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重组酶介导的等温扩增结合CRISPR/Cas12a检测志贺氏菌和克罗诺杆菌
1
作者 张欣悦 杨钰娟 +4 位作者 孔祥翔 杨捷琳 钮冰 陈沁 刘志勇 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第11期35-44,共10页
目的应用重组酶介导的等温扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)结合成簇规则的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR),建立志贺氏菌和克罗诺杆菌的快速检测方法。方法通过... 目的应用重组酶介导的等温扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)结合成簇规则的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR),建立志贺氏菌和克罗诺杆菌的快速检测方法。方法通过筛选志贺氏菌和克罗诺杆菌特异性基因,设计特异扩增引物、CRISPR脱氧核糖核酸(CRISPR deoxyribonucleic acid,crDNA)和探针,将靶标进行RAA扩增后,建立CRISPR检测方法。对方法的灵敏度、特异性和应用性进行评价,并与国标检测方法进行对比。结果本研究对志贺氏菌和克罗诺杆菌纯菌液DNA最低检出限分别为4.9×10^(3) CFU/mL、4.4×10^(4) CFU/mL,基因组DNA最低检出限为6.8×10^(‒3) ng/μL、5.7×10^(‒3 )ng/μL,特异性好,与其他病原菌无交叉反应。同时,该方法成功检测出加标猪肉样品和人工污染奶粉中的志贺氏菌和克罗诺杆菌,比国家标准检出限更低。结论本研究建立的RAA-CRISPR方法可有效应用于志贺氏菌和克罗诺杆菌的检测,这为快速筛查食品中是否污染这两种病原菌提供重要价值。 展开更多
关键词 志贺氏菌 克罗诺杆菌 重组酶介导的等温扩增 成簇规则的间隔短回文重复序列
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鉴别鸽新城疫病毒野毒株与疫苗株La Sota的重组酶介导的等温扩增方法的建立
2
作者 杜文珍 吴颖臻 +4 位作者 王鹏 陆凡 刘大利 梁海皇 韦天超 《广西畜牧兽医》 2024年第2期47-50,共4页
为建立一种能够区分鸽新城疫病毒(NDV)野毒株与常用新城疫疫苗株La Sota的重组酶介导的等温扩增方法(RAA),本研究针对基因Ⅵ型鸽源NDV和La Sota的NP基因设计出1对特异性引物,经过优化引物浓度、反应时间、反应温度,建立了能够区分鸽NDV... 为建立一种能够区分鸽新城疫病毒(NDV)野毒株与常用新城疫疫苗株La Sota的重组酶介导的等温扩增方法(RAA),本研究针对基因Ⅵ型鸽源NDV和La Sota的NP基因设计出1对特异性引物,经过优化引物浓度、反应时间、反应温度,建立了能够区分鸽NDV野毒株与La Sota的RAA检测技术。对其特异性、敏感性和重复性进行测试,并应用建立的方法检测了45份临床样品。结果显示:该技术在15℃~39℃的恒温条件下,可于15 min内完成对目标基因的扩增;对禽支原体、大肠杆菌、沙门氏菌、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒和衣原体等常见病原的检测结果均为阴性;重组质粒标准品检测下限为39.5 copies/反应;45份临床病死鸽样品的检测,检出28份阳性,与常规PCR方法的检测结果一致。本研究结果说明建立的RAA方法可应用于临床样品的快速检测。 展开更多
关键词 鸽新城疫病毒 重组酶介导的等温扩增方法 快速检测
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重组酶介导的等温扩增法检测H7N9禽流感病毒 被引量：8
3
作者 赵康辰 崔仑标 +6 位作者 葛以跃 陈银 朱小娟 刘宾 史智扬 朱凤才 周明浩 《江苏预防医学》 CAS 2016年第5期524-526,530,共4页
目的建立H7N9禽流感病毒一步法逆转录重组酶介导的等温扩增的检测方法(RT-RAA)。方法根据H7N9禽流感病毒HA片段和NA片段的保守区序列分别设计引物、探针,建立RT-RAA方法,研究其特异性、敏感性,并与Realtime RT-PCR方法进行比较。结果成... 目的建立H7N9禽流感病毒一步法逆转录重组酶介导的等温扩增的检测方法(RT-RAA)。方法根据H7N9禽流感病毒HA片段和NA片段的保守区序列分别设计引物、探针,建立RT-RAA方法,研究其特异性、敏感性,并与Realtime RT-PCR方法进行比较。结果成功建立了H7N9禽流感病毒RT-RAA检测方法,H7反应体系和N9反应体系的最低检出限分别为10copy/μL和100copy/μL,且与其他呼吸道病原无交叉反应。H7N9RT-RAA体系检测结果与Real-time RT-PCR一致性较高,Kappa检验u系数为0.933。结论建立的RT-RAA检测方法具有快速、特异及灵敏的特点,为H7N9禽流感病毒的快速检测提供了新的分子工具。 展开更多
