结核病免疫机制及疫苗研究进展 被引量：9

1

作者 达泽蛟 祝秉东 张颖 《微生物与感染》 2011年第3期169-178,共10页

结核病是一种棘手的重大传染病。虽然存在一些有一定疗效的治疗药物,亦有预防性疫苗———卡介苗(BCG);但结核病仍在世界范围流行,且发病率和病死率居高不下。结核病的免疫病理机制及疫苗研究近年来取得了一定的进展。结核分枝杆菌通过T... 结核病是一种棘手的重大传染病。虽然存在一些有一定疗效的治疗药物,亦有预防性疫苗———卡介苗(BCG);但结核病仍在世界范围流行,且发病率和病死率居高不下。结核病的免疫病理机制及疫苗研究近年来取得了一定的进展。结核分枝杆菌通过Toll样受体(TLR)等模式识别受体,激活巨噬细胞的天然免疫反应,清除细菌和调节获得性免疫反应。包括主要组织相容性复合物(MHC)限制的CD4+和CD8+T细胞,以及CD1限制的T细胞和γδT细胞参与抗结核获得性免疫反应,其中记忆性T细胞与调节性T细胞具有重要的免疫调节作用。但是,人们对结核病发生机制的认识仍然不足,限制了对结核病治疗药物和新型疫苗的研发。由于BCG对成人缺乏有效的保护力,故研制新型的结核疫苗是预防结核病的当务之急。当前处于实验阶段的候选疫苗包括重组BCG、减毒结核分枝杆菌和可用于加强BCG的亚单位疫苗,后者又包括痘苗病毒载体疫苗、核酸疫苗、新型佐剂辅助的蛋白疫苗。目前可行的疫苗免疫策略主要是使用BCG或其他疫苗初次免疫,然后选择亚单位疫苗加强免疫。然而,疫苗的免疫策略、免疫剂量、免疫途径、强化免疫次数和免疫时机都有待研究。反映疫苗保护力的免疫指标不明确、很难确定哪类疫苗进入临床试验、缺乏临床试验场地、疫苗效果评价需要很长时间及耗资巨大,增加了结核疫苗研究的难度和风险。 展开更多

关键词 结核病 免疫学 疫苗

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结核分枝杆菌ESAT6-RpfE亚单位疫苗的构建与免疫原性研究 被引量：3

2

作者 李志 达泽蛟 +5 位作者 章国平 李瑞营 刘万波 苏娟 张颖 祝秉东 《中国防痨杂志》 CAS 2012年第3期154-160,共7页

目的构建Mtb ESAT6-RpfE(早期分泌抗原靶6-复活促进因子E)的原核表达载体,表达和纯化融合蛋白,并对其免疫原性进行研究。方法分别以Mtb H37Rv及临床株的基因组为模板,PCR扩增esat6、rpfE基因,依次插入pET30a质粒并在大肠埃希菌BL21中表... 目的构建Mtb ESAT6-RpfE(早期分泌抗原靶6-复活促进因子E)的原核表达载体,表达和纯化融合蛋白,并对其免疫原性进行研究。方法分别以Mtb H37Rv及临床株的基因组为模板,PCR扩增esat6、rpfE基因,依次插入pET30a质粒并在大肠埃希菌BL21中表达纯化ESAT6-RpfE蛋白。采用完全随机的方法将C57BL/6小鼠分组,每组6只,共进行了两次实验,第一次实验分为ESAT6、RpfE、ESAT6-RpfE、PBS、BCG五组,佐剂为二甲基三十六烷基胺(dimethyl-dioctyldecyl ammonium bromide,DDA);第二次实验有ESAT6-RpfE、PBS、BCG三组,佐剂为DPG[DDA+poly(I:C)+明胶]。分别于0、3、6周皮下免疫C57BL/6小鼠。末次免疫8周后,用特异性抗原ESAT6及RpfE刺激,检测其分泌IFN-γ的水平;ELISA检测血清特异性抗体IgG2b、IgG1。结果PCR扩增的esat6、rpfE基因序列与GenBank报道一致;融合蛋白主要以包涵体形式表达;亚单位疫苗免疫动物能够分泌RpfE特异性IFN-γ的脾淋巴细胞数量[(427.13±100.46)]显著高于PBS组(26.13±22.34;q=7.924,P<0.001);分泌ESAT6刺激特异性IFN-γ的脾淋巴细胞数量[(506.50±140.40)]明显高于PBS组(19.25±14.75;q=11.36,P<0.001)和BCG组(125.5±46.41;q=8.882,P<0.001)。ESAT6-RpfE免疫组能诱导产生特异性抗体。结论成功构建并表达ESAT6-RpfE融合蛋白。此融合蛋白可在C57BL/6小鼠中诱导抗原特异性的免疫应答,可作为新型结核亚单位疫苗的候选疫苗予以进一步研究。 展开更多

