逆转录环介导等温扩增技术检测H3亚型猪流感病毒 被引量：8

1

作者 刘中勇 朱道中 +4 位作者 李少璃 冀君 毕英佐 谢青梅 曹永长 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第7期1-5,共5页

基于环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立了一种用于快速检测H3亚型猪流感病毒的方法。根据GenBank中收录的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因保守区的序列,设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物,建立RT-LAMP反应体系;经优化,确定了最佳... 基于环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立了一种用于快速检测H3亚型猪流感病毒的方法。根据GenBank中收录的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因保守区的序列,设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物,建立RT-LAMP反应体系;经优化,确定了最佳的LAMP反应条件。扩增后产物形成的焦磷酸离子和溶液中的镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀,结果可视。同时用特异性内切酶HhaⅠ对所获得的产物进行酶切鉴定,所得的酶切产物大小与理论值完全符合。用已建立的RT-LAMP技术检测临床样品,检测结果与RT-PCR方法符合率均达到100%。结果表明,本研究建立的RT-LAMP检测猪流感病毒方法,操作简单,灵敏度高,特异性强,是一种适用于现场诊断的检测技术。 展开更多

关键词 h3亚型猪流感病毒 血凝素 逆转录环介导等温扩增

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H1、H3亚型猪流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：4

2

作者 王博 王慧煜 +4 位作者 赵宝华 罗静 王承民 何宏轩 韩雪清 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第10期3035-3041,共7页

为建立一种快速、准确地检测H1和H3亚型猪流感病毒(swine influence virus,SIV)的方法,根据H1和H3亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计2对特异性引物和2条Taq Man探针,建立双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该... 为建立一种快速、准确地检测H1和H3亚型猪流感病毒(swine influence virus,SIV)的方法,根据H1和H3亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计2对特异性引物和2条Taq Man探针,建立双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法敏感性高,可检测到最低拷贝数为102拷贝/μL;重复性良好,重复孔Ct值的变异系数均在5%以下;特异性好,除H1和H3亚型SIV外,H4、H5、H7、H9亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒检测均为阴性;在田间样品中成功检出1株H1和1株H3亚型SIV,检出率为1.16%。该方法准确、快速、灵敏、特异,可为H1、H3亚型SIV的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。 展开更多

关键词 h1和h3亚型猪流感病毒(SIV) 双重实时荧光定量RT-PCR TAQMAN探针

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H3亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接ELISA检测方法的建立 被引量：4

3

作者 万春和 刘明 +1 位作者 刘春国 张云 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期252-257,共6页

根据GenBank上登录的H3亚型猪流感病毒HA基因序列设计了1对引物,经PCR扩增出HA基因目的片段,并将其克隆到pFastBacGP67C杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67C-H3,转化至含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,... 根据GenBank上登录的H3亚型猪流感病毒HA基因序列设计了1对引物,经PCR扩增出HA基因目的片段,并将其克隆到pFastBacGP67C杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67C-H3,转化至含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体,获得重组转座子rBacmid-H3,在脂质体介导下转染处于对数生长期的sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBv-H3,将其感染sf9昆虫细胞,收获目的蛋白。经血凝试验、SDS-PAGE、Western-blot、免疫组织化学分析,结果表明,HA蛋白得到表达,且具有良好的免疫学活性。用表达的HA蛋白作为包被抗原,初步建立了H3亚型猪流感病毒的间接ELISA检测方法,通过对93份送检的疑似猪流感血清进行检测,结果显示,检出阳性率为46.24%。上述结果为建立快速、准确、简便的H3亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定了基础。 展开更多

关键词 h3亚型猪流感病毒 血凝素基因 昆虫细胞杆状病毒表达系统 间接酶联免疫吸附试验

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H3N2亚型猪流感病毒血凝素基因的原核表达及间接ELISA诊断方法的建立 被引量：5

4

作者 刘天强 于海 +3 位作者 张强 李国新 王斌 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期795-799,823,共6页

采用RT-PCR扩增H3N2亚型猪流感病毒HA1基因。将该片段插入到原核表达载体pET-30a(+)中,构建原核表达载体pET-HA1。阳性质粒转化宿主菌BL21,经IPTG诱导,HA1基因获得表达,其重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确... 采用RT-PCR扩增H3N2亚型猪流感病毒HA1基因。将该片段插入到原核表达载体pET-30a(+)中,构建原核表达载体pET-HA1。阳性质粒转化宿主菌BL21,经IPTG诱导,HA1基因获得表达,其重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定表达HA1基因的最佳诱导条件。Western blot分析表明表达产物具有良好的抗原活性。用纯化的表达产物作为包被抗原建立了检测H3亚型猪流感病毒抗体的间接ELISA方法,确定抗原最佳包被浓度为4μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,阳性标准初步判定为:待检血清OD值>0.4,而且待检血清OD值/阴性血清OD值>2。应用此方法对309份临床血清样品进行了检测,并与HI方法进行了比较,结果表明基于重组HA蛋白的间接ELISA方法可用于H3N2亚型猪流感病毒感染的初步诊断。 展开更多