关键词 H7N9禽流感病毒 逆转录-重组酶介导的等温扩增技术 快速检测
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人乳头瘤病毒6型和11型通用型含内源性内参的重组酶介导的等温扩增技术检测方法的建立 被引量：3
4
作者 何安娜 张梦怡 +3 位作者 李逢钰 马学军 申辛欣 戎秀格 《新发传染病电子杂志》 2022年第2期25-29,共5页
目的建立一种通用型含内源性内参的重组酶介导的等温扩增技术(EIC-RAA)检测人乳头瘤病毒6型(HPV-6)和11型(HPV-11)的方法,以实现HPV-6和HPV-11的简单、准确、快速筛查。方法针对HPV-6和HPV-11的L1片段保守区域设计通用型引物和探针并结... 目的建立一种通用型含内源性内参的重组酶介导的等温扩增技术(EIC-RAA)检测人乳头瘤病毒6型(HPV-6)和11型(HPV-11)的方法,以实现HPV-6和HPV-11的简单、准确、快速筛查。方法针对HPV-6和HPV-11的L1片段保守区域设计通用型引物和探针并结合核糖核酸酶P(RNaseP)基因引物和探针作为内参建立了检测HPV-6和HPV-11的EIC-RAA方法;用系列浓度稀释的质粒和不同亚型HPV样本核酸检验其灵敏度、重复性和特异度;收集的230份临床样本进行EIC-RAA和商业化HPV PCR-荧光探针法检测,并对结果进行比较。结果建立的EIC-RAA方法可在39℃条件下30min内实现HPV-6和HPV-11的检测,其灵敏度为10copies/reaction,重复性好,特异度高,EIC-RAA检测结果与商业化HPV PCR-荧光探针法检测结果的符合率为100%。结论建立了一种检测HPV-6和HPV-11的EIC-RAA方法,该检测方法具有简单、准确、快速的优点,在HPV-6和HPV-11的筛查中具有潜在的应用价值。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒 核糖核酸酶P 内源性内参 重组酶介导的等温扩增技术
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结核分枝杆菌实时荧光重组酶介导的等温扩增检测方法的建立与应用
5
作者 刘园园 任卫聪 +6 位作者 薛仲探 王伟 张旭霞 姚丛 尚媛媛 李姗姗 逄宇 《中国医学前沿杂志（电子版）》 CSCD 2023年第8期18-27,共10页
目的由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的结核病(tuberculosis,TB)是全球第二大单一感染致死病因,快速和准确的结核诊断技术有助于对其进行精准防控。方法针对MTB菌株插入序列IS6110高度保守区域设计引物和exo探... 目的由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的结核病(tuberculosis,TB)是全球第二大单一感染致死病因,快速和准确的结核诊断技术有助于对其进行精准防控。方法针对MTB菌株插入序列IS6110高度保守区域设计引物和exo探针并进行筛选,建立了MTB实时(real-time,RT)荧光重组酶介导的等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)检测方法。通过检测11种非结核分枝杆菌以及金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌评价RT-RAA方法的特异性。以实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,q PCR)方法作为平行对照,应用RT-RAA方法扩增梯度稀释的含有目的基因序列不同拷贝数的重组质粒p EASY-Blunt-IS6110,以评价RT-RAA方法的检测敏感度和重复性。将建立的MTB RT-RAA方法应用于173份肺结核临床样品检测中,同时与q PCR方法进行比较。结果建立的MTB RT-RAA方法在42℃条件下30min内即可完成反应;与非结核分枝杆菌以及金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌均无交叉反应;最低检测模板质粒浓度为116拷贝/2μl,优于q PCR方法(138拷贝/2μl);组内和组间的变异系数均小于8%,重复性好。对于肺结核临床样品的检测,RT-RAA方法检测的阳性率与q PCR方法差异无统计学意义。结论本研究建立的MTB RT-RAA方法是一种方便、灵敏和低成本的MTB快速检测方法,具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 重组酶介导的等温扩增 荧光定量PCR 快速检测
