目的·分析癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)家族成员SPANXB(sperm protein associated with the nucleus on the X chromosome B)在肝癌中的表达及其与肝癌患者预后之间的相关性,并探究SPANXB对肝癌细胞增殖的影响及其潜在...目的·分析癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)家族成员SPANXB(sperm protein associated with the nucleus on the X chromosome B)在肝癌中的表达及其与肝癌患者预后之间的相关性,并探究SPANXB对肝癌细胞增殖的影响及其潜在机制。方法·利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中的肝癌样本数据,分析SPANXB在肝癌组织中的表达及其与患者生存期的相关性。构建稳定敲低SPANXB与稳定过表达SPANXB的肝癌细胞系,利用活细胞成像实验、EdU细胞增殖实验和平板克隆形成实验评估SPANXB对肝癌细胞增殖的影响。通过RNA测序(RNA-sequence,RNA-seq)探究SPANXB调控肝癌细胞增殖的相关通路,并利用细胞周期实验验证SPANXB对肝癌细胞周期的影响。采用免疫沉淀-质谱联用技术(immunoprecipitation-mass spectrometry,IP-MS)探索与SPANXB相互作用的蛋白,并使用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)进行验证。结果·SPANXB mRNA在肝癌组织中的表达高于正常组织(P=0.003),且与肝癌患者的生存期呈负相关。稳定敲低SPANXB可降低肝癌细胞的增殖能力、克隆形成能力,而稳定过表达SPANXB则可促进这些过程。RNA-seq的结果显示,SPANXB的敲低可下调DNA复制与G1/S细胞周期转换相关通路,细胞周期实验的结果显示SPANXB的敲低可导致肝癌细胞周期发生改变。IP-MS和Co-IP结果显示,SPAXNB与有丝分裂停滞缺陷2样蛋白1(mitotic arrest deficient 2-like protein 1,MAD2L1)、WD重复域蛋白5(WD repeat domain 5,WDR5)等细胞周期相关蛋白存在相互作用。结论·SPANXB的高表达与肝癌的预后呈负相关,其可能通过与MAD2L1、WDR5相互作用调控细胞周期并增强肝癌细胞的增殖活性。展开更多
目的:探索瘤胃球菌(R.gnavus)对慢性肾脏病(CKD)及其肠源性毒素硫酸对甲酚(pCS)清除的影响。方法:收集40例腹膜透析(PD)患者的粪便样本进行16 s rRNA测序,并根据血清pCS浓度中位数将患者分为两组,利用线性判别分析和共现性网络分析确定...目的:探索瘤胃球菌(R.gnavus)对慢性肾脏病(CKD)及其肠源性毒素硫酸对甲酚(pCS)清除的影响。方法:收集40例腹膜透析(PD)患者的粪便样本进行16 s rRNA测序,并根据血清pCS浓度中位数将患者分为两组,利用线性判别分析和共现性网络分析确定低pCS组的关键菌属R.gnavus。将20只C57BL/6小鼠随机分为四组:正常对照(CN)组、CKD组、R.gnavus+CKD组、CN粪便+CKD组,通过四联抗生素及腺嘌呤饮食建立伪无菌CKD小鼠模型。采用qRT-PCR检测粪便中R.gnavus相对丰度及肾组织中转运蛋白以及炎症因子表达的水平;通过ELISA检测血清尿素氮与肌酐水平,采用HE、Masson染色观察肾脏病理损伤;采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测血清pCS水平。结果:在PD患者中,R.gnavus与血清pCS水平呈负相关,且为低pCS组的关键菌属。在腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型中,给予R.gnavus可显著改善肾功能(P<0.05),减轻肾脏纤维化(P<0.05),降低肾脏与结肠中炎症因子表达(P<0.05),显著上调肾脏转运蛋白有机阴离子转运体3(OAT3)、多药耐药相关蛋白4(MRP4)、ATP结合转运蛋白G亚家族成员2(ABCG2)的表达,并显著降低血清pCS浓度(P<0.05)。结论:R.gnavus定植可促进pCS的清除并减缓CKD进展。展开更多
