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脊髓灰质炎病毒缺陷型重组载体系统 被引量：1
1
作者 李琦涵 《国外医学（流行病学．传染病学分册）》 1997年第5期219-221,共3页
第一代脊髓灰质炎病毒重组载体系统由于受到构象的限制而不能有效地表达外源抗原,缺陷性重组载体系统则可利用外源基因置换脊髓灰质炎病毒结构蛋白P1编码区而插入较大片段的外源基因,因此具有较广阔的前景。其基本原理是以外源基因置换... 第一代脊髓灰质炎病毒重组载体系统由于受到构象的限制而不能有效地表达外源抗原,缺陷性重组载体系统则可利用外源基因置换脊髓灰质炎病毒结构蛋白P1编码区而插入较大片段的外源基因,因此具有较广阔的前景。其基本原理是以外源基因置换脊髓灰质炎病毒的P1基因,同时以另一途径提供P1结构蛋白,形成缺陷性病毒颗粒。此颗粒可以感染新的细胞,并表达其重组的外源抗原,但不产生感染性病毒颗粒。此系统为利用脊髓灰质炎病毒表达大片段外源抗原提供了技术的可能。 展开更多
关键词 脊髓灰质炎病毒 重组载体系统 缺陷型
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在我国流行的脊髓灰质炎中发现脊灰病毒Ⅰ型自然重组株 被引量：7
2
作者 方肇寅 O.Kew +10 位作者 任斌 郑渡平 温乐英 杨辰夫 苏锦 陈美光 郑焕英 孟宪坤 张振国 刘复林 H.Yoshikura 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 1993年第3期195-202,共8页
脊髓灰质炎病毒(PV)是引起脊髓灰质炎的最主要的病毒。我们在研究PV1野毒株的分子流行病学时,发现了一株PV1自然重组病毒。用Sabin 1特异PCR检定该毒株基因组2505～2601区段,或用两个Sabin 1特异RNA探针分别打点杂交检定641～740和2502... 脊髓灰质炎病毒(PV)是引起脊髓灰质炎的最主要的病毒。我们在研究PV1野毒株的分子流行病学时,发现了一株PV1自然重组病毒。用Sabin 1特异PCR检定该毒株基因组2505～2601区段,或用两个Sabin 1特异RNA探针分别打点杂交检定641～740和2502～2575区段时,推断它可能为野毒株;而测定VP1/2A连接区段3296～3445序列时,又表明它为疫苗株。向5′端扩大测序,从3262起的5′侧有与我国PV1野毒株相同的许多核苷酸取代,证明它为野毒株和疫苗株的重组病毒,重组位点为3262/3263。实验中建立了检测该重组病毒的特异的PCR方法。检测我国10个省市、自治区47份PV1分离株中,5个省区14份麻痹病例由重组病毒感染引起。这些重组株在我们测序的3155～3445区段序列彼此几乎相同(同源性≥96.7％),推断它们可能是某病儿受野毒株、疫苗株双重感染产生重组病毒后的子代病毒。有关该重组病毒的毒力、免疫原性、传播性等正在进一步研究中。 展开更多
关键词 脊髓灰质炎病毒 重组病毒
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在我国流行的脊髓灰质炎中发现脊灰病毒Ⅰ型自然重组株 被引量：1
3
作者 方肇寅 郑渡平 +7 位作者 任斌 温乐英 章菁 张振国 陈美光 郑焕英 孟宪坤 刘复林 《医学研究通讯》 2000年第5期15-16,共2页
消灭脊灰是预防医学的重要课题,1991年时我国仍是世界上脊灰流行区之一,其主要病原为Ⅰ型脊髓灰质炎病毒(PV1),为弄清PV在我国的流行情况,我们组织全国主要省区防疫站协作自选进行“我国PV1野毒株的分子流行病学研究”课题。地方同志负... 消灭脊灰是预防医学的重要课题,1991年时我国仍是世界上脊灰流行区之一,其主要病原为Ⅰ型脊髓灰质炎病毒(PV1),为弄清PV在我国的流行情况,我们组织全国主要省区防疫站协作自选进行“我国PV1野毒株的分子流行病学研究”课题。地方同志负责脊灰病人粪便样品的采集、病毒的分离和部分病毒血清型检定,本实验室负责从各地的PV分离株中用RT—PCR和打点杂交方法区别疫苗相关株或野毒株。 展开更多
