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鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及遗传进化分析
1
作者 安乐乐 刘倩芸 +2 位作者 蓝秋菊 罗迅 赵永清 《江西农业大学学报》 北大核心 2025年第1期167-177,共11页
【目的】鸽腺病毒感染在全球鸽群中广泛分布,可引起多种临床症状,如呕吐、腹泻、肝脏损伤等,严重影响鸽的健康与养殖效益。建立一种快速高效检测鸽腺病毒Ⅰ型(PiAdV-Ⅰ)TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,为鸽腺病毒Ⅰ型临床检测及流行病... 【目的】鸽腺病毒感染在全球鸽群中广泛分布,可引起多种临床症状,如呕吐、腹泻、肝脏损伤等,严重影响鸽的健康与养殖效益。建立一种快速高效检测鸽腺病毒Ⅰ型(PiAdV-Ⅰ)TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,为鸽腺病毒Ⅰ型临床检测及流行病学调查提供技术平台。【方法】依据GenBank公布鸽腺病毒Ⅰ型Hexon基因保守区设计引物探针并构建重组质粒pCE2-TA-PiAdV-Ⅰ;优化反应体系和程序,绘制标准曲线、特异性、敏感性和重复性评价,建立鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法;扩增测序阳性临床样品的Hexon基因,使用MEGA5.0进行进化树构建及同源性分析。【结果】该TaqMan探针实时荧光定量PCR方法标准曲线y=-3.1081x+37.374,线性相关系数R2为0.9977,线性关系良好;与鸽疱疹病毒、鸽圆环病毒等鸽子其他常见病毒无交叉反应,具有良好的特异性;最低检测拷贝数为14.6 copies/μL,敏感性是常规PCR方法的10倍,具有高敏感性;组内和组间变异系数均低于1.1%,重复性好。通过检测112份鸽子病料样品,该TaqMan探针实时荧光定量PCR方法检测阳性率为69.64%(78/112),并且高于常规PCR方法阳性检出率65.18%(73/112)。此外,建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法与常规PCR方法的阳性符合率为100%,总体符合率为95.54%。3条测序毒株与Ⅰ型鸽腺病毒参考毒株同源性为99.47%~99.71%,遗传关系高度接近,表明可能由同一个原始毒株进化而来。【结论】研究建立的鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法线性关系良好、特异性强、敏感性高及重复性好,可快速高效检测出临床样品中的PiAdV-Ⅰ。此外,所扩增序列能够用于分析临床毒株遗传进化特征,有助于快速准确诊断鸽腺病毒感染及疫苗研发提供参考依据。 展开更多
关键词 鸽腺病毒Ⅰ型 Hexon基因 TaqMan探针实时荧光定量PCR 遗传进化分析 临床检测 流行病学调查
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牛传染性鼻气管炎病毒gE和gB基因荧光定量PCR检测方法的建立
2
作者 王慧荣 刘艺 +4 位作者 刘文俊 杨丽华 董春光 韩文儒 武守艳 《动物医学进展》 北大核心 2025年第5期74-79,共6页
为了检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),根据IBRV gE和gB基因保守序列分别设计一对特异性引物,构建重组质粒作为标准品,经优化反应体系和反应条件建立了IBRV gE和gB基因的SYBR GreenⅡ荧光定量PCR检测方法。以建立的荧光定量PCR方法检测... 为了检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),根据IBRV gE和gB基因保守序列分别设计一对特异性引物,构建重组质粒作为标准品,经优化反应体系和反应条件建立了IBRV gE和gB基因的SYBR GreenⅡ荧光定量PCR检测方法。以建立的荧光定量PCR方法检测重组质粒标准品pUC57-gE、pUC57-gB,结果显示浓度在10^(8)~10^(4)拷贝/μL时与Ct值有良好的线性关系,线性相关系数R2分别为0.997、0.996;该方法对重组质粒标准品pUC57-gE、pUC57-gB的最低检测限分别为4.74×10^(2)拷贝/μL、2.60×10^(2)拷贝/μL,敏感性较高;利用该方法检测IBRV、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、伪狂犬病病毒(PRV)、牛冠状病毒(BCoV)、巴氏杆菌、大肠埃希氏菌,只有IBRV检测为阳性,说明该方法特异性强;重复性试验结果显示批内、批间变异系数均低于1.5%,稳定性高。利用该方法和荧光定量PCR试剂盒分别对58份牛鼻拭子样品进行检测,结果显示两种方法符合率达98.3%。该方法具有强稳定性和高敏感性的特点,能为IBRV的检测和鉴别IBRV野毒株与gE基因缺失苗株提供技术支撑。 展开更多
