载体。方法　将目的基因hBDNF插入载体质粒pSSHG Neo的EcoRI BamHI位点 ,构建重组质粒pSSHG Neo/hBDNF。用腺病毒辅助质粒 pFG14 0代替野生型腺病毒 ,包装质粒 pAAV/Ad及已构建的重组质粒 ,三质粒磷酸钙共沉淀法转染 80 %融合的 14 3细胞系 ,包装AAV hBDNF。经蔗糖梯度离心法纯化、斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果　重组病毒AAV hBDNF滴度约为 4 .86× 10 14 颗粒·L-1。结论　成功制备了重组病毒AAV hBDNF 。 展开更多

关键词 人脑源性神经营养因子 腺伴随病毒 神经退行性疾病 基因治疗

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通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究 被引量：2

4

作者 郑国玺 韦俊荣 +5 位作者 祝康 侯瑾 施典羽 朱宏亮 杨广笑 王全颖 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期14-17,共4页

目的构建基因治疗通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用。方法使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒-pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸... 目的构建基因治疗通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用。方法使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒-pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒,构建了重组AAV通用载体质粒pSSHG-CMV。在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白(GFP)基因后,使用pSSHG-CMV-GFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞,制备GFP重组AAV。应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度,并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞,荧光显微镜观察GFP表达。结果重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011cfu/mL,浓缩后可达2×1013cfu/mL,表明成功地构建了重组AAV载体。插入外源基因GFP后,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下,能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组GFP-AAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光。结论构建的重组AAV通用载体pSSHG-CMV可转染外源基因,这为进一步的基因治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 重组腺伴随病毒 载体 报告基因 基因治疗 NIH3T3

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肌注腺伴随病毒基因治疗血友病B的安全性研究 被引量：2

5

作者 邹蓓艳 陈立 +4 位作者 伍志坚 吴小兵 卢大儒 邱信芳 薛京伦 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期301-306,共6页

研究了肌注腺伴随病毒 (adeno -associatedvirus,AAV)介导凝血Ⅸ因子基因治疗血友病B的安全性。首先采用PCR、反转录PCR(RT -PCR)分别检测rHSV/AAV包装系统产生的重组腺伴随病毒AAV -mFⅨ ,和病毒感染细胞后所得上清再次感染的BHK细胞中... 研究了肌注腺伴随病毒 (adeno -associatedvirus,AAV)介导凝血Ⅸ因子基因治疗血友病B的安全性。首先采用PCR、反转录PCR(RT -PCR)分别检测rHSV/AAV包装系统产生的重组腺伴随病毒AAV -mFⅨ ,和病毒感染细胞后所得上清再次感染的BHK细胞中的HSV(herpessimplexvirus,HSV)和野生型AAV。同时观察HSV引起的细胞毒作用。结果表明 :纯化后的AA -mFⅨ中HSV≤ 1个病毒基因组 (viralgenome ,v g ) /10 8个病毒基因组AAV -mFⅨ ,且不具备感染活性 ;没有野生型AAV。其次 ,采用PCR、RT -PCR、免疫组化等方法检测了AAV -mFⅨ在体内的分布和表达时间 ;通过抗AAV的抗体检测和病理切片等方法观察了AAV -mFⅨ在体内引起的免疫反应和病理变化。结果表明 :AAV -mFⅨ仅分布在注射点肌肉组织内 ,表达可持续 2 0 0天以上 ;抗体水平低 ,各主要脏器均未发生明显的病理变化。AAV介导的凝血因子Ⅸ系统是安全的。 展开更多

关键词 rHSV/AAV包装系统 单纯疱疹病毒 HSV 野生型腺伴随病毒 基因治疗 安全性 肌注 血友病

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腺伴随病毒介导ADNF-9基因转染对豚鼠卡那霉素致聋的治疗作用 被引量：2

