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问号钩端螺旋体感染诱导人巨噬细胞发生自噬及自噬作用研究
1
作者 谷媛媛 谢玲 +2 位作者 唐东 谭燕 陈旭 《中国人兽共患病学报》 CSCD 北大核心 2024年第12期1107-1114,共8页
目的了解问号钩端螺旋体(简称钩体)对人巨噬细胞自噬的影响,并研究自噬在巨噬细胞杀灭钩体过程中的作用。方法人THP-1单核细胞用佛波酯(PMA)预处理使其分化为巨噬细胞。采用透射电镜法检测细胞内钩体及自噬小体形态。采用激光共聚焦显... 目的了解问号钩端螺旋体(简称钩体)对人巨噬细胞自噬的影响,并研究自噬在巨噬细胞杀灭钩体过程中的作用。方法人THP-1单核细胞用佛波酯(PMA)预处理使其分化为巨噬细胞。采用透射电镜法检测细胞内钩体及自噬小体形态。采用激光共聚焦显微镜法结合LC3-II-GFP质粒脂质体转染技术检测胞内自噬小体形成情况及与钩体共定位水平。采用Western blotting技术检测自噬相关蛋白LC3和P62表达水平。采用激光共聚焦显微镜技术检测自噬小体与溶酶体共定位情况及胞内问号钩体活力。结果钩体感染巨噬细胞后,胞内出现包裹有钩体的自噬小体,胞内LC3-II-GFP聚集点的数量增加,LC3-II-GFP与钩体共定位水平增加,且自噬小体与溶酶体共定位率增加。Western blotting检测结果显示,钩体感染巨噬细胞后,胞内LC3-II蛋白表达量增加,P62蛋白表达水平降低。自噬激活后细胞内问号钩体死亡数量增加,反之亦然。结论问号钩体感染可诱导人巨噬细胞产生自噬,且自噬有助于人巨噬细胞杀灭问号钩体。 展开更多
关键词 钩端螺旋体病 问号钩端螺旋体 感染 人巨噬细胞 自噬
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问号钩端螺旋体检测基因芯片的研制 被引量：7
2
作者 唐雨德 陶开华 +3 位作者 李越希 金慧英 张锦海 郭恒彬 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第4期311-314,共4页
目的　制备一种用于快速检测、鉴定问号钩端螺旋体的DNA微阵列芯片。方法　从Genbank中选取钩体 2 3SrDNA序列 ,设计一对种特异性引物和DNA探针 ,通过Blast的基因同源性比较 ,验证引物和探针的通用性与特异性。将合成的探针点样到玻片... 目的　制备一种用于快速检测、鉴定问号钩端螺旋体的DNA微阵列芯片。方法　从Genbank中选取钩体 2 3SrDNA序列 ,设计一对种特异性引物和DNA探针 ,通过Blast的基因同源性比较 ,验证引物和探针的通用性与特异性。将合成的探针点样到玻片上制备成基因芯片。用Cy3标记引物 ,通过不对称PCR反应获取荧光素标记的靶序列 ,然后与制备的芯片杂交。结果　设计的引物与探针仅同时与问号钩体 2 3srDNA完全同源。该引物可扩增我国 18个血清群的 2 5株钩体 ,均出现单一 4 82bp的扩增产物 ,而双曲钩体及其他螺旋体、病原、空白对照均无任何DNA扩增条带。芯片杂交结果与常规PCR方法结果一致 ,敏感性高于PCR。结论　基因芯片可以快速、灵敏、特异地检测问号钩端螺旋体。 展开更多
关键词 检测 基因芯片 研制 问号钩端螺旋体
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问号钩端螺旋体属特异性OmpL1s抗原膜定位及其自然抗体应答 被引量：5
3
作者 孙百莉 郭宗琪 +2 位作者 罗冬娇 孙军德 严杰 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期329-334,共6页
为了确定问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性OmpL1s抗原膜定位及其自然抗体应答情况和抗体类型,为OmpL1s用于研制通用性钩体基因工程疫苗及检测试剂盒抗原提供依据。采用显微镜凝集试验(MAT)检测四川地区156份钩体病人血清标本。用PCR和... 为了确定问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性OmpL1s抗原膜定位及其自然抗体应答情况和抗体类型,为OmpL1s用于研制通用性钩体基因工程疫苗及检测试剂盒抗原提供依据。采用显微镜凝集试验(MAT)检测四川地区156份钩体病人血清标本。用PCR和核苷酸序列分析,了解中国流行的钩体主要血清群ompL1基因型。采用常规基因工程技术构建ompL1/1和ompL1/2主要基因型原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组表达产物rOmpL1/1和rOmpL1/2。采用胶体金免疫电镜技术,对OmpL1s进行膜定位。建立了基于rOmpL1s的ELISAs,检测钩体病人血清中特异性抗体水平及其类型。试验结果表明,黄疸出血群钩体仍然是四川地区最主要的优势钩体血清群。中国流行的钩体主要血清群ompL1基因可有ompL1/1和ompL1/2两个基因型,两者核苷酸和氨基酸序列相似性之间有较明显的差异。