关键词 疫苗 亚单位 重组融合蛋白质类 细菌蛋白质类 细胞因子类 免疫活性

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分枝杆菌脂质组分加强结核分枝杆菌亚单位疫苗效应的初步研究 被引量：4

3

作者 何珊珊 何娟娟 +3 位作者 刘勋 孔祥熙 谭继英 祝秉东 《微生物与感染》 2015年第4期228-234,共7页

分枝杆菌细胞壁含丰富的脂质组分,其中一些具有抗原性,或具有重要的免疫调节作用。为探讨这些脂质组分在结核分枝杆菌亚单位疫苗中的作用,研发有效疫苗,本研究对卡介苗(BCG)细胞壁总脂成分进行萃取,用硅胶柱色谱法将其分离为非极性脂、... 分枝杆菌细胞壁含丰富的脂质组分,其中一些具有抗原性,或具有重要的免疫调节作用。为探讨这些脂质组分在结核分枝杆菌亚单位疫苗中的作用,研发有效疫苗,本研究对卡介苗(BCG)细胞壁总脂成分进行萃取,用硅胶柱色谱法将其分离为非极性脂、中间极性脂和极性脂,检测各类脂质组分在人群中的免疫原性,并将总脂和各类脂质组分分别与佐剂二甲基三十六烷基铵(DDA)和Poly(I∶C)混合,进一步与结核分枝杆菌融合蛋白LT70(ESAT6-Ag85B-MPT64<190-198>-Mtb8.4-Rv2626c)混合,构建含脂质的结核分枝杆菌亚单位疫苗。在小鼠BCG攻击模型中进行保护效率评价,包括BCG初免后含脂质亚单位疫苗的强化免疫保护效率评价。结果显示,结核病患者脂质特异性抗体IgG高于健康人群(P<0.05)。在小鼠BCG攻击模型免疫保护效果评价中,含脂质亚单位疫苗LT70-总脂组小鼠肺部的荷菌数显著低于BCG组(P<0.05)。在BCG初免-含脂质亚单位疫苗加强免疫策略中,LT70-总脂和LT70-中间极性脂组小鼠肺部荷菌数均低于BCG组(P<0.01)和LT70组(P<0.05)。研究表明,分枝杆菌脂质成分具有较强的免疫原性,与亚单位疫苗联合使用能增强亚单位疫苗的抗结核分枝杆菌效果。其中,中间极性脂类强化作用明显,值得深入研究。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 亚单位疫苗 卡介苗 细胞壁 脂质

