目的构建含有人骨形成蛋白4(human bone morphogenetic protein4,hBMP-4)的非复制型腺病毒表达载体pAdE/hBMP-4并检测其表达。方法酶切质粒pCS2(+)/hBMP-4获得目的基因片段,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),再亚克隆至pShuttle-CMV,电转...目的构建含有人骨形成蛋白4(human bone morphogenetic protein4,hBMP-4)的非复制型腺病毒表达载体pAdE/hBMP-4并检测其表达。方法酶切质粒pCS2(+)/hBMP-4获得目的基因片段,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),再亚克隆至pShuttle-CMV,电转化至含有pAdEasy-1骨架质粒的E.coliBJ5183/p中进行同源重组,重组质粒转染HEK293细胞包装成含有hBMP-4基因的非复制型腺病毒。病毒颗粒感染HEK293和HeLa细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western-blot检测。结果获得了含有目的基因hBMP-4的非复制型腺病毒表达载体pAdE/hBMP-4,酶切鉴定提示构建正确,RT-PCR检测到hBMP-4基因的转录,Western-blot检测到hBMP-4蛋白表达。结论将目的基因hBMP-4克隆至非复制型腺病毒表达载体中,为进一步研究其在基因治疗骨缺损中的应用奠定基础。展开更多
文摘目的构建含有人骨形成蛋白4(human bone morphogenetic protein4,hBMP-4)的非复制型腺病毒表达载体pAdE/hBMP-4并检测其表达。方法酶切质粒pCS2(+)/hBMP-4获得目的基因片段,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),再亚克隆至pShuttle-CMV,电转化至含有pAdEasy-1骨架质粒的E.coliBJ5183/p中进行同源重组,重组质粒转染HEK293细胞包装成含有hBMP-4基因的非复制型腺病毒。病毒颗粒感染HEK293和HeLa细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western-blot检测。结果获得了含有目的基因hBMP-4的非复制型腺病毒表达载体pAdE/hBMP-4,酶切鉴定提示构建正确,RT-PCR检测到hBMP-4基因的转录,Western-blot检测到hBMP-4蛋白表达。结论将目的基因hBMP-4克隆至非复制型腺病毒表达载体中,为进一步研究其在基因治疗骨缺损中的应用奠定基础。