关键词 脊髓灰质炎 脊灰病毒I型自然重组株 流行病学
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脊髓灰质炎病毒重组体的构建及其抗原性状分析
4
作者 李琦涵 姜莉 +2 位作者 昝云红 赵红玲 郭仁 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 1998年第2期86-91,共6页
以脊髓灰质炎病毒（以下简称脊灰病毒）为载体构建的重组体活病毒可以做为探讨脊灰病毒的抗原结构和特性的有益手段。在构建重组有甲型肝炎病毒小片段抗原多肽的重组脊灰病毒基础上，分析了脊灰病毒VP1上中和抗原位点I的空间构象特点，... 以脊髓灰质炎病毒（以下简称脊灰病毒）为载体构建的重组体活病毒可以做为探讨脊灰病毒的抗原结构和特性的有益手段。在构建重组有甲型肝炎病毒小片段抗原多肽的重组脊灰病毒基础上，分析了脊灰病毒VP1上中和抗原位点I的空间构象特点，并探讨了插入的外源抗原片段对其空间结构的可能影响。 展开更多
关键词 脊髓灰质炎病毒 重组体 抗原空间构象
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脊髓灰质炎病毒与痘苗病毒重组体的构建及表达
5
作者 戴长柏 李奇涵 +4 位作者 袁天喜 胡凝珠 苏晔 郭仁 候云德 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 1991年第4期147-150,共4页
含脊髓灰质炎病毒1型(简称 PV1)全基因7.4Kb cDNA 和编码 PV1外壳蛋白 VP12.5Kb 的 cDNA 片段的两株重组痘苗病毒(RV-1和 RV-2)表达了 PV1抗原。经荧光标记的抗 PV1型特异性单克隆抗体检测,感染了 RV-1和 RV-2的 Herp-2细胞呈阳性荧光... 含脊髓灰质炎病毒1型(简称 PV1)全基因7.4Kb cDNA 和编码 PV1外壳蛋白 VP12.5Kb 的 cDNA 片段的两株重组痘苗病毒(RV-1和 RV-2)表达了 PV1抗原。经荧光标记的抗 PV1型特异性单克隆抗体检测,感染了 RV-1和 RV-2的 Herp-2细胞呈阳性荧光反应。免疫印迹实验证实两株重组痘苗病毒分别表达 PV1抗原三条和两条特异性蛋白带。免疫家兔后能诱导产生抗 PV1中和抗体。本文对重组病毒表达 PV1抗原的效率进行了初步讨论。 展开更多
关键词 脊髓灰质炎病毒 重组痘苗病毒基因表达
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我国脊髓灰质炎病毒Ⅰ型自然重组株抗原性的单克隆抗体分析
6
作者 方肇寅 章菁 +5 位作者 柯昌文 李平 李军延 张振国 孟宪坤 陈美光 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 1996年第3期277-280,共4页
我国脊髓灰质炎病毒Ⅰ型自然重组株抗原性的单克隆抗体分析方肇寅，章菁，柯昌文，李平，李军延，张振国，孟宪坤，陈美光Ｈ、Ｙｏｓｈｉｋｕｒａ关键词脊髓灰质炎，重组病毒，单克隆抗体，中和试验脊髓灰质炎是危害儿童健康的世界性主... 我国脊髓灰质炎病毒Ⅰ型自然重组株抗原性的单克隆抗体分析方肇寅，章菁，柯昌文，李平，李军延，张振国，孟宪坤，陈美光Ｈ、Ｙｏｓｈｉｋｕｒａ关键词脊髓灰质炎，重组病毒，单克隆抗体，中和试验脊髓灰质炎是危害儿童健康的世界性主要疾病，自从应用疫苗以来，该病在许... 展开更多
关键词 脊髓灰质炎病毒 重组病毒 单克隆抗体
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脊髓灰质炎病毒2A蛋白在重组病毒中的功能研究
7
作者 李琦涵 戴长柏 +5 位作者 袁天喜 胡凝株 苏晔 郭仁 侯云德 陶应双 《中国病毒学》 CSCD 1992年第1期43-47,共5页