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分枝杆菌所致家兔皮肤液化病理模型研究 被引量：9

4

作者 王明珠 史大中 +3 位作者 杨爱军 焦志刚 祝秉东 张颖 《微生物与感染》 2008年第4期208-211,218,共5页

目的建立卡介苗(BCG)、H37Ra和耻垢分枝杆菌感染的新西兰兔皮肤模型,为肺结核干酪样坏死和继而发生的液化提供研究模型。方法新西兰兔皮内分别注射BCG、H37Ra和耻垢分枝杆菌的5×106CFU、5×104CFU、5×102CFU/ml菌液,6周... 目的建立卡介苗(BCG)、H37Ra和耻垢分枝杆菌感染的新西兰兔皮肤模型,为肺结核干酪样坏死和继而发生的液化提供研究模型。方法新西兰兔皮内分别注射BCG、H37Ra和耻垢分枝杆菌的5×106CFU、5×104CFU、5×102CFU/ml菌液,6周后在病灶周围再次以相同剂量皮内注射,14d后病变明显时取材,制作切片,行HE染色,显微镜下观察。结果新西兰兔分别经皮内接种BCG、H37Ra或耻垢分枝杆菌后,高剂量组观察到明显的炎症反应和脓肿液化、破溃等改变。再次免疫可观察到郭霍现象。引起病变的严重程度依次为BCG强于H37Ra,后者又强于耻垢分枝杆菌。显微改变可具典型的结核结节样病灶。皮肤模型处取材,行细菌抗酸染色,结果阳性。BCG中、低剂量组再次免疫可诱导小结节样病变,但不发生液化溃疡,其余中剂量组及低剂量组没有观察到明显改变。结论BCG、H37Ra和耻垢分枝杆菌均可引起皮肤干酪样坏死和液化,病理损伤与感染细菌剂量密切相关,5×106CFU/ml浓度的分枝杆菌可有效诱导液化和坏死,其中BCG引起的病理改变最明显。 展开更多

关键词 结核病 分枝杆菌 病理 新西兰兔 动物模型

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结核分枝杆菌培养滤液蛋白21(CFP21)的基因克隆、表达及纯化 被引量：1

5

作者 谢富佳 谭继英兰州大学结核病研究中心 +5 位作者 梁正羽 乔梅 祝秉东 吴玉敏 杨燕 章国平 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期117-119,共3页

目的构建结核分枝杆菌培养滤液蛋白21(Culture filtrate protein 21,CFP21)原核表达载体,获得CFP21蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,PCR扩增cfp21基因,质粒PET28a(+)为表达载体,构建PET28a(+)/cfp21质粒,转化入大肠埃希... 目的构建结核分枝杆菌培养滤液蛋白21(Culture filtrate protein 21,CFP21)原核表达载体,获得CFP21蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,PCR扩增cfp21基因,质粒PET28a(+)为表达载体,构建PET28a(+)/cfp21质粒,转化入大肠埃希菌DH5α中,抽提质粒,PCR扩增,测序,转化到大肠埃希菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,并用His Bind蛋白纯化试剂盒纯化CFP21。结果构建、表达和纯化了CFP21,分子量约为24kD,主要以包涵体形式存在。结论目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,纯化得到CFP21蛋白,为CFP21的进一步研究奠定基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 CFP21 基因克隆 蛋白表达 纯化

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体外分枝杆菌培养系统检测结核分枝杆菌耐受利福平的系统评价 被引量：1