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基于重组酶介导等温核酸扩增技术快速检测食品中骆驼源性成分的方法建立及评价
6
作者 周臣清 张娟 +3 位作者 綦艳 赵玲 黄宝莹 杨纯佳 《中国乳品工业》 北大核心 2025年第2期75-80,共6页
文章开发一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)的方法,实现对食品中骆驼源性成分快速检测。针对骆驼细胞色素B(Cytochrome b,Cyt b)基因设计特异性引物,对建立的RAA体系优化其反应扩增条件,评估其... 文章开发一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)的方法,实现对食品中骆驼源性成分快速检测。针对骆驼细胞色素B(Cytochrome b,Cyt b)基因设计特异性引物,对建立的RAA体系优化其反应扩增条件,评估其特异性和灵敏度,并用建立的RAA法与GB/T 38164标准方法分别对24份市售骆驼制品进行检测并比对结果。结果表明,本研究建立的RAA法特异性强,乳及乳制品检出限为1.0%,肉及肉制品检出限为0.1%,且2种方法对24份骆驼乳肉及其制品检测结果一致。因此,本研究开发的RAA方法具有快速、特异性强、灵敏度高、操作简单等优点,市场应用前景广阔。 展开更多
关键词 重组酶介导等温核酸扩增技术 骆驼源性成分 细胞色素B基因 快速检测
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肉制品中马源性成分重组酶介导链置换等温扩增实时检测方法的建立及应用 被引量：1
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作者 范维 孔维恒 +3 位作者 高晓月 董雨馨 李贺楠 郭文萍 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第3期203-210,共8页
目的:建立一种快速鉴定肉及肉制品中马源性成分的重组酶介导链置换等温扩增实时检测方法。方法:以马源性ATpase 6基因为靶基因设计多组特异性引物和Exo探针,通过引物筛选及反应参数优化,建立一种采用重组酶介导链置换等温扩增技术检测... 目的:建立一种快速鉴定肉及肉制品中马源性成分的重组酶介导链置换等温扩增实时检测方法。方法:以马源性ATpase 6基因为靶基因设计多组特异性引物和Exo探针,通过引物筛选及反应参数优化,建立一种采用重组酶介导链置换等温扩增技术检测马源性成分的方法,并对该方法进行特异性、灵敏度和稳定性验证,同时通过对不同掺入比例混合样品、不同加工工艺模拟样品和市售样品进行检测,分析方法的检出限、适用性和准确性。结果:该方法反应迅速、特异性强、灵敏度高。可在39℃恒温条件下16min内完成反应;对23种非目标源性具有良好特异性;目标DNA的检测灵敏度可达到1.8copies/μL水平;对生肉的检出限为0.01%(质量分数,下同),对熟肉制品的检出限为0.1%;对90份市售样品进行检测,结果与标准方法一致。结论:建立的重组酶介导链置换等温扩增方法可用于肉及肉制品中马源性成分的掺假鉴别检测。 展开更多
关键词 重组酶介导链置换等温扩增 掺假鉴别 马源性成分 肉及肉制品
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重组酶介导等温扩增技术在动物疫病检测中的应用
8
作者 叶健强 吴学婧 +5 位作者 毛从剑 于吉锋 肖璐 谢晶 曾子轩 康润敏 《养殖与饲料》 2024年第8期101-105,共5页
重组酶介导等温扩增技术(RAA)是一种新型核酸扩增技术,能在简单设备甚至低资源环境下实现等温快速扩增;具有特异性强、灵敏度高、操作简便、耗时短等优点,适用于动物疫病快速检测。本文介绍了RAA技术的技术原理和技术特点,总结了该技术... 重组酶介导等温扩增技术(RAA)是一种新型核酸扩增技术,能在简单设备甚至低资源环境下实现等温快速扩增;具有特异性强、灵敏度高、操作简便、耗时短等优点,适用于动物疫病快速检测。本文介绍了RAA技术的技术原理和技术特点,总结了该技术在动物病毒、细菌、寄生虫、动物源性产品和其他病原微生物等多个领域中研究现状。同时,提出了该技术存在的不足和展望了未来的发展方向和热点。 展开更多
关键词 重组酶介导扩增 疫病检测 应用 动物源性产品 病原微生物
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重组酶介导等温扩增技术(RAA)在病原微生物检测中的应用进展 被引量：7
9
作者 毛迎雪 刘蒙达 +7 位作者 张皓博 曲瑶 南文龙 苏华彬 刘建柱 孙淑芳 胡莉萍 樊晓旭 《中国动物检疫》 CAS 2024年第1期60-66,共7页