应用所构建的不同脊髓灰质炎病毒-痘苗病毒(下简称PV-VV)重组体,探讨脊髓灰质炎病毒(下简称PV)2A蛋白在重组病毒中的作用。所得到的四个以不同PV基因片段插入痘苗病毒(下简称VV)TK区而形成的重组病毒均有PV抗原的表达,并可诱导抗体产生... 应用所构建的不同脊髓灰质炎病毒-痘苗病毒(下简称PV-VV)重组体,探讨脊髓灰质炎病毒(下简称PV)2A蛋白在重组病毒中的作用。所得到的四个以不同PV基因片段插入痘苗病毒(下简称VV)TK区而形成的重组病毒均有PV抗原的表达,并可诱导抗体产生,但此表达水平明显受到2A蛋白的影响。同时,重组病毒对不同细胞的适应性亦有变化。对此,本文进行了初步的探讨。 展开更多
关键词 重组病毒 脊髓灰质炎 病毒蛋白
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脊髓灰质炎病毒载体研究进展 被引量：2
8
作者 蒋燕军 《国外医学（病毒学分册）》 2003年第1期13-17,共5页
脊髓灰质炎病毒是小核糖核酸病毒科成员 ,是单正链 RNA病毒。从上世纪八十年代以来 ,人们一直致力于发展脊髓灰质炎病毒载体 ,先后出现了抗原嵌合载体、PV复制子、多聚蛋白融合载体及双表达载体等类型。近年 ,脊髓灰质炎病毒载体用于在... 脊髓灰质炎病毒是小核糖核酸病毒科成员 ,是单正链 RNA病毒。从上世纪八十年代以来 ,人们一直致力于发展脊髓灰质炎病毒载体 ,先后出现了抗原嵌合载体、PV复制子、多聚蛋白融合载体及双表达载体等类型。近年 ,脊髓灰质炎病毒载体用于在中枢神经系统中定点表达外源蛋白 ,引起了人们的重视。本文对脊髓灰质炎病毒载体的类型、特点、应用及最新进展作一综述。 展开更多
关键词 脊髓灰质炎 病毒 载体 研究进展 脊髓灰质炎病毒 减毒株活疫苗
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脊髓灰质炎病毒缺陷型载体瞬时表达系统Ⅰ的构建
9
作者 李琦涵 赵红玲 +4 位作者 王丽春 孙明 姜莉 董承红 王炯 《中国病毒学》 CSCD 1999年第2期116-122,共7页
为探索可表达较大片段外源基因的脊灰病毒重组载体，以ＨＢＶＳ基因置换脊灰病毒的Ｐ１基因，同时以另一途径提供脊灰病毒Ｐ１结构蛋白，经转染入Ｈｅｌａ细胞中形成缺陷型重组病毒颗粒，此病毒可以感染新的细胞，并表达其重组的外源... 为探索可表达较大片段外源基因的脊灰病毒重组载体，以ＨＢＶＳ基因置换脊灰病毒的Ｐ１基因，同时以另一途径提供脊灰病毒Ｐ１结构蛋白，经转染入Ｈｅｌａ细胞中形成缺陷型重组病毒颗粒，此病毒可以感染新的细胞，并表达其重组的外源基因，但不产生子代病毒。实验结果表明，这种瞬时表达系统的构建，为脊灰病毒缺陷型重组载体用于基因转导技术打下基础。 展开更多
关键词 脊髓灰质炎病毒 缺陷型重组体 外源基因
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用脊髓灰质炎病毒作表达载体的研究进展
10
作者 严家新 《国外医学（微生物学分册）》 北大核心 1995年第2期7-9,21,共4页
用脊髓灰质炎病毒(PV)减毒株构建的表达载体可分3种类型;PV抗原嵌合体、有缺损的PV杂交复制子和非缺损的PV杂交病毒。本文对这3种类型PV表达载体的研究进展进行综述。
关键词 脊髓灰质炎病毒 表达载体 疫苗 载体
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中国脊髓灰质炎病毒疫苗株基因变异的分析 被引量：17
11
作者 李杰 张礼壁 +5 位作者 米山彻夫 侯晓辉 郑红 方勇 原稔 荻原昭夫 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 1996年第4期291-298,共8页