关键词 牛传染性鼻气管炎病毒 荧光定量PCR gB和gE基因 检测
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多酶恒温快速扩增技术结合荧光探针快速检测日本血吸虫基因方法的建立
3
作者 章乐生 王旗 +7 位作者 汪峰峰 朱海 李清越 马晓荷 汪敏 王毓洁 汪天平 操治国 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CSCD 北大核心 2024年第4期481-486,共6页
目的结合多酶恒温快速扩增技术(MIRA)和荧光探针法,建立一种快速检测日本血吸虫特异性基因片段的方法。方法以日本血吸虫非长末端重复序列反转录转座子(SjR2)片段为靶序列,设计并合成3对引物和荧光探针,建立荧光MIRA法反应体系,PCR检测... 目的结合多酶恒温快速扩增技术(MIRA)和荧光探针法,建立一种快速检测日本血吸虫特异性基因片段的方法。方法以日本血吸虫非长末端重复序列反转录转座子(SjR2)片段为靶序列,设计并合成3对引物和荧光探针,建立荧光MIRA法反应体系,PCR检测,绘制扩增曲线。比较并筛选扩增效果较好的引物对和探针浓度;通过检测1 fg/µl、5 fg/µl、10 fg/µl、100 fg/µl、1 pg/µl和10 pg/µl等不同浓度的日本血吸虫成虫基因组DNA,评价该法的灵敏度;提取卫氏并殖吸虫、华支睾吸虫、东方次睾吸虫、颚口线虫及刚地弓形虫基因组DNA,并用荧光MIRA法检测,评价其特异度。耳缘静脉采集兔血,分离血清,制备含1 fg、5 fg、10 fg、100 fg、1 pg和10 pg日本血吸虫成虫DNA的兔模拟阳性血清并进行DNA提取,以荧光MIRA法检测,评估该法检测血清中日本血吸虫靶基因的最低限度。结果引物对1(SjR2‑1)的扩增效率较高,在反应第22个循环时(11 min)扩增出荧光产物,荧光值最高达170000;探针量为0.6µl/反应时具有较好的荧光强度和低荧光背景。建立的荧光MIRA法在39℃时第26个循环(13 min)时扩增出荧光产物,检测血吸虫成虫DNA的最低检出限为1 fg/反应。扩增产物电泳显示,血吸虫基因组DNA模板含量为10 pg、1 pg、100 fg、10 fg时,均有电泳条带出现,电泳显示的检测限为10 fg/反应,产物大小为186 bp。仅含有日本血吸虫成虫DNA的反应管出现荧光扩增曲线,检测卫氏并殖吸虫、华支睾吸虫、东方次睾吸虫、颚口线虫及刚地弓形虫等基因组DNA未出现明显荧光扩增曲线。不同浓度的血吸虫DNA模拟阳性血清中,DNA含量为1 pg和10 pg时,有阳性扩增曲线出现,最快于第16个循环(8 min内)即出现阳性荧光扩增信号,该法检测模拟阳性血清中血吸虫成虫DNA的最低检测限为1 pg/反应。结论成功建立了一种检测日本血吸虫特异性基因片段的荧光MIRA法,该法反应快速、敏感性高、特异性强,具有潜在的日本血吸虫病诊断应用价值。 展开更多
关键词 日本血吸虫 多酶恒温快速扩增技术 荧光探针 基因片段
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布鲁氏菌基因缺失株TaqMan荧光定量PCR检测方法
4
作者 宋前进 陈亚飞 +5 位作者 张静 刘治凤 徐誉彰 姜彦飞 丛帅 王小龙 《养殖与饲料》 2025年第3期51-56,共6页
[目的]建立布鲁氏菌基因缺失株荧光定量PCR方法,为其他布鲁氏菌毒株和基因缺失株鉴别诊断提供技术支持。[方法]根据GenBank中布鲁氏菌赤藓糖醇基因(eryA基因)设计合成特异性引物和探针,对引物、探针浓度、退火温度等反应条件进行优化后... [目的]建立布鲁氏菌基因缺失株荧光定量PCR方法,为其他布鲁氏菌毒株和基因缺失株鉴别诊断提供技术支持。[方法]根据GenBank中布鲁氏菌赤藓糖醇基因(eryA基因)设计合成特异性引物和探针,对引物、探针浓度、退火温度等反应条件进行优化后,检测该方法的特异性、敏感性和重复性。[结果]重组质粒标准品在1.56×10^(8)~1.56×10 copies/μL呈良好线性关系;特异性试验结果显示,该方法对其他14种常见细菌病毒均无交叉反应;敏感性试验结果显示该方法对布鲁氏菌的检测敏感度为100 copies/μL。重复性试验结果显示,组内和组间变异系数均小于2%。[结论]TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可用于布鲁氏菌基因缺失株和其他布鲁氏菌株的鉴别诊断。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 TaqMan荧光定量PCR 检测方法 鉴别诊断 基因缺失
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荧光定量PCR探针熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用研究
5
