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重叠PCR法构建嗜酸乳杆菌分选酶A基因外源打靶片段 被引量：1
1
作者 何嘉怡 王文文 +3 位作者 吴京 潘道东 吴振 曾小群 《宁波大学学报（理工版）》 CAS 2017年第6期21-27,共7页
为比较单步法、分步法重叠PCR在构建嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus ATCC4356分选酶A(SrtA)外源打靶片段的差异性,设计了5对具有20~25 bp互补末端的引物,分别扩增两对上下游同源臂和卡那霉素基因,先采用分步法、单步法重叠PCR构... 为比较单步法、分步法重叠PCR在构建嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus ATCC4356分选酶A(SrtA)外源打靶片段的差异性,设计了5对具有20~25 bp互补末端的引物,分别扩增两对上下游同源臂和卡那霉素基因,先采用分步法、单步法重叠PCR构建不含筛选基因的外源打靶片段SrtA-up2-SrtA-down2,比较两者优劣,随后取较优者构建含抗生素筛选基因的打靶片段SrtA-up1-Kan-SrtA-down1.结果显示单步法优于分步法,非特异性扩增少,拖尾现象少,且扩增打靶片段SrtA-up1-Kan-SrtA-down1条带单一,无非特异性扩增.即在构建两种外源打靶片段时,单步法重叠PCR优于分步法PCR,为之后构建嗜酸乳杆菌基因打靶载体、构建融合基因打下了基础. 展开更多
关键词 嗜酸乳杆菌 外源打靶片段 单步法重叠pcr 分步法重叠pcr
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重叠PCR法构建人心房肌SK2(KCNN2)基因表达质粒及鉴定和序列分析 被引量：7
2
作者 谭晓秋 陈桂兰 +4 位作者 李涛 毛亮 井上勋 杨艳 曾晓荣 《中国应用生理学杂志》 CAS CSCD 2012年第4期381-384,共4页
目的:小电导钙激活钾通道亚型2(SK2)在心房肌功能活动中起重要作用,但是由于其表达密度低,直接进行RT-PCR一步法无法得到该基因(KCNN2)的编码区全长序列,本研究旨在采用Overlapping PCR(重叠PCR)法进行基因全长序列的扩增和表达质粒的构... 目的:小电导钙激活钾通道亚型2(SK2)在心房肌功能活动中起重要作用,但是由于其表达密度低,直接进行RT-PCR一步法无法得到该基因(KCNN2)的编码区全长序列,本研究旨在采用Overlapping PCR(重叠PCR)法进行基因全长序列的扩增和表达质粒的构建,探讨其在长片段基因扩增的应用。方法:收集人心房肌标本,采用提取总RNA之后逆转录为cDNA,分三段设计KCNN2基因(AY258141)引物进行分段扩增,同时进行分段测序,然后采用Overlapping PCR得到KCNN2基因编码区全长序列,通过限制性酶切位点定向克隆到表达载体pIRES-hrGFP上。采用酶切法和测序法进行鉴定。结果:三段KCNN2基因扩增产物大小与预测值一致,最后得到的表达质粒测序结果与基因库数据基本一致。结论:成功构建人心房肌SK通道基因表达质粒pIRES-hrGFP-SK2,Overlapping PCR能够很好的用于长片段基因扩增。 展开更多
关键词 小电导钙激活钾通道 重叠pcr 基因工程
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降落-重叠PCR法四重融合构建平菇同源重组片段 被引量：10
3
作者 柴冉 孙强 邱立友 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期375-379,共5页
对多个长片段的基因融合目前仍缺少有效的方法.本文提出一种新的融合PCR策略,即在常规的重叠PCR的第1步和第2步均增加1个降落PCR程序,减少不适当的退火温度和PCR产物3'端额外碱基A对片段融合、扩增的影响,提高正确融合与扩增的效率... 对多个长片段的基因融合目前仍缺少有效的方法.本文提出一种新的融合PCR策略,即在常规的重叠PCR的第1步和第2步均增加1个降落PCR程序,减少不适当的退火温度和PCR产物3'端额外碱基A对片段融合、扩增的影响,提高正确融合与扩增的效率.结果表明,为构建平菇葡聚糖合成酶启动子的同源重组序列,在4个长度分别是1 015 bp、2 822 bp、2 206 bp和1 008 bp的片段进行融合时,在重叠PCR的第1步加上退火温度61.5℃～57.5℃、每降落0.5℃进行1个循环的降落PCR程序,在重叠PCR的第2步加上退火温度60℃～56℃、每降落0.5℃进行1个循环的降落PCR程序,经过1次PCR即获得顺序正确的全长融合片段.测序结果与4个片段序列的一致性达到98.5%,降落-重叠PCR法对多个长片段的基因融合具有较高的应用价值. 展开更多