OmpL1s是位于钩体外膜表面的蛋白分子。不同稀释度的156例钩体病人血清标本中,rOmpL1/1和rOmpL1/2特异性IgM阳性率分别为67.9%～79.5%和75.0%～75.6%,特异性IgG阳性率分别为71.8%～79.5%和75.0%～76.9%。上述试验结果提示,OmpL1s是位于钩体表面属特异性蛋白抗原。自然感染钩体时,rOmpL1/1和rOmpL1/2均可诱导机体体液免疫应答并产生IgM和IgG两类血清抗体,且两者之间有广泛的抗原交叉反应。rOmpL1/1和rOmpL1/2可作为研制通用性钩体基因工程疫苗和检测试剂盒的候选抗原。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 ompL1基因 重组表达 分子定位 免疫应答
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问号钩端螺旋体赖株基因组中一个新溶血基因的表达及功能鉴定 被引量：3
4
作者 杨杨 秦金红 +4 位作者 杨宏亮 钟怡 何平 胡宝瑜 郭晓奎 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期462-465,共4页
目的对问号钩端螺旋体赖株基因组中LA0202基因进行克隆表达并对重组蛋白的溶血活性进行初步鉴定。方法以问号钩端螺旋体赖株基因组DNA为模板,PCR扩增LA0202基因并重组到原核表达载体pET28b(+),重组质粒经限制性核酸内切酶酶切并经测序... 目的对问号钩端螺旋体赖株基因组中LA0202基因进行克隆表达并对重组蛋白的溶血活性进行初步鉴定。方法以问号钩端螺旋体赖株基因组DNA为模板,PCR扩增LA0202基因并重组到原核表达载体pET28b(+),重组质粒经限制性核酸内切酶酶切并经测序鉴定后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达重组蛋白。制备绵羊血平板对表达的重组蛋白进行溶血活性鉴定。RT-PCR检测钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因的转录。结果在大肠埃希菌中成功表达LA0202基因,表达的重组蛋白具有溶血活性。RT-PCR结果显示钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因发生了转录。结论问号钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因发生了转录,LA0202可能为一个新的溶血素基因。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 溶血活性 溶血素基因 蛋白表达
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问号钩端螺旋体GGDEF和EAL/HD-GYP结构域蛋白生物信息学分析 被引量：2
5
作者 丁士标 肖国辉 +2 位作者 孔亮亮 严杰 林旭瑷 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期109-113,共5页
目的分析问号钩端螺旋体(钩体)环二鸟苷酸(Cyclic dimeric-GMP,c-di-GMP)调节相关的GGDEF和EAL/HD-GYP结构域蛋白生物信息学结果,为后续的功能研究奠定基础。方法 PSI-BLAST方法分析编码GGDEF和EAL/HDGYP结构域蛋白的基因;利用相应生物... 目的分析问号钩端螺旋体(钩体)环二鸟苷酸(Cyclic dimeric-GMP,c-di-GMP)调节相关的GGDEF和EAL/HD-GYP结构域蛋白生物信息学结果,为后续的功能研究奠定基础。方法 PSI-BLAST方法分析编码GGDEF和EAL/HDGYP结构域蛋白的基因;利用相应生物信息学软件对蛋白信号肽序列、跨膜序列、蛋白结构、同源性进行分析并构建目的蛋白进化树。结果问号钩体中22个蛋白分别含有GGDEF或EAL/HD-GYP结构域,多数蛋白均有感受器结构域和跨膜区。7个具有PAS输入感受器的GGDEF结构域蛋白进化较为独立,位于单独的一个分支,其余6个GGDEF结构域蛋白则分散在不同的分支上。4个EAL结构域蛋白和2个HD-GYP结构域蛋白进化上也较为独立,分别处于同一进化分支。3个GGDEF和EAL结构域耦合的蛋白在进化关系上更趋向于PDE活性蛋白。结论钩体具有多拷贝的合成和降解c-di-GMP相关蛋白编码基因,表明在钩体中c-di-GMP网络具有高度复杂性,同时反映出钩体对环境条件的改变具有复杂的应对机制。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 环二鸟苷酸 鸟苷酸环化酶 磷酸二酯酶
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问号钩端螺旋体fliN基因原核表达及其产物的鉴定 被引量：2
6