6

作者 景阳 郑国玺 +2 位作者 祝康 刘晖 张文 《江苏大学学报（医学版）》 CAS 2015年第5期369-372,共4页

目的:观察包装重组的腺伴随病毒(adeno-associated virus,AAV)r AAV-NT4-ADNF-9对卡拉霉素致聋豚鼠的治疗作用。方法:选用耳廓反射和听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)正常的白色红目豚鼠,在大腿内侧肌肉注射卡那霉素400 m... 目的:观察包装重组的腺伴随病毒(adeno-associated virus,AAV)r AAV-NT4-ADNF-9对卡拉霉素致聋豚鼠的治疗作用。方法:选用耳廓反射和听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)正常的白色红目豚鼠,在大腿内侧肌肉注射卡那霉素400 mg/(kg·d),连续注射6 d,制备耳聋模型。在全身麻醉的条件下,从豚鼠右耳背侧进路,打开听泡,用微量注射器由圆窗注入r AAV-NT4-ADNF-9 10μL,14 d后取术侧听泡。进行耳蜗毛细胞计数和耳蜗毛细胞的硬铺片,通过相差显微镜观察内耳毛细胞的结构。结果:r AAV-NT4-ADNF-9组治疗后ABR阈值较治疗前明显下降(P<0.05),相差显微镜观察到耳蜗基膜完整,外毛细胞呈点状缺失。而其余3组治疗前后ABR阈值无明显变化,人工淋巴液组与空载体组治疗后毛细胞呈片状缺失,空白对照组则无毛细胞缺失。ADNF组取景框内毛细胞平均数明显高于人工淋巴液对照组及空载体组(P<0.05)。结论:用r AAV-NT4-ADNF-9转染卡那霉素致聋豚鼠耳蜗组织,可促进耳蜗毛细胞修复和再生。 展开更多

关键词 基因治疗 感音神经性耳聋 活性依赖性神经营养因子-9 耳蜗毛细胞 腺伴随病毒

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重组腺伴随病毒载体表达hBDNF对大鼠基底前脑胆碱能神经元损伤的保护作用 被引量：1

7

作者 马东亮 胡海涛 +3 位作者 杨蓬勃 靳辉 任惠民 刘勇 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期27-29,47,共4页

目的　探讨重组腺伴随病毒载体表达人脑源性神经营养因子 (hBDNF)对大鼠基底前脑胆碱能神经元损伤的保护作用。方法　用 β淀粉样肽 (Aβ2 5 3 5)注入大鼠Meynert核损伤胆碱能神经元。损伤后 8～ 10d行hBDNF重组腺伴随病毒脑内注射。经... 目的　探讨重组腺伴随病毒载体表达人脑源性神经营养因子 (hBDNF)对大鼠基底前脑胆碱能神经元损伤的保护作用。方法　用 β淀粉样肽 (Aβ2 5 3 5)注入大鼠Meynert核损伤胆碱能神经元。损伤后 8～ 10d行hBDNF重组腺伴随病毒脑内注射。经避暗回避试验测试大鼠学习记忆能力 ,组织学及免疫组织化学观察hBDNF表达以及胆碱能神经元数量变化。结果　避暗回避试验结果显示 ,应用hBDNF重组腺伴随病毒 4周后 ,实验组动物的学习记忆能力增强 ,行为明显改善。胆碱乙酰转移酶 (ChAT)免疫组织化学染色显示 ,注射点附近免疫反应阳性神经元散在或成群分布 ,数目明显增多 ,经与模型组比较 ,胆碱能神经元数量增高约 3 7%。结论　hBDNF重组腺伴随病毒可在脑内表达hBDNF ,表达的hBDNF对损伤的胆碱能神经元具有营养和保护作用。 展开更多

关键词 重组腺伴随病毒载体 HBDNF 大鼠 基底前脑 胆碱能神经元损伤 保护作用 人脑源性神经营养因子 基因治疗

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重组腺伴随病毒载体介导Kringle5基因对SD大鼠视网膜神经细胞及血管内皮细胞的影响 被引量：1