目的·利用负染电镜技术分析人源核小体重塑及组蛋白去乙酰化酶复合物(nucleosome remodeling and deacetylase complex,NuRD复合物)结构,获得人源NuRD复合物的轮廓信息。方法·将C端带有3×Flag标签的MBD3(methyl-CpG bind...目的·利用负染电镜技术分析人源核小体重塑及组蛋白去乙酰化酶复合物(nucleosome remodeling and deacetylase complex,NuRD复合物)结构,获得人源NuRD复合物的轮廓信息。方法·将C端带有3×Flag标签的MBD3(methyl-CpG binding domain protein 3)和N端带有10×His标签的GATAD2A(GATA zinc finger domain containing 2A)克隆至pMLink表达载体中,采用聚乙烯亚胺瞬时转染过表达的方式在人源Expi293F悬浮细胞里表达NuRD复合物中的蛋白质组分;依次通过Ni-NTA亲和层析、Flag(DYKDDDDK)标签亲和层析和Superose 6 Increase 5/150凝胶过滤层析分离纯化NuRD复合物;利用蛋白质印迹法(Western blotting)和液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)对复合物进行组分鉴定;利用负染电镜技术结合单颗粒重构技术研究NuRD复合物的空间结构;通过UCSF Chimera软件将蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)中已有亚复合物的原子结构模型(7AO9,5FXY)与生成的结构模型进行自动匹配及比对,预测多个蛋白组分在负染结构模型中的定位。结果·利用两步亲和层析,成功富集了带有纯化标签的MBD3、GATAD2A蛋白及其他内源蛋白组分,通过进一步的凝胶过滤层析分离得到了均一性良好的复合物;通过Western blotting和LC-MS/MS鉴定,确认纯化得到的复合物为组分完整的人源NuRD复合物。利用负染电镜技术及单颗粒重构技术初步解析了NuRD复合物的空间结构,其整体轮廓特征明显,呈现为不对称的长条形;通过进一步的三维优化处理,最终获得了人源NuRD复合物分辨率约为17A(1A=0.1 nm)的初步三维结构模型;已有的亚复合物原子结构模型(PDB:7AO9,5FXY)与NuRD复合物的初步三维结构模型自动匹配后,初步确定了MTA1/2/3(metastasis-associated protein 1/2/3)、HDAC1/2(histone deacetylase 1/2)、RBBP4/7(retinoblastoma-binding protein 4/7)及MBD2/3(methyl-CpG-binding domain protein 2/3)蛋白亚基在NuRD复合物负染结构模型中的定位。结论·利用单颗粒重构技术搭建了人源NuRD复合物的低分辨率负染结构模型。展开更多
文摘目的·分析癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)家族成员SPANXB(sperm protein associated with the nucleus on the X chromosome B)在肝癌中的表达及其与肝癌患者预后之间的相关性,并探究SPANXB对肝癌细胞增殖的影响及其潜在机制。方法·利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中的肝癌样本数据,分析SPANXB在肝癌组织中的表达及其与患者生存期的相关性。构建稳定敲低SPANXB与稳定过表达SPANXB的肝癌细胞系,利用活细胞成像实验、EdU细胞增殖实验和平板克隆形成实验评估SPANXB对肝癌细胞增殖的影响。通过RNA测序(RNA-sequence,RNA-seq)探究SPANXB调控肝癌细胞增殖的相关通路,并利用细胞周期实验验证SPANXB对肝癌细胞周期的影响。采用免疫沉淀-质谱联用技术(immunoprecipitation-mass spectrometry,IP-MS)探索与SPANXB相互作用的蛋白,并使用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)进行验证。结果·SPANXB mRNA在肝癌组织中的表达高于正常组织(P=0.003),且与肝癌患者的生存期呈负相关。稳定敲低SPANXB可降低肝癌细胞的增殖能力、克隆形成能力,而稳定过表达SPANXB则可促进这些过程。RNA-seq的结果显示,SPANXB的敲低可下调DNA复制与G1/S细胞周期转换相关通路,细胞周期实验的结果显示SPANXB的敲低可导致肝癌细胞周期发生改变。IP-MS和Co-IP结果显示,SPAXNB与有丝分裂停滞缺陷2样蛋白1(mitotic arrest deficient 2-like protein 1,MAD2L1)、WD重复域蛋白5(WD repeat domain 5,WDR5)等细胞周期相关蛋白存在相互作用。结论·SPANXB的高表达与肝癌的预后呈负相关,其可能通过与MAD2L1、WDR5相互作用调控细胞周期并增强肝癌细胞的增殖活性。