作者 孙琦 陈蔚青 +1 位作者 孙爱华 严杰 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期30-32,62,共4页
目的克隆问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株鞭毛相关基因fliN并构建其原核表达系统,鉴定表达产物的免疫性。方法提取钩体株基因组DNA,高保真PCR扩增全长fliN基因片断,T-A克隆后测序。按常规方法构建fliN基因原核表达系统,并用... 目的克隆问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株鞭毛相关基因fliN并构建其原核表达系统,鉴定表达产物的免疫性。方法提取钩体株基因组DNA,高保真PCR扩增全长fliN基因片断,T-A克隆后测序。按常规方法构建fliN基因原核表达系统,并用IPTG诱导目的重组蛋白rFliN表达。采用SDS-PAGE结合Bio-Rad凝胶图象分析系统检测rFliN表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rFliN。采用兔抗问号钩体黄疸出血群赖株全菌抗血清的Western blot鉴定rFliN及其免疫反应性。结果与报道的相应序列比较,所克隆的fliN基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%。IPTG诱导原核表达系统pET32a-fliN-E.coliBL21DE3的rFliN表达量约占细菌总蛋白的30%,rFliN提纯后仅见单一的蛋白条带。rF-liN能与抗血清发生免疫结合反应。结论本研究成功地构建了高效表达目的重组蛋白的问号钩体fliN基因原核表达系统,RFliN有良好的免疫反应性,为深入研究FliN致病及免疫保护作用奠定了基础。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 fliN基因 克隆 原核表达 鉴定
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问号钩端螺旋体胶原酶在钩体病豚鼠模型的肺组织中的表达 被引量：1
7
作者 徐静 李文俊 +6 位作者 杨宏亮 郑林 胡宝瑜 傅爱芬 赵伶兹 郭晓奎 姜叙诚 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期647-651,共5页
目的通过克隆、表达问号钩端螺旋体赖型赖株的胶原酶基因colA(LA0872),以及制备抗胶原酶的多克隆抗体,观察胶原酶在钩体病豚鼠模型的组织中的表达,为研究其致病机制奠定基础。方法以问号钩端螺旋体赖型赖株基因组DNA为模板,用PCR扩增co... 目的通过克隆、表达问号钩端螺旋体赖型赖株的胶原酶基因colA(LA0872),以及制备抗胶原酶的多克隆抗体,观察胶原酶在钩体病豚鼠模型的组织中的表达,为研究其致病机制奠定基础。方法以问号钩端螺旋体赖型赖株基因组DNA为模板,用PCR扩增colA,产物克隆到表达载体pET-28b(+)中,构建含colA的重组质粒;将重组质粒转入E.coli Rosetta(DE3)菌株内,IPTG诱导表达后用Ni-NTA His-Bind亲和层析柱纯化重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫家兔制备抗胶原酶的多克隆抗体;Max Vision二步法染色检测胶原酶在感染钩端螺旋体的豚鼠肺组织中的分布。结果克隆表达目的基因,并成功制备了抗胶原酶的多克隆抗体。免疫组化显示在出血的肺组织中存在胶原酶。结论钩体病豚鼠模型的肺组织中有胶原酶的表达,并且存在于有钩端螺旋体分布的部位。本研究为进一步探讨胶原酶在钩端螺旋体侵袭和宿主组织出血中所起的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 胶原酶 致病机制
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问号钩端螺旋体重要蛋白研究进展 被引量：1
8
作者 曹志强 蒋秀高 张翠彩 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期180-185,共6页
钩端螺旋体(简称钩体)外膜蛋白(outer membrane proteins,OMPs)位于钩体表面,与宿主细胞直接接触,是重要的蛋白抗原。钩体OMPs是抗体和补体的作用部位,在致病和免疫应答过程中起重要的作用。一些钩体的外膜蛋白或外膜脂蛋白被证实有良... 钩端螺旋体(简称钩体)外膜蛋白(outer membrane proteins,OMPs)位于钩体表面,与宿主细胞直接接触,是重要的蛋白抗原。钩体OMPs是抗体和补体的作用部位,在致病和免疫应答过程中起重要的作用。一些钩体的外膜蛋白或外膜脂蛋白被证实有良好的抗原性和高度的基因保守性,其抗体具有广泛的交叉免疫凝集作用,这使得新一代基因工程疫苗开发成为可能。本文主要对钩端螺旋体几种重要OMPs的细胞定位、基因结构、在感染动物中的表达状态、在免疫保护中的作用等进行综述。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体属 细菌外膜蛋白类 抗原