6

作者 马彬 田金徽 +4 位作者 李培杰 祝秉东 刘雅莉 杨克虎 康熙雄 《标记免疫分析与临床》 CAS 2009年第2期88-93,共6页

用Meta-analysis方法评价非放射性分枝杆菌培养系统检测结核分枝杆菌耐受利福平的准确性。通过检索PubMed、EMBASE、CBMWeb、CSJD、CJFD数据库和其他方式广泛收集文献。用QUADAS(Quality Assessment of Diagnostic AccuracyStudies)标... 用Meta-analysis方法评价非放射性分枝杆菌培养系统检测结核分枝杆菌耐受利福平的准确性。通过检索PubMed、EMBASE、CBMWeb、CSJD、CJFD数据库和其他方式广泛收集文献。用QUADAS(Quality Assessment of Diagnostic AccuracyStudies)标准评价文献质量。用Meta-Disc软件计算合并灵敏度、合并特异性和SROC曲线等评价非放射性分枝杆菌培养系统的诊断正确性。最终纳入6篇文献。非放射性分枝杆菌培养系统在检测结核分枝杆菌耐受利福平时,均显示了较高的灵敏度和特异性。MB/BacT系统的合并灵敏度=100%,合并特异性=99%。BACTEC MGIT960检测系统的平均灵敏度=100%,平均特异性=91%,SROC曲线下面积为0.997。结论:MB/BacT和BACTEC MGIT960系统在检测结核分枝杆菌耐药(利福平)性方面显示了较高的灵敏度和特异性。推荐使用MB/BacT和BACTEC MGIT960系统代替BACTEC460检测系统作为结核分枝杆菌耐药(利福平)性的确诊试验。限于纳入研究的局限性,手工操作的分枝杆菌生长指示管(MGIT)系统的检验效能还有待进一步研究。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 系统评价 SROC曲线 非放射性分枝杆菌培养系统

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结核分枝杆菌耐利福平诊断试验的系统评价

7

作者 仇杰 张君雨 +3 位作者 张佩珍 张颖 马彬 杨克虎 《中国循证医学杂志》 CSCD 2008年第8期642-651,共10页

目的采用Meta分析的方法评价LiPA和phage-based assays法检测结核分枝杆菌耐利福平诊断试验的准确性。方法通过检索PubMed、EMbase、CBMWeb、CSJD、CJFD数据库和其他方式广泛收集文献。根据QUADAS质量评价标准评价纳入文献的质量,用Meta... 目的采用Meta分析的方法评价LiPA和phage-based assays法检测结核分枝杆菌耐利福平诊断试验的准确性。方法通过检索PubMed、EMbase、CBMWeb、CSJD、CJFD数据库和其他方式广泛收集文献。根据QUADAS质量评价标准评价纳入文献的质量,用Meta-Disc软件对其敏感度、特异度、阳性似然比、阴性似然比等进行合并分析,并进行异质性检验,对无异质性的研究绘制SROC曲线。结果最终纳入42篇文献。(1)LiPA法检测结核分支杆菌耐利福平时,7个研究以BACTEC460法为参考,合并敏感度0.98,合并特异度0.98,SROC(AUC)=0.9924;6个研究以proportion法为参考,合并敏感度0.97,合并特异度1.00,SROC(AUC)=0.9961;3个研究以BACTEC460、Proportion法作为参考,合并敏感度0.92,合并特异度0.98,SROC(AUC)=0.9842(;2)噬菌体扩增法(商用)检测结核分枝杆菌耐利福平的7个研究,以BACTEC460、Proportion法为参考,合并敏感度0.95,合并特异度0.95,SROC(AUC)=0.9842,(3)噬菌体扩增法(内部的)检测结核分支杆菌耐利福平的7个研究,以BACTEC460、比例法、绝对浓度法和电阻率法为参考,其合并敏感度0.98,合并特异度0.98,SROC(AUC)=0.9949;(4)荧光素酶噬菌体报告技术检测结核分枝杆菌耐利福平的7个研究,以BACTEC460、比例法、绝对浓度法为参考,其合并敏感度0.98,合并特异度0.98,SROC(AUC)=0.9788。结论现有研究证实(:1)采用分离培养时,噬菌体检测法在检测结核分枝杆菌耐利福平方面具有较高的敏感度和特异度,在提高耐多药结核病诊断准确性方面具有潜力。(2)LiPA在检测结核分枝杆菌耐利福平方面也具有较高的敏感度和特异度,但直接应用临床标本检测时敏感度似乎稍有下降。上述结果尚需更多设计严谨、科学的临床试验进一步证实。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 诊断试验 利福平 系统评价 质量评价标准 结核分支杆菌 技术检测 异质性检验

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CD209-871A/G位点多态性与结核易感性的Meta分析

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作者 康振 雒艳萍 +3 位作者 时春虎 田金徽 杨克虎 祝秉东 《循证医学》 CSCD 2011年第6期358-363,共6页

