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利用RIP-Seq技术鉴定HepG2细胞中与HuR蛋白结合的lncRNAs 被引量：2
1
作者 黄亚洲 刘叶文 +3 位作者 王玲玲 金晶 陈茜 李伟 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期417-426,共10页
长链非编码RNAs(long noncoding RNAs,lncRNAs)可在表观遗传水平、转录水平和转录后水平调节基因的表达,对细胞功能起着重要的调节作用。RNA结合蛋白可与很多的RNA结合,并在转录后水平发挥重要的调节作用。然而,RNA结合蛋白是否可以在... 长链非编码RNAs(long noncoding RNAs,lncRNAs)可在表观遗传水平、转录水平和转录后水平调节基因的表达,对细胞功能起着重要的调节作用。RNA结合蛋白可与很多的RNA结合,并在转录后水平发挥重要的调节作用。然而,RNA结合蛋白是否可以在细胞内广泛结合lncRNAs对其发挥调节作用,仍需进一步证实。本研究通过RNA结合蛋白免疫沉淀技术联合高通量测序(RNA binding protein immunoprecipitation-high throughput sequencing,RIP-Seq)的方法在人肝癌细胞株HepG2中,鉴定与人抗原R(human antigen R,HuR)蛋白相结合的lncRNA分子,并进行了初步的验证。首先,通过HuR-RIP实验分离与HuR蛋白结合的RNA分子,然后高通量测序及生物信息学分析。根据分析结果,鉴定出HepG2细胞中361条与HuR蛋白结合的lncRNAs分子,包括基因间lncRNA(large intergenic noncoding RNA,LincRNA)、内含子lncRNA、与编码基因正义链有重叠的lncRNA和与编码基因反义链有重叠lncRNA(antisense lncRNA)等。并进一步通过RIP-qPCR技术,对其中20条LincRNA分子进行了定量检测,验证测序结果。在HepG2细胞中敲低HuR基因表达,发现这些LincRNA分子中,11条LincRNA分子表达水平显著降低(P<0.05),2条LincRNA显著升高(P<0.05),剩余7条LincRNA表达量未发生变化(P>0.05)。本研究结果说明,HuR在细胞内可以广泛结合lncRNA分子,并且可能对结合的lncRNA分子的表达量产生影响,这也为进一步研究这些lncRNA的功能和HuR调控网络的研究提供了基础。 展开更多
关键词 人抗原R蛋白 长链非编码rna rna结合蛋白免疫沉淀技术-高通量测序 测序数据分析 HEPG2细胞
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紫外交联免疫沉淀技术原理及其应用
2
作者 杜亚琼 王琬瑶 +2 位作者 高帆 徐旸 时文涛 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2024年第1期136-144,共9页
紫外交联免疫沉淀(UV cross-linking immunoprecipitation,CLIP)技术最初建立于2003年。通过紫外交联、免疫沉淀、逆转录及后续的高通量测序等步骤,可在全转录组范围鉴定特定RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBP)的靶标RNA序列和结合... 紫外交联免疫沉淀(UV cross-linking immunoprecipitation,CLIP)技术最初建立于2003年。通过紫外交联、免疫沉淀、逆转录及后续的高通量测序等步骤,可在全转录组范围鉴定特定RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBP)的靶标RNA序列和结合位点。在近20年的应用过程中,该技术被不断改进和完善,可操作性、实验结果的准确性都有所提升,技术的应用范围也有所拓展。本文对CLIP技术的基本原理、实验方法、实际应用进行介绍,着重比较几种主流CLIP技术的异同,并对如何选择具体的技术路线提出建议。 展开更多
关键词 紫外交联免疫沉淀 高通量测序 rna结合蛋白
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基于RIP-Seq技术检测MRTF-A结合RNA在小鼠MCAO/R模型中表达 被引量：1
3
作者 于志君 袁琼 +5 位作者 金志刚 向梓非 龙萍 朱明 杨越旺 胡霞敏 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期765-772,共8页
目的应用RIP-Seq测序技术检测小鼠MCAO/R模型中心肌素相关转录因子A(MRTF-A)结合RNA的表达差异,探讨MRTF-A潜在的作用机制。方法将C57BL/6小鼠随机分成假手术组及I/R组,线栓法构建MCAO模型,再灌注24 h后,提取脑组织总蛋白,利用MRTF-A抗... 目的应用RIP-Seq测序技术检测小鼠MCAO/R模型中心肌素相关转录因子A(MRTF-A)结合RNA的表达差异,探讨MRTF-A潜在的作用机制。方法将C57BL/6小鼠随机分成假手术组及I/R组,线栓法构建MCAO模型,再灌注24 h后,提取脑组织总蛋白,利用MRTF-A抗体免疫共沉淀后,进行RNA高通量测序,获得MRTF-A结合RNA的表达谱,继而对差异RNA进行GO、KEGG分析。结果与假手术组相比,I/R组有429个RNA发生差异表达(上调203,下调226),并且在功能元件和染色体分布上均具有显著差异。GO分子功能分析显示,差异表达RNA主要富集RNA结合、Poly(A)RNA结合等注释。KEGG通路分析显示10条通路被显著富集,其中雌激素信号通路富集最显著。结论在脑I/R损伤时MRTF-A结合RNA表达谱发生差异改变,为深入探讨MRTF-A的分子机制提供理论依据。 展开更多
关键词 心肌素相关转录因子A rna结合蛋白免疫共沉淀-高通量测序 脑缺血再灌注损伤 差异基因分析
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RNA结合蛋白与RNA相互作用鉴定技术 被引量：6
4
作者 陈伟 许馨 孙绍光 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期103-107,共5页
RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)通过与RNA相互作用,广泛参与到RNA的剪切、转运、编辑、胞内定位及翻译调控等过程中。RNA领域尤其是非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)研究的快速发展,催生了多种RBPs-RNAs相互作用鉴定技术。这... RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)通过与RNA相互作用,广泛参与到RNA的剪切、转运、编辑、胞内定位及翻译调控等过程中。RNA领域尤其是非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)研究的快速发展,催生了多种RBPs-RNAs相互作用鉴定技术。这些技术反之又推动了RNA领域的研究进程。本文对紫外交联免疫沉淀(ultraviolet crosslinking and immunoprecipitation,CLIP),CLIP cDNA文库高通量测序(high-throughput sequencing of CLIP cDNA library,HITS-CLIP),光活化核苷增强的CLIP(photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation,PAR-CLIP),单核苷酸分离CLIP(individual nucleotide resolution CLIP,i CLIP),TRIBE(targets of RNA-binding protein identified by editing),RNA标记,相互作用组捕获(interactome capture,IC)和Ser IC(serial RNA interactome capture)等RBPs-RNAs相互作用鉴定技术的基本原理和优缺点以及应用进行综述。 展开更多
关键词 rna结合蛋白 紫外交联免疫沉淀 CLIP cDNA文库高通量测序 光活化核苷增强的CLIP rna结合蛋白免疫沉淀微阵列 TRIBE rna标记 相互作用组捕获
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RNA结合蛋白的CLIP-seq数据的生物信息学分析流程建立及初步应用 被引量：2
5
作者 谢正尧 臧敏 +1 位作者 李鑫 徐宇君 《中国科学：生命科学》 CSCD 北大核心 2021年第4期450-461,共12页
近年来,紫外交联免疫沉淀结合高通量测序(UV cross-linking immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing, CLIP-seq)成为鉴定RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBP)的靶标序列和结合位点的新技术,为研究RNA结合蛋白... 近年来,紫外交联免疫沉淀结合高通量测序(UV cross-linking immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing, CLIP-seq)成为鉴定RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBP)的靶标序列和结合位点的新技术,为研究RNA结合蛋白功能、解析其分子机制提供了强有力的工具.尽管国际上已有应用CLIP技术的报道,但是实验方法周期长、技术性强,尤其是后续的数据处理和生物信息学分析令没有计算机基础和专职生物信息分析人员的实验室望而却步.基于2016年Van Nostrand等人优化的CLIP方法,本团队建立并完成了多个RBP在组织和细胞中的CLIP测序及数据的生物信息学分析流程,并验证了其可行性.本研究整合了多家实验室已公开发表的分析软件和脚本,对人前列腺癌DU145细胞系中的PUMILIO1(PUM1)蛋白CLIP-seq数据进行分析,总结出对于蛋白功能分析更有效的命令和参数,并建立了完整的生物信息学分析流程.运用该流程寻找PUM1蛋白在人前列腺癌发展中的潜在机制,本团队识别出PUM1在DU145细胞系中的1189个靶标,并发现PUM1主要结合其靶标mRNA的3′非翻译区(untranslated region, UTR)和转录终止位点(transcription termination sites, TTS)区域, UGUAHAUA(H代表A/U/C)基序(motif)为PUM1蛋白识别的特征性序列. PUM1可能通过结合靶标mRNA的3′UTR对靶标进行转录后调控,参与癌细胞的生长、分化等过程以及相关的癌症通路中.本团队还发现, PUM1在人前列腺癌细胞系中能够与其他物种或组织中类似的靶标结合,并且结合方式高度一致,这与该家族蛋白在RNA结合功能域和功能上的高度保守性相符合.因此,本文报道的技术方法和生物信息学分析流程可以为有兴趣开展RBP的靶标鉴定的研究人员提供一个一站式的方法学服务平台,也有助于推动转录后调控在疾病和发育中的机制研究和RBP的RNA调控等新兴领域的发展. 展开更多
关键词 rna结合蛋白 紫外交联免疫沉淀 高通量测序 生物信息学 PUM1 前列腺癌 3′UTR
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非编码RNA研究技术概述
6
作者 苟兰涛 刘默芳 付向东 《生命科学》 CSCD 2014年第3期202-206,共5页
非编码RNA是当前生命科学研究领域的前沿热点。系统地研究生物体内非编码RNA的起源、结构、功能和作用机制,有助于我们更加全面、深入地了解基因表达调控机理及生物体的生命活动,而科学问题的解答依赖于实验技术和实验方法的创新和革命... 非编码RNA是当前生命科学研究领域的前沿热点。系统地研究生物体内非编码RNA的起源、结构、功能和作用机制,有助于我们更加全面、深入地了解基因表达调控机理及生物体的生命活动,而科学问题的解答依赖于实验技术和实验方法的创新和革命。本文按不同的实验目的和研究内容,就当前非编码RNA领域内主要的研究策略和方法技术作一简述。 展开更多
关键词 非编码rna 交联 免疫沉淀 高通量测序 rna结合蛋白中国
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