作者 张东浩 《中文科技期刊数据库（文摘版）医药卫生》 2024年第3期0185-0188,共4页
探讨在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,观察分析应用价值。方法 本研究的时长段在2022年6月到2023年6月,统共1000例结核患者接受治疗,所有病患都拓展了抗结核药物的测验,且每一位患者的标本均予以荧光定... 探讨在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,观察分析应用价值。方法 本研究的时长段在2022年6月到2023年6月,统共1000例结核患者接受治疗,所有病患都拓展了抗结核药物的测验,且每一位患者的标本均予以荧光定量PCR探针熔解曲线法检测,药物敏感性测定结果为黄金基准,考察判辨荧光定量PCR探针熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的诊断效能。结果 针对1000例的标本中,经过液体药敏试验检测显示对利福平药物耐药例数250例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者;对异烟肼医药有耐药性的液体药敏试验500例,应用溶解曲线检测耐药性包含了470例;经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数170例,予以熔解曲线法显示耐药140例。经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数300例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者。熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的灵敏度分别为84.00%、84.00%、47.06%、66.67%;特异度分别为96.00%、90.00%、84.34%、94.29%;准确度分别为93.00%、97.00%、91.00%、86.00%。结论 在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,可得到较高的应用价值,灵敏度、特异度、准确度较高,可筛查结核病患者对利福平、异烟肼、乙胺丁醇等药物的耐药性,为临床治疗疾病提供可靠的依据。 展开更多
关键词 结核病 结核分枝杆菌 耐药基因检测 荧光定量PCR探针熔解曲线法 应用价值
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应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR技术快速检测青海省海西州鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌耐链霉素基因 被引量：1
6
作者 张琪 李胜 +8 位作者 靳娟 何建 杨晓艳 辛有全 柏吉祥 周奎章 张晓璐 蒋可 代瑞霞 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期1198-1200,I0001,共4页
目的 应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR技术快速检测青海省海西州鼠疫自然疫源地鼠疫菌耐链霉素基因,为今后该地区突发人间鼠疫的精准临床用药提供理论依据。方法 分离培养海西地区1957—2009年间取自鼠疫患者、媒介昆虫及中间宿主的... 目的 应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR技术快速检测青海省海西州鼠疫自然疫源地鼠疫菌耐链霉素基因,为今后该地区突发人间鼠疫的精准临床用药提供理论依据。方法 分离培养海西地区1957—2009年间取自鼠疫患者、媒介昆虫及中间宿主的代表性鼠疫菌110株,提取其DNA,针对我国链霉素耐药基因rpsl基因设计引物P-F和P-R和TaqMan-MGB探针Probe1 [FAM]和Probe2[VIC],利用荧光定量PCR技术,进行耐药rpsl基因筛查。结果 110株被试菌株中FAM检测均为阳性(RFU峰值>2000);VIC阳性的为0株(RFU峰值<200)。阳性对照和空白对照成立。结论 实时荧光定量PCR结果显示,该地区未检测出耐链霉素菌株。 展开更多
关键词 鼠疫菌 TAQMAN-MGB探针 荧光定量PCR技术 耐链霉素 青海省海西州
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鸽圆环病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用
7
作者 刘存 刘砚涵 +6 位作者 祝夕超 李法凯 张栋 邵新宇 田野 孙圣福 陈静 《动物医学进展》 北大核心 2025年第1期68-73,共6页