关键词 h3N2亚型猪流感病毒 血凝素基因 原核表达

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十五种中药体外抗H3N2亚型猪流感病毒效果的研究 被引量：7

5

作者 徐振娜 王丙云 +4 位作者 计慧琴 陈志胜 陈胜峰 杨鸿 何永明 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第3期135-138,共4页

为了观察15种中药抗H3N2亚型猪流感病毒的效果,试验通过先加中药再加病毒、先加病毒再加中药及中药和病毒混合后一起加这3种加药方式,采用鸡胚培养法和血凝(HA)试验研究了赤芍药等15种中药在体外抗猪流感病毒的效果;然后,将有显著效果... 为了观察15种中药抗H3N2亚型猪流感病毒的效果,试验通过先加中药再加病毒、先加病毒再加中药及中药和病毒混合后一起加这3种加药方式,采用鸡胚培养法和血凝(HA)试验研究了赤芍药等15种中药在体外抗猪流感病毒的效果;然后,将有显著效果的中药筛选出来,测定其治疗指数(TI)和半数有效量(ED50)。结果表明:在3种加药方式中,赤芍药和贯众抗猪流感病毒的效果最显著。 展开更多

关键词 h3N2亚型猪流感病毒 中药 鸡胚 血凝(hA)试验 治疗指数 半数有效量

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1株H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定

6

作者 齐海涛 闫军霞 粟硕 《中国畜牧兽医文摘》 2013年第9期84-84,共1页

为了解广东猪流感病毒（SIV）的流行变异情况，2010年11月从广东某规模猪场采集流感症状的猪鼻拭子60份，接种10日龄SPF鸡胚，分离到1株猪流感病毒，通过流感分型RT—PCR和HI试验鉴定为H3N2亚型SIV，命名为A／swine／6uangdong／L22／2... 为了解广东猪流感病毒（SIV）的流行变异情况，2010年11月从广东某规模猪场采集流感症状的猪鼻拭子60份，接种10日龄SPF鸡胚，分离到1株猪流感病毒，通过流感分型RT—PCR和HI试验鉴定为H3N2亚型SIV，命名为A／swine／6uangdong／L22／2010（H3N2），进行全基因序列测定及相似性分析发现，该分离株有低致病性流感分子特征，该毒株的8个基因片段连同最近广东猪群流行的流感毒株与2000年前后H3N2人流感病毒有较高的同源性。 展开更多

关键词 h3N2亚型猪流感病毒 分离鉴定 基因序列测定 SPF鸡胚 相似性分析 人流感病毒 规模猪场 10日龄

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H3N2亚型猪流感病毒HA1、HA2基因的原核表达及抗原性分析 被引量：3

7

作者 宋玉慧 王翔宇 +4 位作者 王洁琼 潘梦梦 张剑 刘琳 李新生 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第10期2762-2767,共6页

血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的一个重要蛋白,在疾病预防和治疗中具有重要作用。本试验旨在克隆和表达H3N2亚型猪流感病毒A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的HA1和HA2基因。用含有H3N2亚型SIV的鸡... 血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的一个重要蛋白,在疾病预防和治疗中具有重要作用。本试验旨在克隆和表达H3N2亚型猪流感病毒A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的HA1和HA2基因。用含有H3N2亚型SIV的鸡胚尿囊液提取RNA,RT-PCR扩增后将目的基因定向克隆到pET-28a(+)原核表达载体上,并将其转入宿主菌BL21(DE3)pLyS进行表达,IPTG诱导后经SDS-PAGE检测并用该病毒重组HA蛋白制备的特异性单克隆抗体1C10作为一抗对两种蛋白进行Western blotting分析。SDS-PAGE结果显示,得到HA1和HA2大小分别为34.8、23.2ku的重组蛋白,Western blotting结果表明,HA1蛋白与1C10单克隆抗体具有良好的反应原性,且1C10单克隆抗体表位在HA1蛋白上。本试验结果为进一步研究血凝素蛋白的结构和功能,以及建立快速诊断方法和基因工程疫苗提供材料。 展开更多

关键词 h3N2亚型猪流感病毒 hA1基因 hA2基因 原核表达

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H3N2亚型猪流感病毒HA和HA1蛋白的原核表达 被引量：1