从急性弛缓性麻痹（ＡＦＰ）病例分离的３２株脊髓灰质炎（脊灰）病毒，在ＷＰ１编码区，经ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法鉴定，并经核酸测序进一步证实为疫苗株。其中５株为Ⅰ型疫苗株，１６株Ⅱ型疫苗株，１１株Ⅲ型疫苗株。以同样的分析方法... 从急性弛缓性麻痹（ＡＦＰ）病例分离的３２株脊髓灰质炎（脊灰）病毒，在ＷＰ１编码区，经ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法鉴定，并经核酸测序进一步证实为疫苗株。其中５株为Ⅰ型疫苗株，１６株Ⅱ型疫苗株，１１株Ⅲ型疫苗株。以同样的分析方法检测这些毒株基因组的３Ｄ聚合酶编码区，发现２株Ⅰ型疫苗株在３Ｄ区的４３１个核苷酸序列为野毒序列，即这２株为Ｓａｂｕｎｌ因型（ＶＰ１）与野毒基因型（３Ｄ）重组株；其余３株Ⅰ型疫苗株未发现基因重组，１６株Ⅱ型疫苗株中１１株为Ｓａｂｉｎ２基因型（ＶＰ１）与Ｓａｂｉｎ３基因型（３Ｄ）重组株，３株为Ｓａｉｂｎ２基因型（ＶＰ１）与（Ｓａｂｉｎ１＋Ｓａｂｉｎ２）基因型（３Ｄ）重组株，其余２株未发现基因重组。１１株Ⅲ型疫苗株中只有１株发生重组，为Ｓａｂｉｎ３基因型（ＶＰ１）与Ｎｏｎ－Ｓａｂｉｎ基因型（３Ｄ）重组株。另外，对５＇末端非编码区与神经毒力相关的关键位点（Ⅰ型的４８０－Ｇ和５２５－Ｕ，Ⅱ型的４８１－Ａ及Ⅲ型的４２２－Ｕ）基因的检测发现，５株Ⅰ型疫苗株中，１株在位点５２５－Ｕ突变，碱基Ｃ置换Ｕ；３株在位点４８０－Ｇ突变，碱基Ａ置换Ｇ；另１株未发现突变。１６株Ⅱ型疫苗株均在位点４８１－Ａ突变，碱基Ｇ置换Ａ。 展开更多
关键词 脊髓灰质炎病毒 基因重组 点突变
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生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒 被引量：6
12
作者 衡燮 李桂兰 +7 位作者 奚光跃 温嘉纳 沈伟 何秀莲 唐成丽 廖国阳 姜述德 孙明波 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2008年第12期1083-1084,共2页
目的应用生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒。方法用7L、75L和550L生物反应器逐级放大培养Vero细胞,每天取样进行细胞计数。在550L生物反应器中培养脊髓灰质炎病毒,观察细胞病变,并检测病毒感染性滴度。结果一级细胞培养(灌流培养法)... 目的应用生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒。方法用7L、75L和550L生物反应器逐级放大培养Vero细胞,每天取样进行细胞计数。在550L生物反应器中培养脊髓灰质炎病毒,观察细胞病变,并检测病毒感染性滴度。结果一级细胞培养(灌流培养法)、二级细胞培养(循环培养法)和三级细胞培养(批培养法)的平均细胞密度分别为2.79×106、2.38×106和1.04×106个/ml,一级培养的细胞倍增数最高;病毒培养体积达350L,病毒收获液滴度大于7.625lgCCID50∕ml。结论通过三级放大工艺,可大规模培养脊髓灰质炎病毒。 展开更多
关键词 生物反应器 脊髓灰质炎病毒 微载体 VERO细胞
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脊髓灰质炎Ⅰ型重组病毒病例的流行病学研究
13
作者 张振国 郭彧 +4 位作者 张晓哗 张灵敏 戚海 李艳东 杜煜平 《疾病监测》 CAS 1995年第7期196-198,共3页
１９８９～１９９１年在河北省发生了脊髓灰质炎Ⅰ型自然重组株病毒的流行（为脊髓灰质炎野病毒和疫苗病毒的基因重组），对重组病毒麻痹病例进行了调查，已发现的病例分布在河北省的六个市地，占省辖市地数的５０％，病例全部为４岁以... １９８９～１９９１年在河北省发生了脊髓灰质炎Ⅰ型自然重组株病毒的流行（为脊髓灰质炎野病毒和疫苗病毒的基因重组），对重组病毒麻痹病例进行了调查，已发现的病例分布在河北省的六个市地，占省辖市地数的５０％，病例全部为４岁以下农村儿童，发病时间以四月为高峰，８５％病例为没有接种或没有全程接种脊髓灰质炎疫苗，病例的临床症状主要是发热、腹泄、肢体麻痹，严重病例可发生呼吸困难。但有半数病例在６０天肢体麻痹恢复。 展开更多