目的评价CD209-871A/G位点多态性与结核易感性的相关性。方法以"DC-SIGN、CD209、ICAM-3、polymorphism、single nucleotide polymorphism、tuberculosis"为检索词,检索PubMed、EMBASE和Web ofScience数据库;以"DC-SIGN... 目的评价CD209-871A/G位点多态性与结核易感性的相关性。方法以"DC-SIGN、CD209、ICAM-3、polymorphism、single nucleotide polymorphism、tuberculosis"为检索词,检索PubMed、EMBASE和Web ofScience数据库;以"DC-SIGN、CD209、ICAM-3、结核、多态性"为检索词,检索中国学术期刊全文数据库(CNKI)、中国生物医学文献数据库(CBM)和万方数据库,检索时间截止至2011年3月。全面收集CD209-871A/G位点多态性与结核易感性的文献。排除不相关研究、会议摘要及综述类文章等,纳入公开发表的病例对照研究,病例组为确诊的结核病患者,无论是否合并人类免疫缺陷病毒感染,对照组为与病例组无血缘关系、无慢性感染性疾病史的健康人群;用Meta分析的方法合并比较基因型AA、GG、AG和等位基因A、G在结核组与对照组中是否有差异。结果共纳入3篇文献,共有结核病患者726例,健康对照744例。对总体人群进行Meta分析,未发现等位基因G和结核易感性相关[比值比0.60,95%可信区间(0.27,1.35),P=0.22];基因型AA和等位基因A在结核病与健康对照组之间差异有统计学意义[比值比1.51,95%可信区间(1.01,2.26),P=0.04;比值比1.28,95%可信区间(1.06,1.55),P=0.01]。结论本研究提示CD209-871AA基因型和等位基因A与结核病的易感性有关,而-871G可能与结核病的机体免疫保护有关,尚需大样本病例对照试验证实。 展开更多

关键词 结核易感性 基因多态性 CD209—871A/G多态性 META分析

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结核分枝杆菌耐异烟肼诊断试验的系统评价

9

作者 张君雨 田金徽 +4 位作者 姜雷 张颖 杨孙虎 于红娟 杨克虎 《中国循证医学杂志》 CSCD 2008年第10期869-874,共6页

目的评价9种检测结核分枝杆菌耐异烟肼诊断试验方法的准确性。方法计算机检索PubMed、EMbase等数据库和手工检索相关期刊,全面收集结核分枝杆菌耐异烟肼诊断试验的研究,依据QUADAS评价纳入诊断试验的质量,并对结果进行Meta分析。结果最... 目的评价9种检测结核分枝杆菌耐异烟肼诊断试验方法的准确性。方法计算机检索PubMed、EMbase等数据库和手工检索相关期刊,全面收集结核分枝杆菌耐异烟肼诊断试验的研究,依据QUADAS评价纳入诊断试验的质量,并对结果进行Meta分析。结果最终纳入12个研究。Meta分析结果显示:硝酸盐还原法与比例法相比,以及BACTECMGIT960与BACTEC460TB相比,其敏感度、特异度、阳性似然比、阴性似然比及SROC曲线下面积分别为92%、99%、31.84、0.12、0.9836和98.5%、96%、13.66、0.035、0.9871;其余检测方法,如MODS、MB/BacT、MYDBA和TTC亦显示了较好的敏感度和特异度。结论硝酸盐还原检测法可代替比例法作为结核分枝杆菌耐异烟肼的筛查试验。BACTECMGIT960可代替BACTEC460检测系统作为结核分枝杆菌耐异烟肼的确诊试验。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 异烟肼 诊断胜试验 系统评价

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小檗碱对结核抗原持续刺激致T细胞耗竭的干预作用 被引量：4

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作者 张丹 马岩林 +1 位作者 李菲 祝秉东 《兰州大学学报（医学版）》 2023年第5期8-13,21,共7页