8

作者 宋哲 黎晓新 +2 位作者 于文贞 董建强 闫征 《国际眼科杂志》 CAS 2007年第2期380-382,共3页

目的:研究腺伴随病毒载体介导Kringle5基因对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUC)及视网膜神经细胞影响作用。方法:亚克隆构建pSNAV-Kringle5-gfp载体,腺伴随病毒包装形成rAAV-Kringle5-gfp;HUC培养及SD大鼠... 目的:研究腺伴随病毒载体介导Kringle5基因对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUC)及视网膜神经细胞影响作用。方法:亚克隆构建pSNAV-Kringle5-gfp载体,腺伴随病毒包装形成rAAV-Kringle5-gfp;HUC培养及SD大鼠视网膜神经细胞培养;按设计分为试验组、阴性对照组和空白对照组;聚合酶链反应(PCR),MTT法对各组进行细胞活力测定;荧光显微镜照相。结果:腺伴随病毒载体介导Kringle5基因产生Kringle5物质对HUC有抑制作用,实验组与对照组比较P<0.01,实验组与空白对照组比较P>0.05;腺伴随病毒载体介导Kringle5基因产生Kringle5物质对SD大鼠视网膜神经细胞实验组和空白对照组没有影响,实验组与对照组及实验组与空白对照组比较P>0.05。结论:腺伴随病毒载体介导Kringle5基因能够对新生血管有抑制作用而对视网膜神经细胞无不良影响作用。 展开更多

关键词 腺伴随病毒载体 血管抑制素Kringle5 血管内皮细胞 SD大鼠视网膜神经细胞

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腺伴随病毒介导的脑源性神经营养因子对耳蜗损伤保护作用的体外研究 被引量：2

9

作者 郑国玺 祝康 +2 位作者 韦俊荣 杨广笑 王全颖 《实用医学杂志》 CAS 2008年第21期3640-3642,共3页

目的:将携载脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的重组腺伴随病毒rAAV-BDNF转染体外培养的耳蜗组织,并观察该重组病毒对耳蜗损伤的保护作用。方法:体外分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞;应用新霉素建立体外耳... 目的:将携载脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的重组腺伴随病毒rAAV-BDNF转染体外培养的耳蜗组织,并观察该重组病毒对耳蜗损伤的保护作用。方法:体外分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞;应用新霉素建立体外耳聋模型;将重组病毒感染体外培养的新生SD大鼠耳蜗,观察其对体外毛细胞的保护作用。结果:成功分离培养了新生SD大鼠的耳蜗毛细胞后,可见外毛细胞和内毛细胞成排排列;rAAV-BDNF组毛细胞损伤程度较新霉素加害组明显为轻,而新霉素加害组可见毛细胞大量缺失,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:构建的重组病毒rAAV-BDNF对耳蜗具有保护作用,可用于基因治疗的研究。 展开更多

关键词 耳蜗疾病 重组腺伴随病毒 脑源性神经营养因子 耳蜗毛细胞

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腺伴随病毒介导的神经营养素4基因对视网膜神经节细胞的转染 被引量：2

10

作者 李海燕 赵家良 张华 《眼科研究》 CSCD 北大核心 2007年第7期533-536,共4页

目的应用重组腺伴随病毒载体介导的神经营养素4(rAAV-NT4)基因转染鼠视网膜神经节细胞(RGCs),探讨转染后对细胞生长活性和凋亡的影响。方法应用rAAV-NT4转染培养的RGCs,RT-PCR检测外源性NT4基因在RGCs中的表达,ELISA法检测细胞培养液中... 目的应用重组腺伴随病毒载体介导的神经营养素4(rAAV-NT4)基因转染鼠视网膜神经节细胞(RGCs),探讨转染后对细胞生长活性和凋亡的影响。方法应用rAAV-NT4转染培养的RGCs,RT-PCR检测外源性NT4基因在RGCs中的表达,ELISA法检测细胞培养液中NT4的质量浓度,MTT法分析转染细胞生物活性,流式细胞学法检测转染细胞的凋亡比率。结果RT-PCR显示转染细胞表达外源性NT4基因,转染14d后培养液中NT4的质量浓度与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。转染6d和9dOD值与对照组间差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。rAAV-NT4转染细胞与对照组的凋亡比率差异无统计学意义(P>0.05)。结论rAAV-NT4可有效转染鼠RGCs,转染细胞可表达外源性NT4基因,生长活性改善。 展开更多