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问号钩端螺旋体胶原酶结构和功能分析 被引量：6
9
作者 李文俊 余慧峰 +2 位作者 杨宏亮 姜叙诚 郭晓奎 《世界感染杂志》 2004年第1期9-13,共5页
目的：研究问号钩端螺旋体(简称问号钩体)致病机理，预测问号钩体胶原酶结构和功能，为进一步实验验证提供线索。方法：利用各种公共核酸及蛋白数据库资源，运用多种生物学软件对钩体胶原酶基因及其编码产物的结构和功能深入分析。结果... 目的：研究问号钩端螺旋体(简称问号钩体)致病机理，预测问号钩体胶原酶结构和功能，为进一步实验验证提供线索。方法：利用各种公共核酸及蛋白数据库资源，运用多种生物学软件对钩体胶原酶基因及其编码产物的结构和功能深入分析。结果：对问号钩体胶原酶进行了结构域归类；对其基因、蛋白的一般特性，蛋白一级结构，二级结构和超二级结构等作了对比性分析；对其序列中的部分片段：进行三维结构模拟；并绘制了其分子进化树，分析其垂直进化关系。结论：问号钩体胶原酶和其它多：种致病性微生物胶原酶具有不同层次、程度不等的相似性。它属于锌蛋白酶超家族和M9-蛋白酶家族。它可能在钩体浸润宿主并造成宿主多脏器出血等方面起重要作用。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 胶原酶 生物信息学 核酸序列
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问号钩端螺旋体colA基因产物胶原酶活性及其致病机制研究
10
作者 赵金方 谈潘莉 +3 位作者 汪浙炯 胡玮琳 严杰 Kokouvi Kassegne 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期7-12,共6页
目的了解不同问号钩端螺旋体(简称钩体)血清群colA基因分布和序列保守性、表达产物胶原酶活性以及感染细胞时colA基因表达水平变化和产物分泌情况。方法采用PCR及其产物测序法检测我国主要流行的7个问号钩体血清群代表株中colA基因并了... 目的了解不同问号钩端螺旋体(简称钩体)血清群colA基因分布和序列保守性、表达产物胶原酶活性以及感染细胞时colA基因表达水平变化和产物分泌情况。方法采用PCR及其产物测序法检测我国主要流行的7个问号钩体血清群代表株中colA基因并了解其序列保守性。构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株colA基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提取表达的目的重组蛋白rColA。采用分光光度法检测rColA水解I^IV型天然胶原蛋白及Azocoll和Pz-肽合成底物能力并测定其Km和Kcat值。采用实时荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测问号钩体赖株感染HUVEC、BEAS-2B、L-02、HEK293细胞时colA-mRNA水平变化及ColA分泌情况。结果不同血清群问号钩体均能扩增出全长colA基因片段,其核苷酸和氨基酸序列相似性高达99.4%~100%。所构建的colA基因表达系统能有效表达rColA。rColA能不同程度地水解上述6种底物,但水解III型胶原蛋白能力最强(P<0.05),其Km和Kcat值分别为2.16mg/mL和35.6h-1。问号钩体赖株感染各靶细胞时colA-mRNA水平显著升高(P<0.01),问号钩体-细胞共培养物上清中可检出ColA。结论问号钩体colA基因为序列保守、分布广泛的胶原酶编码基因,感染细胞时该基因产物表达上调并外分泌,从而在问号钩体感染宿主过程中发挥实际作用。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 colA基因 胶原酶 表达 分泌
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问号钩端螺旋体赖株溶血素基因LA0202的溶血机制
11
作者 杨杨 钟怡 +3 位作者 何平 胡宝瑜 郭晓奎 秦金红 《复旦学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期519-522,共4页
目的对问号钩端螺旋体赖株溶血素基因LA0202的溶血机制进行研究。方法纯化重组蛋白LA0202并制备多克隆抗体;Western blot验证重组蛋白在问号钩端螺旋体培养过程中的表达;并进行重组蛋白LA0202溶血活性影响因素实验。结果Western blot显... 目的对问号钩端螺旋体赖株溶血素基因LA0202的溶血机制进行研究。方法纯化重组蛋白LA0202并制备多克隆抗体;Western blot验证重组蛋白在问号钩端螺旋体培养过程中的表达;并进行重组蛋白LA0202溶血活性影响因素实验。结果Western blot显示LA0202在钩体培养过程中可以表达,加入二价金属阳离子对重组蛋白溶血活性亦无明显激活作用,加入蛋白酶抑制剂对溶血活性无明显抑制作用,高温条件致使溶血活性丧失,加入渗透压保护剂PEG6000能抑制溶血活性。结论问号钩端螺旋体赖株溶血素基因LA0202为在钩体生长过程中表达的一成孔蛋白类溶血素。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 蛋白表达 成孔溶血素