关键词 脊髓灰质炎 重组病毒 流行病学
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HIV-I CN54株gagprotease基因嵌合脊髓灰质炎病毒cDNA质粒的构建和表达研究(英文)
14
作者 张阳德 路晓林 +4 位作者 李年丰 赵劲风 陈伟 李亚勇 乐园 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第18期2721-2724,2728,共5页
目的构建HIV-1CN54株gagprotease基因嵌合脊髓灰质炎病毒cDNA的表达质粒,并鉴定、检测基因及其表达。方法用PCR技术获得人免疫缺陷病毒CN54株的gagprotease基因,并使其两端带上合适的酶切位点,将其定向插入到包含脊髓灰质炎病毒cDNA的... 目的构建HIV-1CN54株gagprotease基因嵌合脊髓灰质炎病毒cDNA的表达质粒,并鉴定、检测基因及其表达。方法用PCR技术获得人免疫缺陷病毒CN54株的gagprotease基因,并使其两端带上合适的酶切位点,将其定向插入到包含脊髓灰质炎病毒cDNA的表达质粒pSVA14中,替代其部分结构基因,构建HIV基因嵌合缺陷性脊髓灰质炎病毒基因组的表达质粒。经筛选、鉴定后用脂质体转染技术将新构建的质粒转入Hela细胞内,用WesternBlot方法检测目的基因在Hela细胞内的表达。结果PCR技术扩增所得的人免疫缺陷病毒CN54株gagprotease基因经琼脂糖凝胶电泳、DNA测序证实成功获得,未引入突变碱基,筛选、鉴定证明gagprotease基因被正确定向插入到脊髓灰质炎病毒的cDNA序列之中,WesternBlot检测到gagprotease基因正确表达了相关蛋白。结论成功构建了表达人免疫缺陷病毒CN54株gagprotease基因的缺陷性脊髓灰质炎病毒基因组嵌合质粒,为利用脊髓灰质炎病毒作人免疫缺陷病毒基因的表达载体奠定了基础,此研究对开发以脊髓灰质炎病毒为艾滋病的疫苗载体有重要意义。 展开更多
关键词 脊髓灰质炎病毒 Ⅰ型中国人免疫缺陷病毒 嵌合基因 疫苗载体
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RT-PCR-RFLP方法用于脊髓灰质炎病毒型内鉴定
15
作者 田宏 刘杨 +1 位作者 高志刚 万丽霞 《天津医药》 CAS 北大核心 2004年第8期485-486,F005,共3页
目的 :采用逆转录 -聚合酶链反应 -限制性酶切片段长度多态性分析 (RT_PCR_RFLP)方法对脊髓灰质炎(脊灰)病毒 (PV)进行型内鉴定。方法 :采用RT_PCR方法对PV的VP1区进行扩增 ,PCR产物分别用DdeⅠ、HpaⅡ、HaeⅢ3种限制性内切酶做RFLP分... 目的 :采用逆转录 -聚合酶链反应 -限制性酶切片段长度多态性分析 (RT_PCR_RFLP)方法对脊髓灰质炎(脊灰)病毒 (PV)进行型内鉴定。方法 :采用RT_PCR方法对PV的VP1区进行扩增 ,PCR产物分别用DdeⅠ、HpaⅡ、HaeⅢ3种限制性内切酶做RFLP分析 ,并与PVSabinⅠ、Ⅱ、Ⅲ3个型别疫苗株相对照判定其是否为疫苗相关株。结果 :对天津市2001年—2002年分离到的9株PV阳性株进行RT_PCR_RFLP试验 ,全部为疫苗相关株。结论 :该方法应用于PV检测 ,可以尽早发现脊灰野病毒、疫苗衍生株及疫苗重组株等 ,便于尽快采取措施阻断其传播。 展开更多
关键词 RT—PCR—RFLP法 脊髓灰质炎病毒 疫苗衍生株 疫苗重组株
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从1名健康疫苗接种者分离到的重组3型/2型脊髓灰质炎病毒及其包含的嵌合核壳VP1的鉴定
16
作者 李平忠 《国外医学（预防．诊断．治疗用生物制品分册）》 2004年第1期40-40,共1页
关键词 脊髓灰质炎病毒 脊髓灰质炎疫苗 基因重组 病毒分离 嵌合病毒