为了建立鸽圆环病毒(PiCV)的快速检测方法,依据PiCV Rep基因的保守序列区域设计了荧光定量PCR的引物和探针,并建立了快速检测PiCV的荧光定量PCR方法。结果显示,构建的PiCV荧光定量PCR方法在1.44×10,1~1.44×10^(7)/μL拷贝标... 为了建立鸽圆环病毒(PiCV)的快速检测方法,依据PiCV Rep基因的保守序列区域设计了荧光定量PCR的引物和探针,并建立了快速检测PiCV的荧光定量PCR方法。结果显示,构建的PiCV荧光定量PCR方法在1.44×10,1~1.44×10^(7)/μL拷贝标准品间具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9866;该方法具有良好的敏感性,其检测病毒系列含量下限为14.4拷贝/μL;该方法特异性良好,与鸽新城疫病毒、鸽疱疹病毒、鸽腺病毒等病毒及鸽组织DNA不存在交叉反应;该方法重复性较好,批内重复试验变异系数均介于0.454%~0.473%,批间重复试验变异系数均介于0.367%~0.869%。与传统普通PCR方法相比,所建立的PiCV荧光定量PCR方法敏感性更高,临床样品PiCV检出率更高,两者检测符合率为93.75%。结果表明,所建立的PiCV荧光定量PCR方法为临床检测鸽圆环病毒提供了一种快速、灵敏的检测方法,为PiCV的流行病学调查和主动监测提供了技术支撑。 展开更多
关键词 鸽圆环病毒 荧光定量PCR Rep基因 检测
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牦牛源牛肠道病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
8
作者 林伟山 韩元 +5 位作者 马豆豆 李春花 童生林 李秀萍 雷萌桐 王光华 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2025年第1期123-128,共6页
为了快速、准确地检测牦牛源牛肠道病毒(Bovine enterovirus,BEV),试验根据GenBank中牦牛源BEV-NH2株3D基因序列(登录号为PP746571)设计可用于检测青海牦牛源BEV的实时荧光定量PCR特异性引物,通过构建标准质粒和绘制标准曲线建立牦牛源... 为了快速、准确地检测牦牛源牛肠道病毒(Bovine enterovirus,BEV),试验根据GenBank中牦牛源BEV-NH2株3D基因序列(登录号为PP746571)设计可用于检测青海牦牛源BEV的实时荧光定量PCR特异性引物,通过构建标准质粒和绘制标准曲线建立牦牛源BEV实时荧光定量PCR检测方法,对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,并分别应用该方法及普通RT-PCR方法对青海省海北地区6个牦牛繁育基地的286份腹泻牦牛粪便样品进行检测,计算两种方法的符合率。结果表明:建立的牦牛源BEV实时荧光定量PCR检测方法扩增产物的熔解曲线单一,Tm值在85.6~85.8℃之间,无引物二聚体和非特异性扩增;质粒浓度在3×10^(2)~3×10^(8)copies/μL范围内时标准曲线的线性关系良好,Ct值在10.88~29.63之间,回归方程为y=-3.16x+38.01,R^(2)=0.9964;仅可检测到牦牛源BEV-NH2株,检测不到牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)MY01株、牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)MY20株和牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BcoV)QL21株;对牦牛源BEV的最低检测限为3×10^(2)copies/μL;当模板浓度为3×10^(2)copies/μL、3×10^(3)copies/μL和3×10^(7)copies/μL时,Ct值的变异系数分别为1.28%、1.74%和0.15%,均在1.80%以下。286份牦牛粪便样品中,采用建立的实时荧光定量PCR检测方法检出BEV阳性样品182份,阳性率为63.64%;采用普通RT-PCR方法检出BEV阳性样品114份,阳性率为39.86%;两种方法的符合率为76.22%。说明本研究建立的牦牛源BEV实时荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于牦牛腹泻临床样本的BEV检测。 展开更多
关键词 牦牛 牛肠道病毒 3D基因 腹泻 检测方法 实时荧光定量PCR
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鸭瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用
9
作者 于江玮 程慧敏 +4 位作者 林健 杨宝琳 黄程 杨志远 胡格 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期765-773,共9页