关键词 基因融合 重叠pcr 降落pcr 同源重组
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植物偏爱密码子优化HPV18L1全长基因的重叠PCR合成 被引量：6
4
作者 赵莹 张丽仪 +1 位作者 刘昌政 周晓红 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期387-392,共6页
目的以重叠PCR方法合成植物偏爱密码子优化后的人乳头瘤病毒18L1全长基因。方法自GenBank获取国内外所发布的HPV18L1全长基因序列,经生物信息学分析后选定目标序列,经Synthetic Gene Designer及JCat(JavaCodon Adaptation Tool)分析软... 目的以重叠PCR方法合成植物偏爱密码子优化后的人乳头瘤病毒18L1全长基因。方法自GenBank获取国内外所发布的HPV18L1全长基因序列,经生物信息学分析后选定目标序列,经Synthetic Gene Designer及JCat(JavaCodon Adaptation Tool)分析软件将此序列原始密码子改造为植物偏爱密码子,在C端加入蛋白纯化标签His-tag,获得改造后的HPV18L1全长序列(mHPV18L1)。结合酶切位点分析将mHPV18L1设计为204～477bp的五个大片段LS1-LS5,再将每个大片段分割成57～59bp的5～11个寡聚核苷酸短链,设计合成5对内引物和1对外引物,经重叠PCR扩增获得mHPV18L1全长基因,纯化后将其克隆入pMD18T载体,酶切、测序鉴定插入子。结果以重叠PCR成功扩增获得mHPV18L1全长,pMD18T-mHPV18L1重组质粒经酶切、PCR鉴定均得到预期1749bp大小的片段,并经测序验证。结论获得以植物偏爱密码子进行序列优化的mHPV18L1全长基因及其重组质粒pMD18T-mHPV18L1,为后续mHPV18L1的植物转化研究奠定了一定的工作基础。 展开更多
关键词 HPV18L1 重叠pcr 密码子优化
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优化重叠PCR法进行单链抗体基因扩增和点突变 被引量：4
5
作者 符勇耀 李正国 +3 位作者 李泮志 邓伟 杨迎伍 王中康 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期150-155,共6页
利用重叠PCR技术扩增单链抗体基因或位点突变是抗体文库构建或稳定表达的关键和难点，国内外文献未见其方法学的系统报道。以不同VH、VL和Linker基因为拼接模板进行重叠PCR，针对影响重叠PCR扩增的拼接类型，引物设计，反应条件等进行... 利用重叠PCR技术扩增单链抗体基因或位点突变是抗体文库构建或稳定表达的关键和难点，国内外文献未见其方法学的系统报道。以不同VH、VL和Linker基因为拼接模板进行重叠PCR，针对影响重叠PCR扩增的拼接类型，引物设计，反应条件等进行优化。结果表明两段重叠连接比三段更容易实现，且扩增效果好；引物的互补序列长度一般应大于15bp，且在18—24bp时扩增效果最好；退火温度在52—600C，Mg^2＋浓度在1．5—2．5mM时对拼接的效果影响较小；直接或间接使用拼接模板均可以实现重叠PCR的扩增。利用优化策略，首次构建了抗除虫菊酯的scFv基因文库并引入抗XAC糖蛋白scFv基因的点突变，为除虫菊酯抗体文库构建和抗XAC重组抗体的稳定表达奠定了基础。 展开更多
关键词 重叠pcr 优化 单链抗体基因 点突变
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用改进的重叠PCR引入血管内皮生长因子基因突变 被引量：3
6
作者 白向阳 吕安国 +2 位作者 吴文芳 孙静 牛瑞芳 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2004年第2期181-184,共4页
血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的PCR产物克隆于T载体上 ,经转化JM1 0 9感受态菌株后 ,随机挑取 8个白斑菌落 ,混合后制成混合模板 .采用 3条引物 ,做两轮重叠PCR反应 ,获得了VEGF的突变基因 ,经PCR鉴定 ,酶... 血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的PCR产物克隆于T载体上 ,经转化JM1 0 9感受态菌株后 ,随机挑取 8个白斑菌落 ,混合后制成混合模板 .采用 3条引物 ,做两轮重叠PCR反应 ,获得了VEGF的突变基因 ,经PCR鉴定 ,酶切鉴定和测序分析表明所得基因为目的产物 .实践证明这种突变方法简单快速 。 展开更多