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问号钩端螺旋体疫苗候选基因LB061的抗原性和保守性研究
12
作者 杨宏亮 林玮 +4 位作者 秦金红 胡宝瑜 杨杨 谭立志 郭晓奎 《微生物与感染》 2007年第1期26-29,共4页
目的克隆表达和鉴定问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株中疫苗候选基因LB061,研究LB061的免疫原性和在不同血清型钩端螺旋体菌中的保守性。方法生物信息学软件分析预测LB061的特征。构建原核表达质粒pQE31-LB061,经IPTG诱导后用SDS-PAGE... 目的克隆表达和鉴定问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株中疫苗候选基因LB061,研究LB061的免疫原性和在不同血清型钩端螺旋体菌中的保守性。方法生物信息学软件分析预测LB061的特征。构建原核表达质粒pQE31-LB061,经IPTG诱导后用SDS-PAGE及Western印迹法鉴定表达情况。用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,Western印迹法检测其抗原性和在不同血清型钩端螺旋体中的保守性。Western印迹法检测钩端螺旋体全菌兔抗血清中的LB061抗体。结果生物信息学预测结果显示,LB061含有DUF839家族结构域。成功克隆了重组质粒pQE31-LB061,表达的重组蛋白能刺激BALB/c小鼠产生抗体(效价为1∶32000),并能与相应抗体反应,具有良好的抗原性。在16株不同血清型的钩端螺旋体中均可检测到LB061蛋白的表达,并在钩端螺旋体赖株全菌兔抗血清中检测到其抗体。结论LB061蛋白可以作为外膜蛋白刺激宿主免疫系统产生抗体,具有良好的抗原性和保守性。本研究为其作为疫苗候选基因的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 外膜蛋白 疫苗候选基因 抗原性 保守性
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问号钩端螺旋体基因组DNA芯片的研制
13
作者 盛跃颖 史耀舟 +4 位作者 何平 杨杨 胡宝瑜 赵国屏 郭晓奎 《微生物与感染》 2006年第2期103-104,F0003,F0004,共4页
目的研制并初步评估问号钩端螺旋体(简称钩体)赖型赖株的基因组DNA芯片。方法利用Primegens引物设计软件筛选出问号钩体赖型赖株全基因组中的特异性基因进行引物设计。对成功设计出相应引物的3 290个基因用聚合酶链反应方法进行扩增,以... 目的研制并初步评估问号钩端螺旋体(简称钩体)赖型赖株的基因组DNA芯片。方法利用Primegens引物设计软件筛选出问号钩体赖型赖株全基因组中的特异性基因进行引物设计。对成功设计出相应引物的3 290个基因用聚合酶链反应方法进行扩增,以纯化后的产物点样制备芯片。并用双色荧光杂交策略对芯片质量进行了初步平估。结果共获得3 290个基因产物用于点样。参考株自身杂交实验结果表明:该芯片有较高的点一致性、信噪比和较低的假阳性率。结论成功制备了包含问号钩体赖型赖株3 290个目的基因的基因组DNA芯片,并可用于基于该芯片的问号钩体比较基因组学的研究。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 基因组DNA芯片
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两株问号钩端螺旋体OMPL1基因的分离与序列分析
14
作者 邱薇 范泉水 +4 位作者 孙阳 李刚山 孟佩云 尹惠琼 郑颖 《中华临床医学杂志》 2004年第6期40-42,共3页
用PCR方法获得了两株问号钩体赖型56601株和爪哇型56602株的OMPL1基因，并进行了全基因序列测定，测序结果与流感伤寒型RH52株的OMPL1基因进行了核苷酸序列比较和推导的氨基酸序列比较。赖型56601株和爪哇型56602株钩体OMPL1基因核苷酸... 用PCR方法获得了两株问号钩体赖型56601株和爪哇型56602株的OMPL1基因，并进行了全基因序列测定，测序结果与流感伤寒型RH52株的OMPL1基因进行了核苷酸序列比较和推导的氨基酸序列比较。赖型56601株和爪哇型56602株钩体OMPL1基因核苷酸序列与流感伤寒型RH52株的同源性分别为89％和80％，推导的外膜蛋白氨基酸序列的同源性分别为92％和88％。表明问号钩体赖型56601株和爪哇型56602株及流感伤寒型RH52株OMPL1基因的核苷酸序列存在较大差别，OMPL1基因在问号钩端螺旋体的基因分类中有一定作用。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 OMPL1基因 基因序列 外膜蛋白基因 菌株
