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抗鸡传染性法氏囊病病毒单链抗体库的构建及其中和抗体的筛选 被引量：4
1
作者 周兵 李天鹤 +10 位作者 李宁 徐黎明 郭茉 马蕾 张瑛杰 叶贤龙 赵景壮 衣春霖 韩晓辉 丁良君 李德山 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期227-231,共5页
为构建抗鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）的细菌展示单链抗体（scFv）库并筛选出具有高亲和力和中和活性的scFv。本研究从IBDV免疫鸡的法氏囊提取总RNA，采用RT-PCR的方法分别扩增鸡抗体的VH和VL编码序列，插入含有（Gly4Ser）3 linker的p... 为构建抗鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）的细菌展示单链抗体（scFv）库并筛选出具有高亲和力和中和活性的scFv。本研究从IBDV免疫鸡的法氏囊提取总RNA，采用RT-PCR的方法分别扩增鸡抗体的VH和VL编码序列，插入含有（Gly4Ser）3 linker的pTlinker载体中，再将VH-linker-VL片段亚克隆到细菌展示载体pBSD中。以FITC标记的VP2 蛋白为诱饵，通过流式细胞术筛选出5株阳性scFv，其氨基酸同源性为82.16 %～87.27 %。将5株scFv基因分别插入原核表达载体pET-27b（＋）中，构建重组表达质粒pET-IBDV-scFv。将其转化大肠杆菌Rosetta进行诱导和表达，该5株scFv相对分子质量均约为28 ku。此外，利用纯化的scFv包被于ELISA检测板中作为扑捉抗体，检测结果显示scFv对VP2蛋白和不同IBDV株均具有特异性结合能力。而且通过体外中和试验结果表明，仅有一株scFv具有病毒中和活性，可以有效阻断IBDV（B87 株）对鸡胚成纤维细胞（DF1）的感染。该研究结果为进一步研制IBDV治疗性抗体奠定了基础。 展开更多
关键词 IBDV 细菌展示 单链抗体 中和活性
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表达鸡IL2和IL15重组新城疫病毒的免疫增强作用研究 被引量：1
2
作者 张天援 吕政 +8 位作者 王卉 朱升龙 刘云野 孙田 尹杰超 吴云舟 吴金 任桂萍 李德山 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期971-974,共4页
为提高新城疫病毒(NDV)弱毒疫苗的免疫保护效果,本研究选取鸡IL2(chIL2)和chIL15两个细胞因子作为分子佐剂,通过反向遗传操作技术分别将这两个基因克隆于NDV Clone30株中,构建表达chIL2和chIL15的重组病毒rClone30-chIL2和rClone30-ch I... 为提高新城疫病毒(NDV)弱毒疫苗的免疫保护效果,本研究选取鸡IL2(chIL2)和chIL15两个细胞因子作为分子佐剂,通过反向遗传操作技术分别将这两个基因克隆于NDV Clone30株中,构建表达chIL2和chIL15的重组病毒rClone30-chIL2和rClone30-ch IL15。ELISA法检测结果表明两种细胞因子在重组病毒中均能够稳定表达。将重组病毒免疫雏鸡,以NDV强毒BJ株进行攻毒试验,测定其抗体产生情况和保护效果。结果表明,两种重组病毒均可以诱导雏鸡产生较高水平抗体;而且两种重组病毒保护率可达100%,具有较好的保护效果。本研究为进一步提高NDV重组基因工程疫苗的效果提供了新思路。 展开更多
关键词 鸡IL2 鸡IL15 反向遗传操作技术 新城疫病毒
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利用SUMO表达系统高效可溶性表达鸡传染性法氏囊病病毒VP3基因 被引量：5
3
作者 曲栗 尹杰超 +7 位作者 李宁 刘生伟 傅俊华 姚文兵 谷学佳 郝建权 任桂萍 李德山 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期199-202,共4页
为评价SUMO原核表达系统(pHisSUMO Express)对病毒基因的可溶性表达,本研究从人工接种发病的鸡传染性法氏囊病(IBD)的病料组织样品中提取总RNA,通过RT-PCR扩增IBD病毒(IBDV)VP3基因,并将其克隆于pHisSUMO中构建了重组表达质粒pHisSUMO-V... 为评价SUMO原核表达系统(pHisSUMO Express)对病毒基因的可溶性表达,本研究从人工接种发病的鸡传染性法氏囊病(IBD)的病料组织样品中提取总RNA,通过RT-PCR扩增IBD病毒(IBDV)VP3基因,并将其克隆于pHisSUMO中构建了重组表达质粒pHisSUMO-VP3,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)PlysS,经IPTG诱导,得到可溶性表达的融合蛋白SUMO-VP3。结果表明,该融合蛋白表达量占细菌总蛋白35%,经HisTrapTMFF crude column层析柱纯化后的SUMO-VP3蛋白可被SUMO蛋白酶Ⅰ有效切割,获得无标签的VP3蛋白,经western blot鉴定表明该VP3蛋白具有良好的抗原性。本研究表明pHisSUMO Express表达系统是高效可溶表达外源蛋白的有效工具,所表达的病毒蛋白具有良好的抗原性,为病原诊断抗原的研究和制备提供有效表达系统。 展开更多
关键词 SUMO 高效可溶表达 鸡传染性法氏囊病病毒 VP3基因
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利用细菌展示技术系统地筛选猪圆环病毒2型衣壳蛋白的线性抗原区域 被引量：4
4