重组酶介导等温扩增(RAA)是一种恒温快速核酸扩增技术,是重组酶等温扩增技术中具有代表性和前沿性的检测技术,其弥补了现有核酸体外扩增技术需要热循环的局限性,使得核酸体外扩增更加简便快捷,目前已被广泛应用于动物疫病检测。本文介绍... 重组酶介导等温扩增(RAA)是一种恒温快速核酸扩增技术,是重组酶等温扩增技术中具有代表性和前沿性的检测技术,其弥补了现有核酸体外扩增技术需要热循环的局限性,使得核酸体外扩增更加简便快捷,目前已被广泛应用于动物疫病检测。本文介绍了RAA技术的检测原理、引物探针设计及优缺点,综述了其在病毒、细菌、寄生虫及抗生素耐药基因检测等方面的应用进展,总结了国内现有RAA技术标准及检测产品开发情况,以期为拓展RAA技术的应用提供参考。 展开更多
关键词 重组酶介导扩增 等温扩增 病原检测 生物安全检测
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基于重组酶介导等温扩增-CRISPR/Cas12a的青鱼物种快速鉴定研究 被引量：1
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作者 于耀鲜 邢冉冉 +5 位作者 邓婷婷 王琳 卢思远 王宏勋 王丽梅 陈颖 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第4期40-48,共9页
目的 建立一种快速、特异、灵敏地鉴定青鱼物种的方法。方法 以青鱼线粒体16SrRNA基因的保守序列设计特异性crRNA,并根据crRNA设计重组酶介导等温扩增(recombinase-mediatedisothermal amplification,RAA)引物;建立青鱼的RAA-CRISPR/Cas... 目的 建立一种快速、特异、灵敏地鉴定青鱼物种的方法。方法 以青鱼线粒体16SrRNA基因的保守序列设计特异性crRNA,并根据crRNA设计重组酶介导等温扩增(recombinase-mediatedisothermal amplification,RAA)引物;建立青鱼的RAA-CRISPR/Cas12a快速鉴定方法,并对该方法的检测时间进行优化;同时,评估该方法的特异性和灵敏度,并对青鱼及其近缘物种的市售样品进行检测。结果 该方法仅需25 min完成检测;对青鱼物种的鉴定表现出显著的特异性,并对其近缘物种如草鱼、赤眼鳟、鳡鱼、倒刺鲃的检测结果均呈阴性;方法灵敏度为1.0×10-3ng/μL(以基因组DNA计);与DNA条形码技术相比,该方法在市售样品的检测结果上表现一致。结论 建立了青鱼物种的RAA-CRISPR/Cas12a现场快速检测方法,该方法具备快速、特异、灵敏的特点,为水产市场或野外环境中快速检测青鱼物种提供了技术手段。 展开更多
关键词 青鱼 重组酶介导等温扩增 簇状规则间隔短链重复序列 物种鉴定
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实时荧光重组酶聚合酶扩增技术快速检测创伤弧菌方法的建立
11
作者 禹乐 朱启淦 +4 位作者 温路生 许家伦 郭健莲 梁声强 孟加榕 《山西医科大学学报》 2025年第2期213-218,共6页
目的 建立一种基于实时荧光重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)技术快速检测创伤弧菌的方法。方法 根据编码创伤弧菌溶血素vvhA基因的保守序列设计RPA引物,通过琼脂糖凝胶电泳筛选出最佳引物;根据筛选出的引... 目的 建立一种基于实时荧光重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)技术快速检测创伤弧菌的方法。方法 根据编码创伤弧菌溶血素vvhA基因的保守序列设计RPA引物,通过琼脂糖凝胶电泳筛选出最佳引物;根据筛选出的引物设计实时荧光探针,并建立实时荧光RPA检测体系。通过检测金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、河流弧菌、溶藻弧菌等10种其他菌种评价检测体系的特异性;通过检测梯度稀释的创伤弧菌基因组DNA评价检测体系的灵敏度。用qPCR试剂盒平行检测10例模拟临床样本,验证检测体系的性能。结果 基于创伤弧菌vvhA基因保守序列建立起实时荧光RPA检测体系,该体系对金黄色葡萄球菌等10种其他菌种基因组DNA均无交叉反应。检测创伤弧菌的灵敏度为1×10^(2)CFU/mL;检测模拟临床样本结果与qPCR方法的结果一致,准确率和检出率均为100%。结论 本研究建立的实时荧光RPA检测创伤弧菌方法灵敏度高、特异性强,操作简单快速,为创伤弧菌的现场快速检测提供一种新途径。 展开更多
关键词 创伤弧菌 vvhA基因 重组酶聚合酶扩增 核酸扩增 分子检测 快速检测
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二重环介导等温扩增法快速检测鸭肉中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌
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作者 张林吉 贾燕 +4 位作者 任春芝 昌莉丽 孙朋 张青青 任士飞 《山东畜牧兽医》 2025年第1期1-5,共5页