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问号钩端螺旋体中一个新的OmpA家族蛋白抗原性及保守性研究 被引量：4
15
作者 林玮 杨宏亮 +4 位作者 杨杨 胡宝瑜 董珂 谭立志 郭晓奎 《微生物与感染》 2007年第4期202-205,共4页
目的克隆表达和鉴定问号钩端螺旋体(L.interrogans)黄疸出血群赖型赖株中一个新的外膜蛋白(Omp)A家族基因LA0301,研究LA0301编码蛋白的抗原性和在15个钩端螺旋体(简称钩体)血清群代表株中的保守性,探讨其在疫苗研究中的意义。方法生物... 目的克隆表达和鉴定问号钩端螺旋体(L.interrogans)黄疸出血群赖型赖株中一个新的外膜蛋白(Omp)A家族基因LA0301,研究LA0301编码蛋白的抗原性和在15个钩端螺旋体(简称钩体)血清群代表株中的保守性,探讨其在疫苗研究中的意义。方法生物信息学软件分析预测LA0301的特征。构建原核表达重组体pQE31-LA0301,经IPTG诱导后用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白质印迹法(Western blot)鉴定表达情况。用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,Western印迹检测其免疫反应性和在不同血清型钩体中的保守性。酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western印迹检测兔抗钩体全菌血清中的LA0301编码蛋白的抗体。结果生物信息学预测结果显示,LA0301具有OmpA家族的结构域。克隆表达了重组质粒pQE31-LA0301,重组蛋白能刺激BALB/c小鼠产生特异性抗体,效价为1:32000。在兔抗钩体全菌血清中检测到特异的LA0301蛋白抗体,并在15个血清群的代表株钩体中均可检测到LA0301蛋白。结论LA0301蛋白是问号钩体中一个新的OmpA家族蛋白,具有良好的抗原性和保守性,并且能在钩体感染的过程中刺激机体产生相应的抗体。为进一步研究钩体新型疫苗候选基因奠定了基础。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 OMPA 疫苗候选基因
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问号钩端螺旋体全基因组的更新注释 被引量：3
16
作者 宋卫峰 赵蔚 郭晓奎 《上海第二医科大学学报》 CSCD 2004年第6期421-425,共5页
目的对问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库中未注释的基因进行重新注释,并寻找可能的新致病基因。方法将钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库中功能未知的编码序列(CDSs)在BLASTP/NCBI数据库中比较,初步预测基因功... 目的对问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库中未注释的基因进行重新注释,并寻找可能的新致病基因。方法将钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库中功能未知的编码序列(CDSs)在BLASTP/NCBI数据库中比较,初步预测基因功能,对可能的致病基因及其编码产物运用多种生物学软件进行深入分析。结果未知CDSs中有82个与NCBI数据库中的编码蛋白序列有很高的同源性,其中LA0063和LA3291编码金属蛋白酶,可能与致病有关。结论通过钩端螺旋体黄疸出血群赖株全基因组数据库中功能未知的CDSs进行定期比对,可以不断完善该数据库的功能注释,同时可以发现新的致病基因,有助于钩端螺旋体病致病机理的最终阐明。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 基因组 皮肤破损 染色体
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问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB_2和fliR的克隆及原核表达系统的构建 被引量：1
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作者 王欣莹 范洪学 严杰 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2006年第1期5-7,11,共4页