目的探究小檗碱对结核分枝杆菌抗原持续刺激致T细胞耗竭的影响。方法应用结核抗原持续刺激小鼠模拟临床结核分枝杆菌慢性感染病理过程:卡介苗感染C57BL/6小鼠1周后,使用结核抗原ESAT6-CFP10(EC)和Mtb10.4-HspX(MH)持续刺激4次,每次间隔1... 目的探究小檗碱对结核分枝杆菌抗原持续刺激致T细胞耗竭的影响。方法应用结核抗原持续刺激小鼠模拟临床结核分枝杆菌慢性感染病理过程:卡介苗感染C57BL/6小鼠1周后,使用结核抗原ESAT6-CFP10(EC)和Mtb10.4-HspX(MH)持续刺激4次,每次间隔1周,建立T细胞耗竭模型。利用该模型进行干预治疗:结核抗原刺激期间每天给予不同剂量小檗碱灌胃治疗,末次抗原刺激后1周,流式细胞术检测抗原特异性T细胞分泌γ干扰素的水平和脾脏CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞表面抑制性受体PD-1的表达;ELISA检测血清中γ干扰素的水平;生化试剂盒检测脾脏淋巴细胞糖酵解代谢产物丙酮酸和乳酸的浓度;小檗碱体外作用于Jurkat T细胞后检测丙酮酸和乳酸的浓度。结果结核抗原持续刺激致抗原特异性T细胞分泌γ干扰素的水平降低(P<0.05),CD4^(+)和CD8^(+)T细胞表达PD-1增多(P<0.05),提示发生T细胞耗竭。不同剂量的小檗碱治疗后,减弱了T细胞的持续活化,血清γ干扰素水平降低(P<0.01),CD4^(+)和CD8^(+)T细胞PD-1表达减少(P<0.05)。体外实验表明小檗碱抑制Jurkat T细胞的糖酵解(P<0.01)。结论结核抗原持续刺激诱导T细胞耗竭,而小檗碱治疗可抑制T细胞的糖酵解,调节T细胞活化,预防T细胞耗竭。 展开更多

关键词 小檗碱 结核抗原 T细胞耗竭 糖酵解

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人PKM_2基因克隆、表达及纯化的研究

11

作者 王秋香 刘会玲 +3 位作者 祝秉东 李海红 王千千 王海琳 《实用妇产科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期270-273,共4页

目的:构建人PKM2(M2-type pyruvate kinase)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达,镍离子柱亲和层析法纯化融合蛋白。方法:用PCR方法从宫颈癌Hela细胞全基因组中扩增出目的基因PKM2,通过克隆载体pET30a(+)构建质粒载体pET30a(+)-PKM2。经... 目的:构建人PKM2(M2-type pyruvate kinase)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达,镍离子柱亲和层析法纯化融合蛋白。方法:用PCR方法从宫颈癌Hela细胞全基因组中扩增出目的基因PKM2,通过克隆载体pET30a(+)构建质粒载体pET30a(+)-PKM2。经双酶切和DNA测序证实正确后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。结果:双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果和报道一致。经SDS-PAGE分析,纯化后的蛋白约在58KDa位,条带单一,无杂带出现。结论:成功表达纯化了PKM2融合蛋白,为肿瘤疫苗研制和肿瘤标志物快速诊断的研究奠定基础。 展开更多

关键词 PKM 2 克隆 表达 纯化

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结核疫苗研究的历史与现状 被引量：16

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作者 祝秉东 王洪海 《中华结核和呼吸杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期378-382,共5页

由于结核病缺乏有效的疫苗保护，发病率持续增高，成为人类传染病中继艾滋病之后的第二大杀手。减毒牛型结核分枝杆菌——卡介苗是目前许多国家批准应用于人体的惟一结核病疫苗。然而，卡介苗对成人肺结核的保护效率很低，研制新型结核... 由于结核病缺乏有效的疫苗保护，发病率持续增高，成为人类传染病中继艾滋病之后的第二大杀手。减毒牛型结核分枝杆菌——卡介苗是目前许多国家批准应用于人体的惟一结核病疫苗。然而，卡介苗对成人肺结核的保护效率很低，研制新型结核病疫苗迫在眉睫。多种类型的新型疫苗，包括重组卡介苗疫苗、营养缺陷型结核分枝杆菌疫苗、蛋白质多肽疫苗、DNA疫苗、以病毒为载体的结核分枝杆菌亚单位疫苗等被广泛研究。至2005年，已有120种以上的疫苗进行了动物实验研究，至少有5个疫苗已进入Ⅰ期临床试验。 展开更多