为了建立二重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测体系快速检测鸭肉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌,本研究利用沙门菌invA基因和金黄色葡萄球菌SAR0395基因设计引物,以建立单重LAMP体系为基础,对引物浓度进... 为了建立二重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测体系快速检测鸭肉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌,本研究利用沙门菌invA基因和金黄色葡萄球菌SAR0395基因设计引物,以建立单重LAMP体系为基础,对引物浓度进行优化,建立二重LAMP检测体系,测定对单一菌株的特异性和灵敏度,并对两种细菌扩增产物的溶解曲线和溶解峰进行分析。结果显示,建立的单重LAMP体系分别能对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行高效扩增,当沙门氏菌和金黄色葡萄球菌引物浓度比达到2.5:1时,建立的二重LAMP检测方法扩增效率最佳,建立的单重和二重LAMP检测方法对两种细菌具有较好特异性;二重LAMP对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的检测灵敏度分别为9.1×10^(1) CFU/m L和7.8×10^(1) CFU/mL,可根据扩增产物溶解曲线和溶解峰温度的不同,实现对两菌有效鉴别。与传统方法比较,二重LAMP对鸭肉类产品检测符合率为100%。结果表明,建立的二重LAMP检测方法灵敏度高、特异性强、可定性鉴定、检测周期短,可用于鸭肉中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的快速检测。 展开更多
关键词 环介导等温扩增 金黄色葡萄球菌 沙门氏菌 溶解曲线 快速检测
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基于重组酶聚合酶扩增-CRISPR/Cas12a的沙门氏菌可视化检测方法的建立
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作者 黄建飞 陈晶 +3 位作者 张倩 肖承荣 吴燕蕙 赖心田 《食品安全质量检测学报》 2025年第8期122-130,共9页
目的建立基于重组酶聚合酶扩增-CRISPR/Cas12a的沙门氏菌可视化检测方法。方法本研究将重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术与成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白12a(clustered regularly interspaced... 目的建立基于重组酶聚合酶扩增-CRISPR/Cas12a的沙门氏菌可视化检测方法。方法本研究将重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术与成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白12a(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated protein 12a,CRISPR/Cas12a)系统相结合,以沙门氏菌invA作为目标基因,设计并合成RPA引物和CRISPR引导RNA(CRISPR-derived RNA,crRNA),通过荧光法和试纸条两种方法读取结果。对优化的RPA-CRISPR/Cas12检测体系进行特异性和灵敏度实验,并应用于食品样本检测。结果本研究成功研制纳米金核酸试纸条,建立的RPA-CRISPR/Cas12a体系可在1.5 h内特异性完成沙门氏菌的检测,灵敏度为80 CFU/mL。利用此方法对21个食品样本进行检测,荧光法、试纸条法与国家标准法检测结果完全一致,沙门氏菌检出率为4.8%。结论本研究建立的沙门氏菌RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法具有高特异性和灵敏度,在沙门氏菌的现场快速检测方面具有应用价值。 展开更多
关键词 沙门氏菌 成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白12a 试纸条 重组酶聚合酶扩增 可视化检测
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多重重组酶介导等温扩增技术检测食品中3种食源性致病菌 被引量：1
14
作者 秦爱 李根容 +3 位作者 邓方进 张明娟 周朝旭 肖昭竞 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第5期97-104,共8页