关键词 重组腺伴随病毒载体 神经营养素4 视网膜神经节细胞

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一种通用型重组2型腺伴随病毒载体的构建及外源基因表达的研究 被引量：2

11

作者 张桐 王文亮 +4 位作者 侯云德 杨新科 颜子颖 孙立连 王伯云 《西安医科大学学报》 CSCD 1997年第3期312-316,320,共6页

以野生型2型人腺伴随病毒（AAV－2）基因组载体pSSV9－int-为基础，构建了一种携带和表达真核基因的基础AAV载体pSSV9／MulV－neosv，表达了neo基因，并采用该载体组建了携带人白细胞介素-2cDNA的重组AAV载体pSSV9／MulV－neosv－IL－2... 以野生型2型人腺伴随病毒（AAV－2）基因组载体pSSV9－int-为基础，构建了一种携带和表达真核基因的基础AAV载体pSSV9／MulV－neosv，表达了neo基因，并采用该载体组建了携带人白细胞介素-2cDNA的重组AAV载体pSSV9／MulV－neosv－IL－2，转染A549细胞后表达了人白细胞介素-2基因。为应用腺伴随病毒作基因治疗研究提供了实验基础。 展开更多

关键词 腺伴随病毒 载体构建 基因表达 基因载体

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表达胰高血糖素样肽1重组腺伴随病毒载体的构建 被引量：1

12

作者 娄明武 梁冰 +2 位作者 张明东 杨广笑 王全颖 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2011年第28期5299-5302,共4页

背景:胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)在人体内半衰期过短限制了其应用。目的:构建可表达GLP-1的重组腺伴随病毒。方法:将NT4-GLP-1融合基因插入腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV中,构建pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装... 背景:胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)在人体内半衰期过短限制了其应用。目的:构建可表达GLP-1的重组腺伴随病毒。方法:将NT4-GLP-1融合基因插入腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV中,构建pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒。采用磷酸钙共沉淀法将辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140及pSSHG/NT4-GLP-1转染至293细胞系,用其感染Hela细胞。结果与结论:重组质粒pSSHG/NT4-GLP-1经限制性内切酶EcoRⅠ酶切鉴定可见342bp的目的片段,说明NT4-GLP-1融合基因已经成功重组于腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV内。免疫细胞化学结果显示,转染pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒的Hela细胞内有大量棕黄色颗粒,阳性率达到70%以上,说明NT4-GLP-1重组腺伴随病毒在细胞中可以表达GLP-1。 展开更多

关键词 胰高血糖素样肽1 腺伴随病毒 重组质粒 构建 组织构建

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肿瘤血管抑制肽alphastatin重组腺伴随病毒的制备 被引量：1