关键词 点突变 血管内皮生长因子 重叠pcr 基因突变
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重叠PCR一步法对三种淀粉合成酶融合基因的构建 被引量：3
7
作者 陈国梁 张金文 +2 位作者 王蒂 陈宗礼 杨波波 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期38-43,共6页
采用重叠PCR一步法对马铃薯块茎3种淀粉合成关键酶gbss、ssⅢ和ssⅡ的基因片段进行融合.结果表明:该方法在PCR反应体系中通过6个引物3个模板扩增得到1个含有马铃薯块茎3种淀粉合成关键酶gbss、ssⅢ和ssⅡ基因片段的融合基因gs3s2;与经... 采用重叠PCR一步法对马铃薯块茎3种淀粉合成关键酶gbss、ssⅢ和ssⅡ的基因片段进行融合.结果表明:该方法在PCR反应体系中通过6个引物3个模板扩增得到1个含有马铃薯块茎3种淀粉合成关键酶gbss、ssⅢ和ssⅡ基因片段的融合基因gs3s2;与经典的重叠PCR方法相比,该方法不需对PCR产物进行回收,而只需一个PCR反应就可以构建得到融合基因,是一种快速、方便有效的构建融合基因的方法. 展开更多
关键词 重叠pcr 淀粉合成酶 融合基因 马铃薯
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链重叠PCR构建抗HIV免疫毒素及其表达与鉴定 被引量：3
8
作者 金洪涛 金宁一 +3 位作者 李臻 李昌 付延军 王宏 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期94-96,共3页
目的提高抗HIV免疫毒素DT-ScFv原核表达的可溶性与生物活性。方法利用链重叠PCR融合的方法,构建了免疫毒素DT-ScFv,二者之间添加了connector序列,免疫毒素基因PCR连接测序以后,将其克隆入pET28a质粒,在BL21(DE3)工程菌中诱导表达,通过... 目的提高抗HIV免疫毒素DT-ScFv原核表达的可溶性与生物活性。方法利用链重叠PCR融合的方法,构建了免疫毒素DT-ScFv,二者之间添加了connector序列,免疫毒素基因PCR连接测序以后,将其克隆入pET28a质粒,在BL21(DE3)工程菌中诱导表达,通过免疫印迹鉴定表达的重组蛋白,并通过与表达HIV-1gp120的靶细胞的间接免疫荧光实验,验证免疫毒素的细胞识别结合能力。结果本研究成功地构建了免疫毒素DT-ScFv,经原核表达证明目的蛋白以部分可溶的形式存在于表达菌中,添加的connector序列有助于DT-ScFv在细胞中获得正确折叠,重组免疫毒素能与表达gp120的细胞发生特异性的识别结合。结论利用链重叠PCR融合的方法,添加connector序列,有助于提高免疫毒素表达的可溶性与生物活性。本研究对抗HIV免疫毒素的活性研究与应用研究具有重要的意义。 展开更多
关键词 免疫毒素 链重叠pcr 原核表达
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重叠PCR法构建副猪嗜血杆菌外源打靶基因 被引量：3
9
作者 张念章 储岳峰 +3 位作者 赵萍 高鹏程 贺英 逯忠新 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期186-190,共5页
利用重叠PCR法构建了包含副猪嗜血杆菌血清5型hhdA基因上、下游同源臂(H-up、H-down)和卡那霉素抗性基因(Kan)的外源打靶基因Hup-kan-Hdown。通过对反应条件进行优化,发现退火温度为50.5℃,加入H-up、H-down和Kan各为5μL(450 ng)时得到... 利用重叠PCR法构建了包含副猪嗜血杆菌血清5型hhdA基因上、下游同源臂(H-up、H-down)和卡那霉素抗性基因(Kan)的外源打靶基因Hup-kan-Hdown。通过对反应条件进行优化,发现退火温度为50.5℃,加入H-up、H-down和Kan各为5μL(450 ng)时得到Hup-kan-Hdown的量最多。将此外源打靶基因的两端引入PstI和SacI酶切位点,克隆至具有迁移作用的自杀质粒pDS132,构建了可在大肠杆菌E.coliSM10-λpir中稳定遗传的打靶载体,为下一步建立副猪嗜血杆菌的高效基因打靶系统奠定基础。 展开更多