目的 建立快速、灵敏的多重重组酶介导等温扩增法(recombinase aided amplification, RAA)同时检测食品中的大肠埃希氏菌O157:H7、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。方法 根据大肠埃希氏菌O157:H7的rfbE基因、沙门氏菌的invA基因以及金黄色葡... 目的 建立快速、灵敏的多重重组酶介导等温扩增法(recombinase aided amplification, RAA)同时检测食品中的大肠埃希氏菌O157:H7、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。方法 根据大肠埃希氏菌O157:H7的rfbE基因、沙门氏菌的invA基因以及金黄色葡萄球菌的nuc基因的序列保守区域设计RAA特异性引物,筛选出最优的引物组合并优化各项实验条件;通过标准菌株验证方法特异性和灵敏度,并通过人工污染实验,验证方法在实际食品样本中的检测能力。结果 多重RAA方法最佳扩增温度为37℃,反应时间为50min;方法特异性良好,仅对目标菌株存在特异性扩增条带,与其他常见食源性致病菌无交叉反应;方法对基因组DNA的检测灵敏度为0.10 ng/μL;对经过简单增菌的人工污染牛奶样本和牛肉干样本中目标菌株的检出限为100 CFU/mL。结论 本研究建立的多重RAA扩增方法具有特异性好、灵敏度高、检测通量高等优势,适用于多种场景下食品样本中3种食源性致病菌的快速检测。 展开更多
关键词 重组酶介导扩增技术 大肠埃希氏菌O157:H7 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌
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FTA-环介导等温扩增技术直接提取变异链球菌DNA的效果评价 被引量：1
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作者 王玥晖 尚进 +4 位作者 杨晨 符冬格 曹灿 张晓东 王敬夫 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2025年第5期1043-1049,共7页
背景:变异链球菌是龋病的重要病原菌,及时检测变异链球菌水平对龋病的早发现、早治疗有重要意义。目的:建立并评价FTA-环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术直接提取变异链球菌DNA的应用效果。方法:①制备... 背景:变异链球菌是龋病的重要病原菌,及时检测变异链球菌水平对龋病的早发现、早治疗有重要意义。目的:建立并评价FTA-环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术直接提取变异链球菌DNA的应用效果。方法:①制备含有ATCC标准菌株变异链球菌的菌悬液,接种于脑心浸出液培养基,充分混匀后按10倍梯度稀释成7种浓度(4.2×10^(7),4.2×10^(6),4.2×10^(5),4.2×10^(4),4.2×10^(3),4.2×10^(2),4.2×10 CFU/mL),每个稀释级做2个平行对照,并增加无菌水作为空白对照;②分别采用FTA卡、常规煮沸法、试剂盒提取及裂解液提取4种方法直接提取菌株DNA,通过LAMP技术进行扩增,并进行特异性试验,比较4种提取方法的差异。结果与结论:①4种方法提取的DNA均满足LAMP扩增的要求;②特异性试验结果显示,只有变异链球菌才可特异扩增出靶基因;③裂解液提取法最低检测限为4.2×10^(3) CFU/mL,FTA卡提取法最低检测限为4.2×10^(4) CFU/mL,试剂盒提取法和常规煮沸法最低检测限分别为4.2×10^(6) CFU/mL和4.2×10^(7) CFU/mL;④4种提取方法其他方面的比较显示,试剂盒提取法的实验成本、步骤数和时间都是最高;其他3种方法步骤数一致,其中FTA卡所需仪器设备最少,常规煮沸法单次成本最低,裂解液提取法所需时间最少;FTA卡和裂解液提取法仅需少量菌即可提取成功,后者在时间方面优于FTA卡,但相较于FTA卡其单次成本高,所需设备多;⑤结果说明,该研究建立的FTA-LAMP技术具有操作简便、特异性强、灵敏度高、结果可视化等优势,有望为高效提取检测变异链球菌提供新途径。 展开更多
关键词 变异链球菌 环介导等温扩增 FTA卡 DNA 可视化
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基于重组酶介导等温扩增技术的羊口疮病毒核酸检测方法的建立及初步应用 被引量：8
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作者 张学勇 简莹娜 +3 位作者 李志 郭志宏 严永盛 朵红 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期271-275,共5页