为建立一种鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)TaqMan荧光定量PCR快速检测方法,基于DPV US 6基因保守序列设计特异性引物和探针,构建重组质粒DPV-US6标准品,对方法敏感性、特异性和重复性进行评价,并应用于DPV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上增... 为建立一种鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)TaqMan荧光定量PCR快速检测方法,基于DPV US 6基因保守序列设计特异性引物和探针,构建重组质粒DPV-US6标准品,对方法敏感性、特异性和重复性进行评价,并应用于DPV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖及人工感染鸭器官组织上分布规律研究。结果显示,成功建立了DPV TaqMan荧光定量PCR检测方法,该方法最低检测限可以达到10 copies·μL^(-1),与番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭坦布苏病毒、鸭呼肠孤病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭甲型肝炎病毒(I型和III型)和鸭衣原体均无交叉反应,批间和批内变异系数均小于2.0%。DPV-AX株感染CEF细胞后,病毒核酸拷贝数检测结果表明,4~8 h病毒增殖缓慢,12~60 h迅速上升,60 h达到最高峰,72~144 h逐渐下降,与TCID 50法测定的病毒滴度相比,两种检测方法具有良好相关性,可实现拷贝数替代TCID 50。DPV人工感染鸭组织脏器的病毒载量分布检测表明,肝脏中的病毒载量最高。本试验建立的检测方法为研究DPV-AX株在CEF上的增殖规律提供工具。 展开更多
关键词 鸭瘟病毒 US 6基因 TAQMAN探针 荧光定量PCR 增殖规律 人工感染
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比率荧光探针可视化定量检测烟用香精香料中的铅离子
10
作者 胡立中 黄兰 +1 位作者 林辉 林丹 《烟草科技》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期11-20,共10页
为方便、快捷、准确地测量烟用香精香料中的铅离子含量,通过使用蓝色碳量子点作为信号探针,该探针对铅离子产生荧光响应作用,选用一种对铅离子无反应且荧光颜色有所不同的材料作为参比探针,通过调整这两种材料的混合比例,构建比率型荧... 为方便、快捷、准确地测量烟用香精香料中的铅离子含量,通过使用蓝色碳量子点作为信号探针,该探针对铅离子产生荧光响应作用,选用一种对铅离子无反应且荧光颜色有所不同的材料作为参比探针,通过调整这两种材料的混合比例,构建比率型荧光探针,建立了对烟用香精香料中铅离子质量分数的可视化定量分析方法。结果表明:①在紫外光照射下,随着铅离子的质量分数从0至20 mg/kg逐步增加,荧光探针溶液的颜色明显从蓝色转变为粉红色。在烟用香精香料中,铅离子的质量分数与探针的荧光强度值比(I_(460)/I_(580))表现出良好的线性关系,且最低检测限为1.32μg/L。②该探针可在5 min内完成对铅离子的检测,并表现出优异的选择性和抗干扰性。③探针溶液的颜色变化可以通过智能手机的红绿蓝色彩模式数值(即RGB值)进行识别,构建数值与铅离子质量分数的对应标准工作曲线,可简化分析过程,实现铅离子的快速检测,检测限为7.04μg/L。④通过对烟用香精香料实际样品的检测,结果的平均回收率在91.14%~103.80%范围内,相对标准偏差在3.01%~5.23%范围内。该方法操作简便、快捷、准确性好,可实现烟用香精香料中铅离子质量分数的现场、快速、可视化定量检测。 展开更多
关键词 烟用香精香料 铅离子 碳点 比率荧光探针 可视化定量检测
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荧光定量PCR在转基因农产品检测中的应用与优化
11
作者 任志莹 王颖 +2 位作者 陈芳芳 张亚昭 李会 《中外食品工业》 2024年第9期71-73,共3页
基因工程技术持续演进过程中,研究人员逐渐认识到转基因食品在满足人类需求方面的巨大潜力。本文旨深入探讨实时荧光定量聚合酶链式反应技术在转基因食品检测领域的应用现状。详细分析该技术的运用原理并提出优化建议。随着技术的持续创... 基因工程技术持续演进过程中,研究人员逐渐认识到转基因食品在满足人类需求方面的巨大潜力。本文旨深入探讨实时荧光定量聚合酶链式反应技术在转基因食品检测领域的应用现状。详细分析该技术的运用原理并提出优化建议。随着技术的持续创新,PCR技术能在提升检测效率、优化成本控制和增强检测精确度等方面实现更大的进步,从而为保障转基因食品安全,推动基因工程技术的稳健发展。 展开更多
关键词 荧光定量PCR 转基因 农产品 检测