关键词 副猪嗜血杆菌 重叠pcr 外源打靶基因
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重叠PCR法构建宫颈癌相关的EGFR基因G719S和T790M融合重组载体 被引量：3
10
作者 董巍檑 向花花 +4 位作者 彭华 龚咏晴 周晶 张宏全 郭紫芬 《临床检验杂志》 CAS CSCD 2018年第2期139-141,147,共4页
目的构建包含与宫颈癌相关的EGFR基因G719S和T790M位点重组p MD19-exon18-exon20载体,为制备突变型EGFR基因重组载体提供模板。方法以健康人全血基因组DNA作为模板,设计2对有重叠互补区的特异性引物,对EGFR基因的exon18和exon20两片段... 目的构建包含与宫颈癌相关的EGFR基因G719S和T790M位点重组p MD19-exon18-exon20载体,为制备突变型EGFR基因重组载体提供模板。方法以健康人全血基因组DNA作为模板,设计2对有重叠互补区的特异性引物,对EGFR基因的exon18和exon20两片段分别进行扩增,用重叠PCR技术将exon18和exon20片段进行连接,再将连接产物exon18-exon20片段插入p MD19-T质粒,构建成野生型p MD19-exon18-exon20载体,转入至大肠埃希菌感受态细胞DH5α中进行表达,利用菌液PCR和基因组测序进行鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示,exon18和exon20两位点扩增片段在778 bp和596 bp处有清晰的目的条带,两片段的融合产物exon18-exon20片段可在1 374 bp处见一清晰目的条带;经菌液PCR和基因组测序结果鉴定,EGFR基因融合重组质粒均与预期结果一致。结论利用重叠PCR法将exon18和exon20片段进行融合,且成功构建了EGFR基因重组表达载体。 展开更多
关键词 EGFR基因 载体构建 宫颈癌 重叠pcr
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利用重叠PCR技术对OsAMT1.2进行定点突变 被引量：2
11
作者 李宝珍 李素梅 +1 位作者 施卫明 苏彦华 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期69-72,共4页
铵是植物吸收利用的主要氮源之一,而铵转运蛋白对铵的吸收、转运和代谢方面有重要的作用。为了深入研究水稻铵转运蛋白的结构功能特性,利用重叠PCR技术对OsAMT1.2蛋白质序列中保守的253 aa和257 aa的苯丙氨酸(F)和丝氨酸(S)分别突变为... 铵是植物吸收利用的主要氮源之一,而铵转运蛋白对铵的吸收、转运和代谢方面有重要的作用。为了深入研究水稻铵转运蛋白的结构功能特性,利用重叠PCR技术对OsAMT1.2蛋白质序列中保守的253 aa和257 aa的苯丙氨酸(F)和丝氨酸(S)分别突变为丙氨酸,成功获得了相应的2个点突变基因。因此,重叠PCR技术是一种简单有效的进行体外基因重组和突变的方法,对于研究高等植物功能基因的结构功能特性具有重要的意义。 展开更多
关键词 水稻 铵转运蛋白 OsAMT1.2 点突变 重叠pcr
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重叠PCR技术在构建sodAP基因表达载体中的应用 被引量：1
12
作者 叶艳华 何冰芳 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2008年第9期762-764,共3页
目的应用重叠PCR技术,构建节杆菌DMDC12的Mn-SOD基因sodAP的重组表达质粒,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法设计两对引物,分别扩增启动子P121和sodAP基因序列,利用重叠PCR技术,将启动子P121与sodAP基因相连接并测序,连接产物插入原核表... 目的应用重叠PCR技术,构建节杆菌DMDC12的Mn-SOD基因sodAP的重组表达质粒,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法设计两对引物,分别扩增启动子P121和sodAP基因序列,利用重叠PCR技术,将启动子P121与sodAP基因相连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pET-22b(+),构建重组质粒pET-PsodAP,转化E.coliBL21(DE3)进行表达。用SDS-PAGE检测表达产物,光密度定量分析法分析目的蛋白表达量。结果启动子P121和sodAP基因的连接产物经凝胶电泳检测,可见约800bp的目的条带,测序结果与预期相符;重组表达质粒pET-PsodAP经双酶切鉴定,表明构建正确;目的蛋白在E.coliBL21(DE3)中获得了表达,表达量占菌体总蛋白的19%。结论应用重叠PCR技术,成功构建了sodAP基因的重组表达质粒,并在E.coliBL21(DE3)中获得表达,为Mn-SOD的进一步工业化生产奠定了基础。 展开更多