为建立羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)核酸的快速检测方法,本研究根据ORFV B2L基因保守序列设计特异性引物,通过优化反应温度与时间初步建立了基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)的ORFV检测方法。优化试验结果显示:该方法在37℃反应40 min检... 为建立羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)核酸的快速检测方法,本研究根据ORFV B2L基因保守序列设计特异性引物,通过优化反应温度与时间初步建立了基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)的ORFV检测方法。优化试验结果显示:该方法在37℃反应40 min检测效果最佳。采用该方法对ORFV、山羊痘病毒、O型和A型口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、山羊副流感病毒3型等临床常见症状相似的病毒核酸检测,结果显示:该方法除对ORFV的检测结果为阳性外,对羊的其他病毒的检测结果均为阴性,特异性较强。将质粒标准品10倍倍比稀释(1×10^(9)拷贝/μL~1×10^(0)拷贝/μL)后为模板,利用本研究建立的RAA方法检测,结果显示:该方法对ORFV质粒标准品的最低检测限为1×10^(4)拷贝/μL,敏感性较高。利用本研究建立的方法对95份临床样品(15份组织样品和80份血液样品)检测,结果显示:该RAA方法能够对临床样品快速检测,组织样品和血液样品的阳性率分别为33.33%(5/15)和6.25%(5/80),该检测结果与普通PCR检测方法的符合率均为100%,表明本实验建立的RAA方法能够满足临床样品的检测需求。本研究建立的ORFV RAA方法具有操作简单、特异性强、反应快速等特点,为ORFV的快速检测提供新的技术选择。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 B2L基因 重组酶介导的等温扩增技术 快速检测
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十足目虹彩病毒重组酶介导等温扩增检测方法的建立与应用
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作者 黄海莉 田飞焱 +4 位作者 孟霞 裴建明 徐节华 刘文珍 周文华 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2024年第11期1153-1158,共6页
十足目虹彩病毒(DIV1)的宿主范围和流行区域广泛,已成为近些年危害我国虾类养殖的重要病原之一。为建立一种DIV1重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法,本研究根据DIV1 ATPase基因保守序列设计了2对引物和1条探针,经过反应条件优化,结果显示... 十足目虹彩病毒(DIV1)的宿主范围和流行区域广泛,已成为近些年危害我国虾类养殖的重要病原之一。为建立一种DIV1重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法,本研究根据DIV1 ATPase基因保守序列设计了2对引物和1条探针,经过反应条件优化,结果显示,引物对DIV1-RAA-F1/R1与探针DIV1-RAA-P的组合扩增效率较高,在配制50μL反应体系中采用浓度为10μmol/L的DIV1-RAA-F1/R1各2μL,10μmol/L的DIV1-RAA-P 0.6μL,42℃恒温条件下反应15 min即可高效检出DIV1,初步建立了DIV1 RAA检测方法。提取DIV1、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病病毒(IHHNV)、虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、嗜水气单胞菌(Ah)及弗氏柠檬酸杆菌(Cf)等病原的DNA为模板,利用该方法检测。结果显示,该方法仅能检测到DIV1,与其他虾类病原均无交叉反应;以浓度为1.05×10^(7)拷贝/μL~1.05×10^(0)拷贝/μL的pUC57-DIV1质粒标准品为模板,利用该方法检测。结果显示,该方法的检测限为1.05×10^(1)拷贝/μL,与qPCR的检测限一致;以同一批次和不同批次提取的2个不同浓度的质粒标准品pUC57-DIV1为模板,进行重复性试验,结果显示,该方法对相同浓度质粒标准品的检测结果均一致,扩增曲线差异较小。利用该RAA方法与报道的qPCR、套式PCR方法分别对60份克氏原螯虾组织样品提取的DNA进行检测并对比结果,结果显示RAA方法和qPCR方法均检测到6份DIV1阳性样品,而套式PCR仅检测到5份阳性样品,RAA方法和qPCR方法的符合率达100%,敏感性较套式PCR高。本研究建立的DIV1 RRA检测方法特异性强、灵敏度高,操作简单,反应时间短,结果可靠,可用于DIV1临床和现地的快速检测。 展开更多