8

作者 纪方晓 陈济铛 +2 位作者 石庆伟 王衡 张桂红 《动物医学进展》 北大核心 2016年第6期22-25,共4页

为原核表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的HA和HA1蛋白,通过RT-PCR方法获得SIV的HA和HA1基因,克隆至原核表达载体pMAL-c5X,并转化至原核表达菌Rosetta(DE3)中,表达菌经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示,成功表达了H... 为原核表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的HA和HA1蛋白,通过RT-PCR方法获得SIV的HA和HA1基因,克隆至原核表达载体pMAL-c5X,并转化至原核表达菌Rosetta(DE3)中,表达菌经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示,成功表达了H3亚型SIV的HA和HA1蛋白,目的蛋白均以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,并与H3N2亚型SIV的HA单克隆抗体反应,说明HA和HA1蛋白具有良好的反应原性。 展开更多

关键词 h3N2亚型猪流感病毒 hA蛋白 hA1蛋白 原核表达

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H3N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆与序列分析 被引量：1

9

作者 高敏 薛慧文 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 2006年第3期1-4,共4页

从鸡胚尿囊液中提取H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的RNA,根据已发表的A型流感病毒的核苷酸序列,设计了一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功地扩增了SIV的NS1基因．将NS1基因的cDNA克隆后进行了序列测定,测序结果表明,所扩增... 从鸡胚尿囊液中提取H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的RNA,根据已发表的A型流感病毒的核苷酸序列,设计了一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功地扩增了SIV的NS1基因．将NS1基因的cDNA克隆后进行了序列测定,测序结果表明,所扩增的778 nt片段包含了完整的NS1基因的开放阅读框．核苷酸序列比较分析结果表明,该毒株与A／Swine／Texas／4199-2／98(H3N2)、A／Swine／Iowa／533／99(H3N2)、A／Swine／HongKong／126／ 82(H3N2)、A／Swine／Pingtung／7-12／99(HIN2)核苷酸序列的同源性为92．7％～98．6％,推导的氨基酸序列同源性为92．6％～96．3％． 展开更多

关键词 h3N2亚型猪流感病毒NSI基因 克隆 序列分析

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2018~2019年安阳市规模猪场猪流感病毒病调查研究 被引量：3

10

作者 王庆云 赵琳 +1 位作者 郭希萍 王会英 《畜牧兽医杂志》 2021年第1期48-50,共3页

猪流感病毒(Swineinfluenza virus,SIV)主要包括H1亚型和H3亚型,是导致猪流感的主要病毒亚型,在中国猪群中广为传播,为养猪业带来重大经济影响。为了解安阳市地区猪流感的情况,我们收集了2018~2019年安阳市各地共1169份猪血清,采用ELIS... 猪流感病毒(Swineinfluenza virus,SIV)主要包括H1亚型和H3亚型,是导致猪流感的主要病毒亚型,在中国猪群中广为传播,为养猪业带来重大经济影响。为了解安阳市地区猪流感的情况,我们收集了2018~2019年安阳市各地共1169份猪血清,采用ELISA酶联免疫检测方法,检测了安阳市猪群中猪流感病毒H1亚型和H3亚型的感染情况。结果显示,H1亚型的猪流感病毒最高感染率为70.44%,主要分布在北关区;H3亚型的猪流感病毒最高感染率为36.90%,主要分布在林州区;H1亚型和H3亚型混合感染率最高为34.52%,也位于林州区。本研究结果表明2018~2019年安阳市SIV感染比较普遍,类禽型猪H1亚型的感染率较高,H3亚型的感染率相对较低,同时也存在混合感染的现象。 展开更多

关键词 猪流感 h1亚型猪流感病毒 h3亚型猪流感病毒 酶联免疫吸附试验(ELISA试验)

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以小鼠为模型评价重组伪狂犬病病毒rPRV-HA的免疫效力 被引量：1

11

作者 郑宝亮 周国辉 +5 位作者 田志军 仇华吉 杨焕良 尹训南 胡守萍 童光志 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期361-367,共7页