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生鲜乳中16种致病微生物多重荧光定量PCR集成检测技术的建立与初步应用 被引量：1
12
作者 肖沙 赵格 +6 位作者 赵建梅 向祝 宋时萍 刘娜 张喜悦 徐莹 王君玮 《中国动物检疫》 CAS 2024年第7期86-95,116,共11页
为满足生鲜乳中微生物快速通量检测的需求,建立多重荧光定量PCR集成方法,从而快速检测生鲜乳中潜在的16种致病微生物,通过设计致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌等目标菌株的特异性引物和探针,优化反应体系,验证方法的特异性、敏... 为满足生鲜乳中微生物快速通量检测的需求,建立多重荧光定量PCR集成方法,从而快速检测生鲜乳中潜在的16种致病微生物,通过设计致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌等目标菌株的特异性引物和探针,优化反应体系,验证方法的特异性、敏感性等,建立了稳定的4组多重集成荧光定量PCR反应体系,并利用人工污染的生鲜乳样品对所建立的方法和传统培养法进行了验证比较。结果显示:各对引物探针对目标菌株均能有效识别并扩增,每组体系中引物探针未发现交叉反应,对其余3组体系的12株非目标菌均未有特异性反应;组内和组间变异系数均低于3%;该方法对布鲁氏菌的最低检出限为10^(2) CFU/mL,对阪崎肠杆菌、志贺菌、沙门菌等7种致病微生物的最低检出限为10^(3) CFU/mL,对蜡样芽胞杆菌、弯曲杆菌、结核分枝杆菌等8种致病微生物的最低检出限为10^(4) CFU/mL;所建方法和传统培养法对人工污染不同致病菌的各25份样品检测结果基本一致。结果表明,本研究建立的多重集成荧光定量PCR方法灵敏度高,特异性及重复性好,可实现对生鲜乳样品中多种致病微生物的快速高效检测,为生鲜乳微生物性风险监测提供了技术支撑。 展开更多
关键词 致病微生物 多重荧光定量PCR 生鲜乳 集成检测技术
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toxR基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测副溶血弧菌 被引量：28
13
作者 覃倚莹 吴晖 +4 位作者 肖性龙 杨晓泉 张经纬 余以刚 李惠芳 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期1837-1842,共6页
以toxR基因为靶基因,通过优化反应条件建立了快速检测副溶血弧菌的TaqMan实时荧光PCR方法。特异性试验表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,而与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特杆菌等多种常见的食源性病原菌没有交叉反应;灵敏度... 以toxR基因为靶基因,通过优化反应条件建立了快速检测副溶血弧菌的TaqMan实时荧光PCR方法。特异性试验表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,而与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特杆菌等多种常见的食源性病原菌没有交叉反应;灵敏度试验表明,该方法最少可检测到25个拷贝的toxR基因重组质粒,对纯培养物和模拟食品样品直接检测的灵敏度分别为21 cfu/mL和210 cfu/g;重复性试验表明,同一样品于试验内及试验间的变异系数分别为0.9%和1.3%;所制作的标准曲线在2.5×101～2.5×106拷贝数之间有较好的线性关系,能对副溶血弧菌进行准确的定量分析。结果表明,本研究所建立的副溶血弧菌实时荧光PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能进行定量检测,而且检测时间从核酸抽提到出实验结果仅需要3 h,是快速检测副溶血弧菌的有效手段。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 实时荧光定量PCR toxR基因 TAQMAN探针 检测
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实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立 被引量：55
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作者 陈颖 徐宝梁 +3 位作者 苏宁 王媛 王丙武 葛毅强 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2003年第8期65-69,共5页