文摘目的:探索瘤胃球菌(R.gnavus)对慢性肾脏病(CKD)及其肠源性毒素硫酸对甲酚(pCS)清除的影响。方法:收集40例腹膜透析(PD)患者的粪便样本进行16 s rRNA测序,并根据血清pCS浓度中位数将患者分为两组,利用线性判别分析和共现性网络分析确定低pCS组的关键菌属R.gnavus。将20只C57BL/6小鼠随机分为四组:正常对照(CN)组、CKD组、R.gnavus+CKD组、CN粪便+CKD组,通过四联抗生素及腺嘌呤饮食建立伪无菌CKD小鼠模型。采用qRT-PCR检测粪便中R.gnavus相对丰度及肾组织中转运蛋白以及炎症因子表达的水平;通过ELISA检测血清尿素氮与肌酐水平,采用HE、Masson染色观察肾脏病理损伤;采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测血清pCS水平。结果:在PD患者中,R.gnavus与血清pCS水平呈负相关,且为低pCS组的关键菌属。在腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型中,给予R.gnavus可显著改善肾功能(P<0.05),减轻肾脏纤维化(P<0.05),降低肾脏与结肠中炎症因子表达(P<0.05),显著上调肾脏转运蛋白有机阴离子转运体3(OAT3)、多药耐药相关蛋白4(MRP4)、ATP结合转运蛋白G亚家族成员2(ABCG2)的表达,并显著降低血清pCS浓度(P<0.05)。结论:R.gnavus定植可促进pCS的清除并减缓CKD进展。
文摘目的·利用负染电镜技术分析人源核小体重塑及组蛋白去乙酰化酶复合物(nucleosome remodeling and deacetylase complex,NuRD复合物)结构,获得人源NuRD复合物的轮廓信息。方法·将C端带有3×Flag标签的MBD3(methyl-CpG binding domain protein 3)和N端带有10×His标签的GATAD2A(GATA zinc finger domain containing 2A)克隆至pMLink表达载体中,采用聚乙烯亚胺瞬时转染过表达的方式在人源Expi293F悬浮细胞里表达NuRD复合物中的蛋白质组分;依次通过Ni-NTA亲和层析、Flag(DYKDDDDK)标签亲和层析和Superose 6 Increase 5/150凝胶过滤层析分离纯化NuRD复合物;利用蛋白质印迹法(Western blotting)和液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)对复合物进行组分鉴定;利用负染电镜技术结合单颗粒重构技术研究NuRD复合物的空间结构;通过UCSF Chimera软件将蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)中已有亚复合物的原子结构模型(7AO9,5FXY)与生成的结构模型进行自动匹配及比对,预测多个蛋白组分在负染结构模型中的定位。结果·利用两步亲和层析,成功富集了带有纯化标签的MBD3、GATAD2A蛋白及其他内源蛋白组分,通过进一步的凝胶过滤层析分离得到了均一性良好的复合物;通过Western blotting和LC-MS/MS鉴定,确认纯化得到的复合物为组分完整的人源NuRD复合物。利用负染电镜技术及单颗粒重构技术初步解析了NuRD复合物的空间结构,其整体轮廓特征明显,呈现为不对称的长条形;通过进一步的三维优化处理,最终获得了人源NuRD复合物分辨率约为17A(1A=0.1 nm)的初步三维结构模型;已有的亚复合物原子结构模型(PDB:7AO9,5FXY)与NuRD复合物的初步三维结构模型自动匹配后,初步确定了MTA1/2/3(metastasis-associated protein 1/2/3)、HDAC1/2(histone deacetylase 1/2)、RBBP4/7(retinoblastoma-binding protein 4/7)及MBD2/3(methyl-CpG-binding domain protein 2/3)蛋白亚基在NuRD复合物负染结构模型中的定位。结论·利用单颗粒重构技术搭建了人源NuRD复合物的低分辨率负染结构模型。