关键词 重叠pcr 节杆菌DMDC12 sodAP基因 表达载体
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重叠PCR合成HPV16 E6、E7基因并构建植物表达双元载体 被引量：1
13
作者 芦春斌 高忱 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期143-146,共4页
HPV16型为主的多种HPV病毒可诱发机体发生宫颈癌等疾病,以重叠PCR法人工合成HPV16 E6、E7致癌基因的融合基因,以之为目的基因构建了无选择标记基因(Marker-Free)双元载体,期望转化番茄开发新型宫颈癌治疗性疫苗-转基因植物口服疫苗。通... HPV16型为主的多种HPV病毒可诱发机体发生宫颈癌等疾病,以重叠PCR法人工合成HPV16 E6、E7致癌基因的融合基因,以之为目的基因构建了无选择标记基因(Marker-Free)双元载体,期望转化番茄开发新型宫颈癌治疗性疫苗-转基因植物口服疫苗。通过生物信息学分析HPV16 E6、E7基因,设计并合成密码子优化的靶基因E6-E7融合基因;并在目的基因的上游引入分子佐剂LTB基因,与Kozak序列等表达元件相偶联,以提高目的基因在植物表达系统的表达水平、增强其诱导黏膜免疫的免疫原性。目前已构建pX6-LTB-E7和pX6-LTB-E7-E6两个番茄转化双元载体。采用番茄Marker-Free系统转化和表达HPV16 E6、E7目的基因可以在转化后代中剔除标记基因,从而消除由标记基因可能引起的转基因植物口服疫苗的安全性问题,为HPV转基因植物口服疫苗应用奠定基础。 展开更多
关键词 HPV16 E6 E7 宫颈癌 重叠pcr
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用重叠PCR合成植物甜蛋白brazzein基因 被引量：3
14
作者 陈波 《生物技术》 CAS CSCD 2007年第4期43-45,共3页
目的:为在泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中进行表达,采用重叠PCR合成了植物甜蛋白brazzein基因。方法:根据非洲热带植物Pentadiplandra brazzeana产生的天然甜蛋白brazzein的氨基酸序列及泡盛曲霉糖化酶基因glaA的密码子偏爱性,设计并... 目的:为在泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中进行表达,采用重叠PCR合成了植物甜蛋白brazzein基因。方法:根据非洲热带植物Pentadiplandra brazzeana产生的天然甜蛋白brazzein的氨基酸序列及泡盛曲霉糖化酶基因glaA的密码子偏爱性,设计并化学合成了2对3’-端互补的寡聚核苷酸,通过PCR延伸获得2条末端有部分重叠的双链核苷酸片段,再通过重叠PCR扩增,合成了用于泡盛曲霉表达的植物甜蛋白brazzein基因。结果:将brazzein基因克隆到pMD18-T载体,随机挑取6个重组质粒测序,结果1个重组质粒有连续4个碱基缺失,3个重组质粒各有1个碱基缺失,2个重组质粒携带的brazzein基因核苷酸序列完全正确。结论:合成的brazzein基因大小162 bp,编码54个氨基酸,推断的氨基酸序列与Pentadiplandra brazzeana产生的天然brazzein完全一致,表明植物甜蛋白brazzein基因成功合成。 展开更多
关键词 植物甜蛋白 BRAZZEIN基因 合成 重叠pcr 泡盛曲霉
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重叠PCR-酶切连接法人工合成风疹病毒E1基因及其重组质粒构建
15
作者 芦春斌 马贞丽 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期544-549,共6页