以小鼠为动物模型,对此前构建的表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)基因的重组伪狂犬病病毒(rPRV-HA)进行了免疫效力评价。按每只105.0TCID50rPRV-HA的剂量通过滴鼻接种8周龄雌性BALB/c小鼠(n=60),同时设Bartha-K61免疫对照组(n=60... 以小鼠为动物模型,对此前构建的表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)基因的重组伪狂犬病病毒(rPRV-HA)进行了免疫效力评价。按每只105.0TCID50rPRV-HA的剂量通过滴鼻接种8周龄雌性BALB/c小鼠(n=60),同时设Bartha-K61免疫对照组(n=60)、非免疫攻毒对照组(n=20)和非免疫不攻毒对照组(n=10)。于免疫后不同时间分别从rPRV-HA免疫组和Bartha-K61免疫对照组随机剖杀一定数量的小鼠,其余小鼠于免疫后第28天用105.0TCID50同亚型SIV毒株A/Swine/Heilongjiang/74/2000(H3N2)进行强毒攻击。攻毒后第4、7、14天分别剖杀小鼠,进行间接免疫荧光、病毒分离、血清学和病理组织学检测。结果表明,重组病毒主要分布于肺脏;免疫后14 d起,从rPRV-HA免疫组及Bartha-K61免疫对照组均可检测到针对PRV的荧光抗体;从rPRV-HA免疫组可以检测到针对SIV的荧光抗体和血凝抑制抗体,而各对照组均呈阴性。攻毒后从rPRV-HA免疫组小鼠未分离到攻击病毒,血凝抑制抗体显著升高,病理变化显著轻于对照组,表明rPRV-HA免疫小鼠可以抵抗同亚型SIV的攻击,可以作为rPRV-HA免疫效力评价模型。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 h3N2亚型猪流感病毒 重组病毒 小鼠模型 免疫效力

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H3N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及间接ELISA检测方法的建立 被引量：1

12

作者 张博 郭万柱 +4 位作者 徐志文 王印 朱玲 孙志勇 王小玉 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期297-302,共6页

采用RT-PCR方法成功扩增了H3N2亚型猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)四川分离株(A/Swine/Sichuan/01/2006)的NS1基因,将其克隆于原核表达载体pET-32a(+)中,构建了重组质粒pET32-NS1。将该质粒转化进大肠杆菌Rosetta^(TM),经终浓度... 采用RT-PCR方法成功扩增了H3N2亚型猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)四川分离株(A/Swine/Sichuan/01/2006)的NS1基因,将其克隆于原核表达载体pET-32a(+)中,构建了重组质粒pET32-NS1。将该质粒转化进大肠杆菌Rosetta^(TM),经终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE电泳表明融合的NS1蛋白得到了大量的表达,该融合蛋白的相对分子质量约为43 500。Western-blotting结果显示该蛋白能与阳性血清发生特异性反应具有很好的免疫反应原性。结果表明,所建立的ELISA方法与几种常见猪群传染病病原无交叉反应,具有较好的特异性、敏感性和重复性,可进一步优化应用于临床SIV的检测。 展开更多

关键词 猪流感病毒h3N2亚型 NS1基因 原核表达 间接ELISA

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表达H3N2亚型猪流感病毒血凝素蛋白的重组腺病毒在猪体内的免疫试验

13

作者 汪思钧 亓文宝 +4 位作者 徐成刚 罗开健 张桂红 叶贺佳 廖明 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期653-657,共5页

【目的】本研究旨在评价表达H3N2亚型猪流感病毒血凝素蛋白的重组腺病毒在猪体内的免疫效果。【方法】以10-8TCID50、2×10-8TCID50和4×10-8TCID50的剂量经肌肉注射接种后2到6周每周检测血凝抑制(HI)抗体;比较肌肉注射、滴鼻... 【目的】本研究旨在评价表达H3N2亚型猪流感病毒血凝素蛋白的重组腺病毒在猪体内的免疫效果。【方法】以10-8TCID50、2×10-8TCID50和4×10-8TCID50的剂量经肌肉注射接种后2到6周每周检测血凝抑制(HI)抗体;比较肌肉注射、滴鼻、灌胃3种接种途径对仔猪免疫效果的影响,并通过攻毒保护试验进一步考察重组腺病毒rAd-HA-GFP在猪体内的免疫效力。【结果】以不同的剂量分别经肌肉注射免疫后,HI抗体水平与接种剂量呈正相关。3种接种途径均能刺激仔猪产生特异性抗体,肌肉注射组的HI抗体要高于其他2组,差异显著(P<0.01)。通过滴鼻和肌肉注射方式进行攻毒后,阴性对照组仔猪在攻毒2d后出现体温升高、打喷嚏、咳嗽、流鼻液、精神沉郁、体重减轻等症状;而各免疫组仔猪未观察到明显的临床症状,各免疫组的病毒分离率也明显低于阴性对照组。【结论】重组腺病毒rAd-HA-GFP诱导的HI抗体达到1∶320可以有效抵抗H3N2亚型猪流感病毒的侵袭,可以作为候选疫苗株。 展开更多

关键词 h3N2亚型猪流感病毒 血凝素蛋白 重组腺病毒

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