采用实时荧光定量PCR技术 ,通过使用特异的引物和探针 ,对大豆中的内源基因Lectin和转基因大豆中的外源基因EPSPS进行了定量检测 ,建立了Monsanto公司生产的商业化转基因大豆Roundup Ready○R的定量PCR检测方法。该方法的检测灵敏度 <... 采用实时荧光定量PCR技术 ,通过使用特异的引物和探针 ,对大豆中的内源基因Lectin和转基因大豆中的外源基因EPSPS进行了定量检测 ,建立了Monsanto公司生产的商业化转基因大豆Roundup Ready○R的定量PCR检测方法。该方法的检测灵敏度 <0 0 1% ,是国际上设定的转基因最低限量的 10 展开更多
关键词 实时荧光定量PCR技术 检测 转基因大豆 内源基因Lectin 外源基因NEPSPS
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实时荧光定量PCR技术在转基因玉米检测中的应用研究 被引量：43
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作者 陈颖 徐宝梁 +2 位作者 苏宁 葛毅强 王曙光 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期602-607,共6页
采用实时荧光定量PCR技术 ,通过使用特异的引物和探针 ,对玉米中的内源基因Invertase和转基因玉米Mon810、Event 176中的外源基因进行了定量检测 ,建立了商业化转基因玉米Mon 810 (YieldGard)和Event 176 (Maximizer)的定量PCR检测方法... 采用实时荧光定量PCR技术 ,通过使用特异的引物和探针 ,对玉米中的内源基因Invertase和转基因玉米Mon810、Event 176中的外源基因进行了定量检测 ,建立了商业化转基因玉米Mon 810 (YieldGard)和Event 176 (Maximizer)的定量PCR检测方法。该方法的检测灵敏度小于 0 .0 1% ,是国际上设定的转基因最低限量的 10 展开更多
关键词 实时荧光定量PCR技术 转基因玉米 定量检测 食品安全
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实时荧光PCR技术定量检测转基因大豆方法的研究 被引量：13
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作者 吴影 宋丰顺 +3 位作者 陆徐忠 赵伟 杨剑波 李莉 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期1733-1737,共5页
以转基因大豆Roundup Ready为材料,通过特异性引物和探针,对转基因大豆中外源基因cp4-epsps进行了定量检测。研究发现Taqman荧光探针法和SYBR荧光染料法均可作为转基因大豆定量检测的方法,但前者比后者具更高的检测灵敏度和精确度,其检... 以转基因大豆Roundup Ready为材料,通过特异性引物和探针,对转基因大豆中外源基因cp4-epsps进行了定量检测。研究发现Taqman荧光探针法和SYBR荧光染料法均可作为转基因大豆定量检测的方法,但前者比后者具更高的检测灵敏度和精确度,其检测阈值可降到0.05%,变异系数为0.09%～0.53%。在此基础上,建立和优化了Taqman探针实时荧光定量PCR检测技术体系,有助于提高转基因作物及产品的生物安全性定量检测的准确度和可靠性。 展开更多
关键词 实时荧光PCR 转基因大豆 TAQMAN探针 SYBR染料 定量检测
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实时荧光定量PCR技术在转基因检测中的应用 被引量：29
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作者 敖金霞 高学军 +1 位作者 仇有文 郭士成 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期141-144,共4页
实时荧光定量PCR技术是一种新型的核酸定性、定量检测、分析技术。随着转基因产品大规模商业化,转基因生物的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内广泛的争论和关注。实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR反... 实时荧光定量PCR技术是一种新型的核酸定性、定量检测、分析技术。随着转基因产品大规模商业化,转基因生物的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内广泛的争论和关注。实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR反应后不需电泳检测等优点,使RQ-PCR逐步成为转基因检测的重要工具。 展开更多
关键词 实时荧光定量PCR TaqMan探针法 SYBR Green I染料法 转基因检测
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尼帕病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法建立 被引量：1