目的克隆问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB2和fliR,并构建其原核表达载体。方法按常规苯酚-氯仿法提取问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组DNA,高保真PCR扩增flhA、flhB2和fliR基因片段,T-A克隆后测序,构建原核表达载体,采... 目的克隆问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB2和fliR,并构建其原核表达载体。方法按常规苯酚-氯仿法提取问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组DNA,高保真PCR扩增flhA、flhB2和fliR基因片段,T-A克隆后测序,构建原核表达载体,采用SDS-PAGE和免疫印迹法检测目的融合蛋白的表达。结果问号钩体56601株flhA、flhB2和fliR基因扩增片段的核苷酸序列与报道的相应序列同源性分别为100%、99·9%和99·9%,氨基酸序列同源性分别为100%、99·8%和100%。所构建的重组原核表达系统在IPTG的诱导下,能有效地表达目的融合蛋白Trx-FlhA、Trx-FlhB2和Trx-FliR,产量约为细菌总蛋白的10%。结论已成功构建了问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB2和fliR原核表达系统。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 鞭毛相关基因 克隆 表达
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fliR基因与问号钩端螺旋体黏附及损伤细胞功能相关性的研究 被引量：1
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作者 阮萍 王欣莹 +2 位作者 孙爱华 李世军 严杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第6期572-578,共7页
目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)fliR基因的致病性。方法:分别从问号钩体黄疸出血群56601株DNA和pET42a质粒中扩增fliR基因和kana基因。构建fliR基因自杀质粒,并设计和合成特异性siRNA。采用分别基于自杀质粒的基因敲除、基于siRNA... 目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)fliR基因的致病性。方法:分别从问号钩体黄疸出血群56601株DNA和pET42a质粒中扩增fliR基因和kana基因。构建fliR基因自杀质粒,并设计和合成特异性siRNA。采用分别基于自杀质粒的基因敲除、基于siRNA的基因沉默技术构建问号钩体fliR基因突变株,并用PCR、测序、半定量RT-PCR进行鉴定。采用小鼠单核-巨噬细胞J774A.1黏附试验和流式细胞术,检测敲除fliR基因的问号钩体突变株56601fliR-Kana、siRNA阻断fliR基因的问号钩体突变株56601siRNA-R2株黏附细胞,及诱导细胞坏死或凋亡能力的变化。结果:所克隆的fliR基因与GenBank中相应基因的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.9%和100%,所克隆的kana基因核苷酸序列与pET42a图谱完全相同。56601fliR-Kana可在含氨苄青霉素和卡那霉素的EMJH培养基中生长,PCR和测序结果证实56601fliR-Kana株fliR基因中插入了kana基因。56601fliR-Kana株fliR基因mRNA水平明显下降(P<0.01),56601siRNA-R2株fliR基因mRNA水平也低于野生株(P<0.05)。56601fliR-Kana和56601siRNA-R2黏附J774A.1细胞的能力基本消失,诱导J774A.1细胞坏死或凋亡的能力也明显减弱(P<0.01)。结论:fliR基因是问号钩体毒力相关基因,其功能与问号钩体黏附细胞、诱导细胞凋亡或坏死密切相关。 展开更多
关键词 钩端螺旋体 问号/致病力 基因表达 细胞凋亡 Ⅲ型分泌系统 fliR基因 黏附 坏死
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问号钩端螺旋体对主要细胞外基质分子黏附作用及其差异性研究 被引量：1
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作者 张皓 孙爱华 严杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第6期579-584,共6页