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重组脊髓灰质病毒载体研究进展 被引量：1
17
作者 彭小忠 《国外医学（病毒学分册）》 1997年第3期73-76,共4页
重组脊髓灰质病毒载体研究进展中国医学科学院医学生物学研究所彭小忠综述戴长柏郭仁审校自１９５５年Ｓａｌｋ灭活疫苗和１９６０年Ｓａｂｉｎ减毒活疫苗应用于人群预防接种以来，该病已在世界范围内得到有效控制［１］。３０多年来的... 重组脊髓灰质病毒载体研究进展中国医学科学院医学生物学研究所彭小忠综述戴长柏郭仁审校自１９５５年Ｓａｌｋ灭活疫苗和１９６０年Ｓａｂｉｎ减毒活疫苗应用于人群预防接种以来，该病已在世界范围内得到有效控制［１］。３０多年来的实践证明，Ｓａｂｉｎ减毒活疫苗为一... 展开更多
关键词 脊髓灰质病毒 重组载体 疫苗
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脊髓灰质炎病毒抗原变异的研究进展
18
作者 米尔英 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 1992年第1期45-49,共5页
脊髓灰质炎(脊灰)病毒为正链单股RNA病毒,属小RNA病毒科,肠道病毒属成员,有三个血清型(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型)。近年来由于单克隆抗体(McAb)和分子生物学等新技术的应用,对该病毒的抗原结构,抗原部位的氨基酸序列,以及易发生突变的区域等均有进... 脊髓灰质炎(脊灰)病毒为正链单股RNA病毒,属小RNA病毒科,肠道病毒属成员,有三个血清型(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型)。近年来由于单克隆抗体(McAb)和分子生物学等新技术的应用,对该病毒的抗原结构,抗原部位的氨基酸序列,以及易发生突变的区域等均有进一步的阐明,为亚单位疫苗、重组疫苗或合成肽疫苗的开发奠定了基础。本文简要介绍脊灰病毒结构蛋白的免疫原性及抗原变异的研究进展。 展开更多
关键词 抗原变异 脊髓灰质炎病毒 免疫原性 重组疫苗 脊灰 单克隆抗体 肠道病毒属 疫苗株 合成肽疫苗 病毒颗粒
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不同脊髓灰质炎病毒株3CD蛋白酶在昆虫细胞中的表达及其对P1前体蛋白的剪切 被引量：1
19
作者 马金 李军强 +2 位作者 莘春林 段静留 朱涛 《微生物学免疫学进展》 2018年第1期1-6,共6页
目的获得在昆虫细胞中有效表达脊髓灰质炎病毒P1基因和3CD基因的重组杆状病毒,为制备脊髓灰质炎病毒样颗粒疫苗提供了科学依据。方法将I型脊髓灰质炎病毒(Mahoney株)的P1基因和3CD基因构建到供体质粒中,通过flash BAC ULTRATM系统制备... 目的获得在昆虫细胞中有效表达脊髓灰质炎病毒P1基因和3CD基因的重组杆状病毒,为制备脊髓灰质炎病毒样颗粒疫苗提供了科学依据。方法将I型脊髓灰质炎病毒(Mahoney株)的P1基因和3CD基因构建到供体质粒中,通过flash BAC ULTRATM系统制备重组杆状病毒;将Mahoney株的P1基因与Sabin株Ⅲ型的3CD基因组合,用同样方法构建重组杆状病毒。通过接种昆虫细胞草地贪夜蛾细胞(sf-9细胞)对两种病毒进行扩增,再接种昆虫细胞粉纹夜蛾细胞(High five细胞)扩大培养,并通过定量PCR对P1和3CD基因的表达进行验证,利用Western blot检测P1蛋白的表达及被3CD蛋白酶剪切的情况。结果获得了两株稳定表达脊髓灰质炎病毒P1和3CD基因的重组杆状病毒。其中,重组杆状病毒(Bac U-Mahoney-P1-3CD)在感染细胞后,3CD蛋白酶表达量较低,不能有效剪切P1前体蛋白;而重组杆状病毒(Bac U-Mahoney-P1-Sabin PV3 3CD)感染细胞后,3CD蛋白酶的表达量和对P1前体蛋白的剪切效力都有明显提高(P<0.05)。结论将Mahoney株P1基因和Sabin株Ⅲ型的3CD基因的组合构建重组杆状病毒,可有效地在昆虫细胞中表达P1和3CD基因,并且Sabin株Ⅲ型的3CD蛋白酶可有效地剪切Mahoney株的P1前体蛋白。 展开更多