目的:利用重叠PCR-酶切连接法人工合成风疹病毒E1基因的全长序列。方法:对风疹E1基因进行生物信息学分析,根据大肠杆菌密码子偏爱性对其密码子进行优化;设计多对寡核苷酸引物,以重叠PCR法分别合成该基因的3个片段,测序鉴定后以酶切连接... 目的:利用重叠PCR-酶切连接法人工合成风疹病毒E1基因的全长序列。方法:对风疹E1基因进行生物信息学分析,根据大肠杆菌密码子偏爱性对其密码子进行优化;设计多对寡核苷酸引物,以重叠PCR法分别合成该基因的3个片段,测序鉴定后以酶切连接法将各段拼接成全长为1 443 bp的RVrE1,将E1基因的全长序列克隆导入原核表达载体pET32a。结果:分别进行8轮、5轮和6轮的重叠PCR扩增,合成风疹基因3个片段;以酶切连接法将3个片段拼接成全长rE1基因并克隆入pET32a构建成载体pET32-RV rE1,PCR、酶切和测序鉴定结果表明,合成的E1基因大小、序列与预期相符;构建获得重组质粒pET32-RV rE1。结论:成功合成了密码子优化的风疹病毒E1基因并构建其重组质粒pET32-RV rE1。 展开更多
关键词 风疹E1基因 重叠pcr 酶切连接 密码子优化
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用重叠PCR策略构建抑制NF-κB活性的IKBA基因突变体
16
作者 毛亮 黄文俊 +2 位作者 黄鹂 李雪 党喜同 《西南医科大学学报》 2017年第3期236-239,共4页
目的:用重叠PCR方法将IKBA基因三个碱基进行点突变A94G、G95C、T106G。方法:根据重叠PCR原理设计IKBA基因两条末端引物及A94G、G95C、T106G突变引物,从HUVEC细胞克隆IKBA基因,将其作为模板进行第一次PCR,将第一次PCR产物稀释10 000~50 ... 目的:用重叠PCR方法将IKBA基因三个碱基进行点突变A94G、G95C、T106G。方法:根据重叠PCR原理设计IKBA基因两条末端引物及A94G、G95C、T106G突变引物,从HUVEC细胞克隆IKBA基因,将其作为模板进行第一次PCR,将第一次PCR产物稀释10 000~50 000倍后作为模板,扩增突变体IKBAm,并克隆到p LVX-IRES-Zs Green载体,用双酶切及DNA测序筛选阳性质粒。结果:从HUVEC细胞克隆的IKBA基因及其突变体IKBAm基因长度均为954 bp,编码317个氨基酸,与IKBA基因相比,突变体IKBAm基因3个位点发生突变94A→G,95G→C,106T→G,编码的32/36位氨基酸由Ser突变为Ala。结论:成功克隆人IKBA基因及其32/36 Ser→Ala突变体IKBAm。 展开更多
关键词 重叠pcr IKBA 点突变 NF-ΚB
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通过重叠PCR技术构建番茄转录因子THM27植物表达载体
17
作者 李传东 齐兴柱 +2 位作者 黄小娟 杨腊英 黄俊生 《中国园艺文摘》 2010年第6期1-4,共4页
myb转录因子是一类调控类黄酮生物合成途径中多种酶表达的转录调控因子。本研究通过Trizol的方法成功地从番茄叶片中提取了高质量的RNA,利用巢氏PCR技术从番茄中成功克隆了myb转录因子家族成员之一THM27(839bp),将其与CMV35S启动子及其... myb转录因子是一类调控类黄酮生物合成途径中多种酶表达的转录调控因子。本研究通过Trizol的方法成功地从番茄叶片中提取了高质量的RNA,利用巢氏PCR技术从番茄中成功克隆了myb转录因子家族成员之一THM27(839bp),将其与CMV35S启动子及其终止序列以重叠PCR的方法组合成CMV35S启动子-THM27-终止子组合元件,并将其构建到双元表达载体pCAMBIA1 302。 展开更多
关键词 类黄酮 转录因子 重叠pcr 表达载体
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重叠PCR合成乙型肝炎病毒核心抗原基因及其在大肠杆菌中表达
18
作者 王丽 龚舒 +2 位作者 段承刚 李娟 何涛 《泸州医学院学报》 2009年第4期347-349,共3页
目的:构建乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因的融合表达质粒并在原核系统表达,为治疗性疫苗的研制奠定基础。方法:根据大肠杆菌偏爱密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对HBcAg基因进行密码子优化,分成24条长约40bp寡核苷酸片段,将重... 目的:构建乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因的融合表达质粒并在原核系统表达,为治疗性疫苗的研制奠定基础。