关键词 十足目虹彩病毒 重组酶介导等温扩增技术 快检方法
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双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒
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作者 邓迎春 郭旭光 +3 位作者 牛会敏 任宝红 韩小改 郭瑞 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第12期151-157,共7页
目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型... 目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。 展开更多
关键词 荧光逆转录-聚合酶链式反应 恒温荧光逆转录-重组酶介导等温扩增 GⅠ型诺如病毒 GⅡ型诺如病毒
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环介导等温扩增技术在动物细小病毒检测中的应用研究进展
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作者 赵志刚 郭晓芹 +3 位作者 赵传芳 吕文雪 于小亚 吕爽 《特产研究》 2025年第2期194-199,共6页
细小病毒能够引起多种动物发生烈性的传染病,具有高发病率和高死亡率。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal ampli-fication,LAMP)技术是一种新兴的体外核酸扩增技术,因其成本低廉、灵敏度和特异性良好,在病毒、细菌和寄生虫的病... 细小病毒能够引起多种动物发生烈性的传染病,具有高发病率和高死亡率。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal ampli-fication,LAMP)技术是一种新兴的体外核酸扩增技术,因其成本低廉、灵敏度和特异性良好,在病毒、细菌和寄生虫的病原检测和疾病监测等方面广受青睐。本文介绍了LAMP技术及其在动物细小病毒检测中的应用和研究进展,可为该技术在细小病毒检测中的充分运用提供可靠参考。 展开更多
关键词 环介导等温扩增技术 细小病毒 检测
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实时荧光环介导等温扩增快速检测黄曲霉毒素产生菌方法的建立
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作者 陈晨 陶泽 +5 位作者 王可 李晴晴 安红玉 卢增慧 李拖平 李苏红 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第4期335-344,共10页
黄曲霉毒素是一种具备强致肝损伤性、致癌性和致畸性的微生物毒素。根据产黄曲霉毒素调节基因aflR、柄曲霉素转甲基酶基因omt-1、杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1分别对实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP... 黄曲霉毒素是一种具备强致肝损伤性、致癌性和致畸性的微生物毒素。根据产黄曲霉毒素调节基因aflR、柄曲霉素转甲基酶基因omt-1、杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1分别对实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物进行设计,对其建立并优化LAMP体系。结果显示,该文所建立的方法针对aflR、omt-1、ver-1基因设计的引物,黄曲霉菌DNA的检出限分别是1.0×10^(-2)、1.0×10^(-3)、1.0×10^(-4) ng/μL。此体系与黄曲霉及寄生曲霉反应成阳性,与其他菌体反应皆为阴性,该方法耗时短、设备要求低,借助恒温荧光读取设备或根据显色剂颜色变化可在60 min内迅速判定待检菌株是否为黄曲霉毒素产生菌,可满足各机构现场快速高效检测的需要。 展开更多
关键词 黄曲霉毒素产生菌 实时荧光环介导等温扩增 快速检测 黄曲霉毒素调节基因aflR 柄曲霉素转甲基酶基因omt-1 杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1
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