关键词 脊髓灰质炎病毒 草地贪夜蛾细胞 3CD蛋白酶 P1前体蛋白 重组杆状病毒 类病毒颗粒
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一种基于HDR-CRISPR/Cas9技术快速构建重组鸭肠炎病毒的方法的建立
20
作者 贾文凤 蒋香香 +3 位作者 陶慧丽 王安平 吴植 朱善元 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第1期298-309,共12页
[目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其... [目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其病毒滴度。根据DEV疫苗株UL26、UL27基因间非编码区序列,设计合成向导RNA(gRNA),经双链退火获得目的片段,通过基因克隆技术将其插入PX459-V2.0载体获得gRNA-Cas9质粒。同时,通过常规基因克隆技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因插入PVAX-1载体,构建含有真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA的重组表达质粒。以DEV疫苗株基因组为模板,扩增gRNA上、下游同源臂序列,通过融合PCR将同源臂序列与真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA进行连接并克隆至PUC19载体获得供体质粒PUC19-UP-EGFP-DOWN。采用先转染质粒后感染亲本DEV的策略构建重组病毒rDEV-EGFP,通过控制单一变量法优化重组病毒构建的试验条件,根据不同条件下绿色荧光蚀斑数量确定最佳条件。利用有限稀释法筛选并纯化表达绿色荧光的蚀斑,获得重组病毒rDEV-EGFP,并对其进行遗传稳定性及体外复制能力的评估。[结果]PCR扩增及测序结果显示,成功构建靶向DEV基因组UL27与UL26基因间非编码区序列的gRNA-Cas9质粒及包含EGFP真核表达盒的供体质粒。鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)中转染gRNA-Cas9及供体质粒后感染DEV,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蚀斑,表明成功利用HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术将EGFP报告基因敲入DEV基因组。优化后的最佳试验条件为:DEV感染复数(MOI)为0.2、gRNA-Cas9质粒与供体DNA转染比例为1∶2、供体DNA的转染形式为DNA片段、转染与感染时间间隔为6 h、重组病毒收取时间为DEV感染后48 h,优化后EGFP报告基因的敲入效率显著提高(P<0.05)。重组病毒rDEV-EGFP在CEF中连续传代15次,EGFP真核表达盒仍稳定整合在UL26与UL27基因之间的非编码区,具有良好的遗传稳定性。生长曲线结果显示,重组病毒rDEV-EGFP在CEF中的复制能力与DEV疫苗株无明显差异,生长趋势一致,具有良好的体外复制能力。[结论]本研究建立了一种基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速构建重组DEV的方法,成功构建了具有良好遗传稳定性及体外复制能力的重组病毒rDEV-EGFP,为重组DEV载体疫苗候选株的研制提供了理论依据及技术平台。 展开更多
关键词 鸭肠炎病毒 CRISPR/Cas9基因编辑 重组载体
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