13

作者 郭世文 杨宇 +3 位作者 王全颖 廉民学 李涛 王东峰 《中华神经外科疾病研究杂志》 CAS 2006年第6期518-521,共4页

目的构建并产生肿瘤血管抑制肽alphastatin(Al)重组腺伴随病毒(rAAV)载体。方法将目的基因alphastatin插入载体质粒pSSHG-巨细胞病毒(CMV)的EcoRI和BamHI位点,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-Al。用腺病毒辅助质粒pFG140代替野生型腺病毒,... 目的构建并产生肿瘤血管抑制肽alphastatin(Al)重组腺伴随病毒(rAAV)载体。方法将目的基因alphastatin插入载体质粒pSSHG-巨细胞病毒(CMV)的EcoRI和BamHI位点,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-Al。用腺病毒辅助质粒pFG140代替野生型腺病毒,包装质粒pAAV/Ad及已构建的重组腺伴随病毒载体质粒,使用三质粒共转染法转染293细胞,包装得到腺伴随病毒(AAV)-Al。采用氯仿抽提、聚乙二醇沉淀回收纯化,斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果重组病毒rAAV-Al滴度约为2×1012颗粒/ml。结论成功制备了重组病毒rAAV-Al,提供了一种生产足量安全的rAAV-Al简单易行的方法,为肿瘤的基因治疗实验奠定了基础。 展开更多

关键词 alphastatin 腺伴随病毒 斑点杂交

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重组腺伴随病毒载体在肿瘤基因治疗中的作用 被引量：1

14

作者 郭世文 李涛 王东峰 《中华神经外科疾病研究杂志》 CAS 2006年第4期378-379,共2页

关键词 重组腺伴随病毒 肿瘤 基因治疗 载体

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人神经生长因子重组腺伴随病毒载体的构建 被引量：1

15

作者 马巍 刘淼 +1 位作者 杨广笑 王全颖 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期226-228,共3页

目的　为了研究人神经生长因子 (hNGF)基因导入急性脊髓损伤 (SCI)模型的治疗作用 ,构建并产生重组腺伴随病毒 (AAV)载体。方法　将hNGF外源性核酸片段插入AAV shuffer质粒 pSSHG Neo的KpnⅠ BamHⅠ位点构建AAV。用腺病毒辅助质粒 pFG1... 目的　为了研究人神经生长因子 (hNGF)基因导入急性脊髓损伤 (SCI)模型的治疗作用 ,构建并产生重组腺伴随病毒 (AAV)载体。方法　将hNGF外源性核酸片段插入AAV shuffer质粒 pSSHG Neo的KpnⅠ BamHⅠ位点构建AAV。用腺病毒辅助质粒 pFG14 0代替野生型腺病毒 ,包装质粒 pAAV/Ad及已构建的pSSHG Neo三质粒磷酸钙共沉淀法在肾胚胎 2 93细胞系中同源重组包装rAAV。使用地高辛标记的斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果　成功构建了重组病毒质粒pSSHG/hNGF ,经蔗糖梯度离心法获得rAAV组分 ,梯度稀释测得滴度为 1.4 6× 10 12 PFU·mL-1。结论　成功地制备了人神经生长因子重组腺伴随病毒 (rAAV/hNGF)载体 ,为SCI基因治疗实验奠定了基础。 展开更多

关键词 hNGF基因 重组腺伴随病毒(rAAV) 基因转移

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腺伴随病毒介导的NT4-ADNF-9对Corti器损伤保护的体外研究

16

作者 郑国玺 祝康 +3 位作者 韦俊荣 许珉 杨广笑 王全颖 《听力学及言语疾病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期46-50,共5页

目的将携载神经营养素(NT4)与活性依赖性神经营养因子-9(activity-dependent neurotrophicfactor-9,ADNF-9)融合基因的重组腺伴随病毒rAAV-NT4-ADNF-9转染体外培养的耳蜗Corti器,并观察该重组病毒对Corti器损伤的保护作用。方法体外分... 目的将携载神经营养素(NT4)与活性依赖性神经营养因子-9(activity-dependent neurotrophicfactor-9,ADNF-9)融合基因的重组腺伴随病毒rAAV-NT4-ADNF-9转染体外培养的耳蜗Corti器,并观察该重组病毒对Corti器损伤的保护作用。方法体外分离培养新生SD大鼠的耳蜗基底膜,应用氨基糖苷类毒性蛋白G-418建立体外Corti器损伤模型,将rAAV-NT4-ADNF-9转染体外培养的新生SD大鼠耳蜗细胞(Corti器),RT-PCR检测NT4-ADNF-9在Corti器的表达,并观察其对体外毛细胞的保护作用。结果成功分离培养了新生SD大鼠的耳蜗基底膜后,经重组腺伴随病毒转染,琼脂糖凝胶电泳检测结果显示NT4-ADNF-9在Corti器得到了表达;rAAV-NT4-ADNF-9保护组毛细胞损伤程度较G-418损伤组明显为轻,而G-418损伤组可见毛细胞大量缺失,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论构建的重组病毒rAAV-NT4-ADNF-9在体外可成功转染Corti器,并对Corti器具有保护作用,可用于基因治疗的研究。 展开更多