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作者 孙彤 孙竹筠 +3 位作者 刘静宜 王培培 苏苌 陈鸿军 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第1期122-128,共7页
尼帕病毒病是一种人畜共患烈性传染病,为能够快速特异检测该病毒,本研究根据尼帕病毒(NiV)N基因序列保守区设计特异性引物和探针,建立一种针对NiV的TaqMan探针荧光定量PCR(qPCR)检测方法,该方法特异性好、敏感性高、稳定性强,可鉴别NiV... 尼帕病毒病是一种人畜共患烈性传染病,为能够快速特异检测该病毒,本研究根据尼帕病毒(NiV)N基因序列保守区设计特异性引物和探针,建立一种针对NiV的TaqMan探针荧光定量PCR(qPCR)检测方法,该方法特异性好、敏感性高、稳定性强,可鉴别NiV与其他猪病病毒,扩增效率为102%,最低检测限14.8 copies/μL,敏感性高于常规PCR 10倍,该检测方法的建立可为NiV的快速检测提供技术手段,对促进猪类养殖业的健康发展具有重要意义。 展开更多
关键词 尼帕病毒 N基因 TAQMAN探针 实时荧光定量PCR
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ETA基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测铜绿假单胞菌的研究 被引量：12
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作者 肖性龙 张经纬 +4 位作者 龚俊 潘艳萍 余以刚 杨晓泉 吴晖 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期581-585,共5页
铜绿假单胞菌是临床上常见致病菌,传统的检测方法有各种弊端。本研究对该细菌的ETA基因用生物信息学方法加以分析,选取相对保守且高度特异的DNA序列,设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立FQ-PCR (fluorescence quantitative PCR)检... 铜绿假单胞菌是临床上常见致病菌,传统的检测方法有各种弊端。本研究对该细菌的ETA基因用生物信息学方法加以分析,选取相对保守且高度特异的DNA序列,设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立FQ-PCR (fluorescence quantitative PCR)检测PA的方法。通过对梯度浓度的铜绿假单胞菌基因组DNA样品进行FQ-PCR检测和对多种细菌的DNA进行扩增,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。试验结果表明,对比现有的检测方法,以ETA基因为靶基因,基于TaqMan探针的快速FQ-PCR检测技术有更高的灵敏度和更好的特异性等优点,具有很好的研究价值和应用前景。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 外毒素A 荧光定量PCR TAQMAN探针 检测
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番茄叶片基因组DNA快速制备技术及其在基于实时荧光定量PCR的转基因检测中的应用 被引量：12
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作者 王伟伟 朱长青 +2 位作者 刘小花 陈昆松 徐昌杰 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期1017-1022,共6页
以番茄（Solanum lycopersicum L.cv.Micro-Tom）叶片为试材,建立了一种简便快速制备叶片基因组DNA的方法。2~20 mm2的叶片即可满足制备要求,制备过程只需一种提取试剂、只涉及1次移液和1次离心操作,不涉及沉淀。确定了所制备的DNA用于... 以番茄（Solanum lycopersicum L.cv.Micro-Tom）叶片为试材,建立了一种简便快速制备叶片基因组DNA的方法。2~20 mm2的叶片即可满足制备要求,制备过程只需一种提取试剂、只涉及1次移液和1次离心操作,不涉及沉淀。确定了所制备的DNA用于实时荧光定量PCR的合适用量为0.1~0.2μL（反应总体积为12.5μL）,发现过量模板的使用可降低PCR效率且可导致扩增失败。该项DNA快速制备及相适应的实时荧光定量PCR技术已成功应用于番茄转基因植株检测。 展开更多
关键词 番茄 DNA快速制备 实时荧光定量PCR 转基因检测
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