作者 徐文娟 张瑛杰 +6 位作者 李青青 吴强 于向纺 郭笑辰 尹杰超 任桂萍 李德山 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期398-402,共5页
为了系统的筛选位于猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白上的抗原优势区域,本研究将缺少N端核定位信号的Cap蛋白基因分成7个连续重叠的DNA片段cap（1~7）,然后分别克隆于细菌展示载体APEx中,IPTG诱导重组蛋白片段表达于细菌内膜外侧,采用流式... 为了系统的筛选位于猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白上的抗原优势区域,本研究将缺少N端核定位信号的Cap蛋白基因分成7个连续重叠的DNA片段cap（1~7）,然后分别克隆于细菌展示载体APEx中,IPTG诱导重组蛋白片段表达于细菌内膜外侧,采用流式细胞仪检测各片段和抗PCV2 Cap蛋白的多克隆抗体的结合能力。结果表明,cap（1~7）均可以和抗该Cap蛋白的多抗结合,并且cap6的结合能力最强。将cap6片段进一步分为连续不重叠的3段（cap6-1、cap6-2、cap6-3）,以同样的方法鉴定抗原表位。结果显示,cap6-2与抗PCV2 Cap蛋白的多抗结合能力最强。此外,应用western blot的方法对细菌展示结果进行了验证。本研究利用细菌展示技术以及流式细胞仪快速的筛选了PCV2b Cap蛋白上的抗原优势区域,cap（1~7）片段均包含抗原表位,并且cap6是Cap蛋白上的抗原优势区域,cap6-2可能是抗原优势表位。 展开更多
关键词 猪圆环病毒 CAP蛋白 多克隆抗体 结合能力 抗原表位
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鞭毛蛋白及鸡GM-CSF重组新城疫病毒对鸡的免疫增强作用 被引量：1
5
作者 王卉 张天援 +7 位作者 吕政 孙田 尹杰超 吴云舟 刘云野 吴金 任桂萍 李德山 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期40-43,共4页
为评价鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(FliC)以及鸡GM-CSF(chGM-CSF)对新城疫病毒(NDV)弱毒疫苗的免疫增强效果,本实验通过PCR扩增fliC,并合成chGM-CSF编码基因,分别构建重组质粒pBrClone30-fliC和pBrClone30-GM-CSF,拯救获得重组病毒rClone30-... 为评价鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(FliC)以及鸡GM-CSF(chGM-CSF)对新城疫病毒(NDV)弱毒疫苗的免疫增强效果,本实验通过PCR扩增fliC,并合成chGM-CSF编码基因,分别构建重组质粒pBrClone30-fliC和pBrClone30-GM-CSF,拯救获得重组病毒rClone30-fliC和rClone30-GM-CSF。RT-PCR和ELISA检测结果表明:fliC和chGM-CSF基因正确插入重组病毒,并获得稳定表达;重组病毒免疫7 d后重组NDV HI抗体效价检测显示,实验组平均HI效价分别达到4.5 log2和4.8 log2,而r Clone30组和空白组HI效价仅为3 log2和1 log2;免疫7 d后攻毒,空白组SPF鸡均死亡,rClone30组有两例发病,实验组SPF鸡全部存活并且无任何临床症状。本研究结果表明,FliC和chGM-CSF作为佐剂能够有效提高弱毒疫苗的免疫效果。 展开更多
关键词 鞭毛蛋白 鸡GM-CSF 新城疫病毒 反向遗传操作技术
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表达抗鸡传染性法氏囊病病毒重组鸡源抗体CHO细胞的悬浮驯化
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作者 曹宏雪 郭笑辰 +8 位作者 李婷婷 张胜奇 张瑛杰 刘鑫 任桂萍 尹杰超 Lubna Muhi Rasoul 荆燕 李德山 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期68-72,共5页
为将贴壁生长的表达抗鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)重组鸡源抗体的CHO细胞株驯化为在无血清培养基中悬浮生长、高产的工程细胞株,本研究利用流式细胞仪筛选得到高产贴壁细胞株;以快速降低血清法进行驯化,使其适应悬浮培养,经过摇瓶无血... 为将贴壁生长的表达抗鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)重组鸡源抗体的CHO细胞株驯化为在无血清培养基中悬浮生长、高产的工程细胞株,本研究利用流式细胞仪筛选得到高产贴壁细胞株;以快速降低血清法进行驯化,使其适应悬浮培养,经过摇瓶无血清培养扩增,持续监测葡萄糖消耗情况,最终检测抗IBDV抗体的表达量。结果显示,悬浮驯化培养的CHO细胞能够在无血清培养基中稳定生长,生产周期短,接种密度为4.8×10~5cells/m L,无血清单细胞悬浮培养120 h后最大活细胞密度可达6.0×10~6 cells/m L,相同体积下抗体表达量较贴壁生长的高3倍,平均每个细胞每24 h表达量达到15 pg^20 pg。以上结果表明,贴壁生长的CHO细胞经过悬浮适应,不仅可以在无血清培养条件下快速生长,而且细胞对葡萄糖的利用率高,抗体表达量高。本研究筛选获得的细胞株节省了工艺生产中原料成本,操作方便,减少污染,易于放大,为工业化大批量生产奠定了基础。 展开更多
关键词 传染性法氏囊病病毒 悬浮驯化 CHO 鸡源抗体
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