关键词 腺伴随病毒 活性依赖性神经营养因子-9 耳蜗毛细胞 感音神经性聋

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2型腺伴随病毒生物安全性的初步形态学观察

17

作者 张桐 王文亮 +2 位作者 候云德 杨新科 王伯云 《西安医科大学学报》 CSCD 1998年第2期164-167,共4页

用野生型AAV－2感染宿主293细胞后对细胞进行了形态学观察，并采用AAVCap基因探针检测了感染细胞标本中的野生型AAVDNA；采用携带β-半乳糖苷酶基因，而不含AAVrep基因及其表达产物的重组AAV作对照，感染293细胞后检测细胞内β-半乳糖... 用野生型AAV－2感染宿主293细胞后对细胞进行了形态学观察，并采用AAVCap基因探针检测了感染细胞标本中的野生型AAVDNA；采用携带β-半乳糖苷酶基因，而不含AAVrep基因及其表达产物的重组AAV作对照，感染293细胞后检测细胞内β-半乳糖苷酶表达产物，同时对细胞作形态学观察。结果显示野生型AAV－2感染宿主细胞后24～48h，多数细胞胞体收缩、变形，部分细胞死亡、脱落，用Cap基因探针从病变的293细胞基因组DNA中检测到了野生AAVDNA；而被重组AAV感染的293细胞表达了β-半乳糖苷酶，而未出现细胞病变，本结果提示野生型AAV对敏感宿主细胞可表现出毒性作用，其原因可能与rep产物的作用有关。 展开更多

关键词 腺伴随病毒 形态学 293细胞 安全性 载体

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腺伴随病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养的鼠视网膜神经节细胞转染的实验研究

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作者 李海燕 赵家良 张华 《眼科新进展》 CAS 2006年第10期737-739,共3页

目的评价重组腺伴随病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因(recombinant adeno-associated virus-mediated green fluorescence protein,rAAV-GFP)对体外培养的鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells ,RGCs)的转染效率和安全性。方法取出... 目的评价重组腺伴随病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因(recombinant adeno-associated virus-mediated green fluorescence protein,rAAV-GFP)对体外培养的鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells ,RGCs)的转染效率和安全性。方法取出生24 h内的SD乳鼠的视网膜神经上皮层,行视网膜神经细胞的体外混合培养;培养2 d后,按转染倍数(multiple oninfection,MOI)为10、102、103、104、105对细胞进行转染;5 d后行流式细胞仪检测细胞表达绿荧光的比率,并应用PE-Thy1 .1抗体标记RGCs ,评价不同MOI的rAAV-GFP对RGCs的转染效率。应用MTT比色方法检测各组细胞的生长活性。结果MOI为10、102、103、104、105时,对混合培养的全体细胞的转染效率分别为6·4 %、15.6 %、20.2 %、45.1 %和65.8 %,其中对RGCs的转染效率分别为11.7 %、22.5 %、27.7 %、52.0 %和75.3 %;rAAV-GFP转染RGCs后,细胞生长状态正常;MTT比色结果显示,各转染细胞和未转染细胞的光吸收值无显著性差异(P>0 .05)。结论 rAAV作为体外培养的SD乳鼠RGCs转染的载体是安全可行的,且对细胞生长无明显影响。 展开更多