方法:根据大肠杆菌偏爱密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对HBcAg基因进行密码子优化,分成24条长约40bp寡核苷酸片段,将重叠PCR合成的HBcAg基因插入到pET30a中,经限制性核酸内切酶酶切鉴定和核酸序列分析无误后转化BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达情况。结果:酶切和测序鉴定表明,成功构建了重组质粒pET30a/HBcAg,SDS-PAGE分析显示目的蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中获得高表达,表达量占总菌体蛋白的64.3%。结论:应用重叠PCR合成HBcAg基因并在大肠杆菌中获得了高效表达。 展开更多
关键词 乙肝病毒核心抗原 重叠pcr 原核表达
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重叠PCR法构建PTEN基因3位点的融合重组载体 被引量：1
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作者 龚咏晴 彭华 +2 位作者 周晶 张宏全 郭紫芬 《临床检验杂志》 CAS CSCD 2016年第10期788-790,共3页
目的构建包含与子宫内膜癌相关的PTEN基因3位点的重组p MD19-exon 5-exon 8载体。方法以健康人全基因组DNA为模板,设计2对有重叠区的特异性引物分别扩增PTEN基因的exon 5和exon 8片段,利用重叠PCR技术,将exon 5和exon 8片段进行连接,再... 目的构建包含与子宫内膜癌相关的PTEN基因3位点的重组p MD19-exon 5-exon 8载体。方法以健康人全基因组DNA为模板,设计2对有重叠区的特异性引物分别扩增PTEN基因的exon 5和exon 8片段,利用重叠PCR技术,将exon 5和exon 8片段进行连接,再将连接产物exon 5-exon 8片段插入p MD19-T质粒,构建成重组p MD19-exon 5-exon 8载体,转化入大肠埃希菌感受态细胞DH5α进行表达,利用菌液PCR和基因组测序进行鉴定。结果 exon 5-exon 8片段经凝胶电泳检测,可在1 253 bp处见一清晰的目的条带,PTEN基因融合重组质粒经菌液PCR及测序结果鉴定,均与预期结果一致。结论应用重叠PCR法将exon 5和exon 8片段进行融合,并成功构建了PTEN基因融合重组表达载体。 展开更多
关键词 PTEN基因 重叠pcr 子宫内膜癌 载体构建
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利用重叠PCR法克隆里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因cel1a 被引量：1
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作者 汪伟 孙春娃 +5 位作者 杨爱文 金皓 姚萍 袁维维 徐建明 周玉珍 《江苏农业科学》 2018年第21期42-45,共4页
在利用里氏木霉降解纤维素为葡萄糖继而发酵生产液体燃料和大宗化学品的工业生产过程中,降解纤维素为葡萄糖是关键的一步。β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的活性及其表达时起到至关重要的双重作用。为了研究β-葡萄糖苷酶Cel1a在里氏木霉R... 在利用里氏木霉降解纤维素为葡萄糖继而发酵生产液体燃料和大宗化学品的工业生产过程中,降解纤维素为葡萄糖是关键的一步。β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的活性及其表达时起到至关重要的双重作用。为了研究β-葡萄糖苷酶Cel1a在里氏木霉Rut C-30中对纤维素酶诱导表达及其酶活性的影响,以里氏木霉的基因组DNA为模板,设计扩增看家基因(β-actin)的启动子(Pact)和cel1a的引物,分别进行Pact、cel1a的PCR扩增,然后利用重叠PCR将Pact、cel1a连成1个片段Pact-cel1a,再通过酶切成功地将Pact-cel1a片段连接到p CAMBIA1300二元质粒上,从而为后续研究β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的酶活性及其表达过程中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 重叠pcr β-葡萄糖苷酶cel1a 里氏木霉
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