目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)对细胞外基质(ECM)分子的黏附作用及其差异。方法:建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株对J774A.1、L929和Vero细胞感染模型,采用Fontana镀银染色法及显微镜检查法,了解问号钩体56601株黏附细胞ECM的效... 目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)对细胞外基质(ECM)分子的黏附作用及其差异。方法:建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株对J774A.1、L929和Vero细胞感染模型,采用Fontana镀银染色法及显微镜检查法,了解问号钩体56601株黏附细胞ECM的效果。建立多种ELISAs,检测问号钩体56601株黏附ECM分子层粘连蛋白(LN)、纤维纤连蛋白(FN)、核心蛋白多糖(DEN)及胶原蛋白1、2、4(COL1,2,4)的作用,采用竞争性抑制试验对上述实验结果进行验证。结果:问号钩体56601株能以一端或两端黏附于L929、J774A.1和Vero细胞的ECM部位。问号钩体56601株可与上述6种ECM分子发生黏附,其中对COL1、LN、COL4的黏附作用较强。问号钩体56601株分别与上述6种ECM分子预孵育后,对相应ECM分子的黏附作用明显下降。结论:ECM是问号钩体黏附宿主细胞的主要部位。LN、FN、DEN、COL1、COL2、COL4均是问号钩体黏附的受体分子,但问号钩体对不同ECM分子的黏附效果有一定差异。 展开更多
关键词 钩端螺旋体 问号/致病力 细胞凋亡 细胞粘附 宿主细胞 细胞外基质
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问号钩端螺旋体lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因原核表达及其产物免疫原性分析 被引量：4
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作者 罗冬娇 邱晓枫 +4 位作者 王江 严谨 王海斌 周金成 严杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第6期599-604,共6页
目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,优化目的产物表达条件并对表达产物免疫原性进行鉴定。方法:采用连接引物PCR构建lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因,并用常规基因工程方法建立其原... 目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,优化目的产物表达条件并对表达产物免疫原性进行鉴定。方法:采用连接引物PCR构建lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因,并用常规基因工程方法建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统,检测目的重组蛋白rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2表达量。采用免疫双扩散试验及WesternBlot,鉴定rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2的免疫原性。结果:获得了序列正确的lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统E.coliBL21DE-3pET42a-lipL32/1-lipL21-ompL1/2。表达条件优化后的rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2产量为37.78mg/L,是优化前的3.7倍。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2兔抗血清免疫双扩效价为1∶4。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2抗血清能识别rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2以及rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2能与问号钩体56601株全菌兔抗血清以及黄疸出血群、流感伤寒群、波摩那群、秋季群问号钩体感染患者血清出现阳性杂交信号。结论:成功地构建了lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及通用型钩体病血清学检测的抗原。 展开更多
关键词 钩端螺旋体 问号 抗原 细菌/分析 聚合酶链反应/方法 属特异性抗原 lipL32基 因/lipL21基因/OmpL1/2 融合基因/构建 原核表达 免疫原性/鉴定
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