关键词 重组腺伴随病毒载体 绿色荧光蛋白 视网膜神经节细胞 细胞转染

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β－半乳糖苷酶基因的腺伴随病毒（AAV－2）载体的构建及其在哺乳类细胞中的表达

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作者 张桐 王文亮 +4 位作者 王伯云 杨新科 颜子颖 段淑敏 候云德 《细胞与分子免疫学杂志》 CSCD 1996年第4期11-16,共6页

以野生型２型人类腺伴随病毒（ＡＡＶ－２）全基因组载体（ｐＳＳＶ９和ｐＳＳＶ９－ｉｎｔ－）为基础，构建了重组ＡＡＶ载体ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋）和ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（－），制备ＡＡＶ重组病毒，感染宿主... 以野生型２型人类腺伴随病毒（ＡＡＶ－２）全基因组载体（ｐＳＳＶ９和ｐＳＳＶ９－ｉｎｔ－）为基础，构建了重组ＡＡＶ载体ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋）和ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（－），制备ＡＡＶ重组病毒，感染宿主细胞后表达了β－半乳糖苷酶基因。此外，用脂质体转染法将载体导入２９３细胞和Ａ５４９细胞，进行了ＬａｃＺ基因瞬时表达研究。结果显示，重组ＡＡＶ载体（ＰＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋））ＬａｃＺ基因表达的动态变化特点是，转染后表达较早（１２～２４ｈ）出现，并迅速达到高峰值（经２４ｈ），随后较快下降（经４８～７２ｈ）并维持在较低水平。将启动子附近ｉｔｒ结构有差别的上述两载体转染宿主细胞７２ｈ后做表达水平比较，结果ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（－）在２９３细胞和Ａ５４９细胞中，ＬａｃＺ表达水平均高于ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋）（１．２倍～１．４倍），提示启动子附近ＡＡＶｉｔｒ结构的变异对表达有一定的影响。 展开更多

关键词 腺伴随病毒 基因治疗 载体 构建 Β-半乳糖苷酶

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重组腺伴随病毒载体表达人白细胞介素12的研究 被引量：1

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作者 郝晓萌 吴小兵 +2 位作者 伍志坚 舒斯云 侯云德 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期52-56,共5页

白细胞介素 12 (IL - 12 )具有广谱抗肿瘤、抗感染的作用 ,是由两个亚单位 40kD(p40 )和 35kD(p35 )通过二硫键构成的杂合体 ,有可能通过分别表达亚单位的方式来表达有功能活性的IL - 12。该实验尝试利用重组腺伴随病毒 (rAAV)载体进行... 白细胞介素 12 (IL - 12 )具有广谱抗肿瘤、抗感染的作用 ,是由两个亚单位 40kD(p40 )和 35kD(p35 )通过二硫键构成的杂合体 ,有可能通过分别表达亚单位的方式来表达有功能活性的IL - 12。该实验尝试利用重组腺伴随病毒 (rAAV)载体进行人IL - 12 (hIL - 12 )双亚基共表达 ,将hIL - 12的两个亚基分别克隆到AAV载体质粒pSNAV中 ,构建成 pSNAV -IL12 - p35和pSNAV -IL12 - p40质粒 ,经转染、G418筛选后建立了rAAV载体细胞株。采用先前建立的rAAV的生产方法 ,获得了rAAV -IL12 -p35和rAAV -IL12 - p40 ,在体外将两种rAAV共同感染BHK - 2 1细胞 ,48h后收集细胞培养上清进行免疫学和生物学活性检测。经ELISA检测 ,产生的hIL - 12 p70的含量为 10 185 pg/ml;在体外促进IFN -γ分泌实验中 ,加入hIL - 12的PBMC分泌的IFN -γ含量为 37 2mg/ml。实验结果说明 :采用两个AAV载体分别表达亚单位的方法可以表达具有功能活性的hIL - 12 ,为IL - 展开更多

关键词 人白细胞介素12 重组腺伴随病毒 载体 基因治疗 表达

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