关键词 结核疫苗 牛型结核分枝杆菌 结核病疫苗 重组卡介苗 分枝杆菌疫苗 Ⅰ期临床试验 保护效率 成人肺结核

原文传递

二甲基三十六烷基铵及卡介苗多糖核酸佐剂在结核亚单位疫苗加强BCG免疫中的效应研究 被引量：6

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作者 达泽蛟 胡丽娜 +5 位作者 王秉翔 姜雯雯 傅林锋 于红娟 雒彧 祝秉东 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期555-559,共5页

目的 探讨二甲基三十六烷基铵（dimo-thylidioctyl ammonium bromide,DDA）和卡介苗多糖核酸（BCC-PSN）佐剂在结核融合蛋白疫苗加强卡介苗（BCG）免疫中的不同免疫辅助效应.方法 选择DDA、BCG-PSN作为融合蛋白AMM（Ag85B-MPT64190-198-... 目的 探讨二甲基三十六烷基铵（dimo-thylidioctyl ammonium bromide,DDA）和卡介苗多糖核酸（BCC-PSN）佐剂在结核融合蛋白疫苗加强卡介苗（BCG）免疫中的不同免疫辅助效应.方法 选择DDA、BCG-PSN作为融合蛋白AMM（Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4）的佐剂,在BCG初免小鼠后,AMM疫苗加强免疫两次,其中一组联合使用两种佐剂（DDA/BCG-PSN）,另一组单独以DDA作为佐剂,同时设立BCG或磷酸缓冲液（PBS）免疫组为对照.应用ELISA及ELISPOT检测免疫小鼠的体液与细胞免疫反应,最后一次加强免疫后第12周,以H37Rv尾静脉攻毒并检测小鼠肺脾组织细菌载量和病理改变,评价不同佐剂疫苗的保护效果.结果 在BCG初免基础上,联合佐剂组（AMM/DDA/BCG-PSN）和单独佐剂组（AMM/DDA）加强免疫两次后,脾脏淋巴细胞经抗原Ag85B和PPD（purified protein derivative）刺激后,皆可产生分泌较BCG组高的IFN-γ.毒力株攻击后菌落形成单位（colony-forming unit,CFU）计数显示,联合佐剂组（AMM/DDA/BCG-PSN）脾脏荷菌量少于PBS组和BCG组（P〈0.05）;而单独佐剂组（AMM/DDA）肺部荷菌量少于PBS组和BCG组（P〈0.05）.组织病理分析结果 表明AMM/DDA/BCG-PSN组肺组织病理损伤较轻,而AMM/DDA组病理损伤个体差异较大.结论 DDA是较为理想的结核亚单位疫苗佐剂,能诱导较强的细胞免疫和免疫保护作用;BCG-PSN可能具有免疫调节作用,可以减轻免疫病理损伤. 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 亚单位疫苗 佐剂

原文传递

1例L型支气管戈登菌肺部感染的报道 被引量：2

14

作者 陈玉芊 同重湘 +4 位作者 姜元 水永珍 田丽丽 张颖 祝秉东 《微生物与感染》 2010年第2期93-99,共7页

放线菌目戈登菌属支气管戈登菌存在于环境中,在机体免疫力下降时可感染致病。从1例肺部感染4年的78岁患者痰标本中分离出1株菌株,经聚合酶链反应(PCR)扩增16SrRNADNA,序列比对分析证实为支气管戈登菌。该菌株在含蔗糖的Middlebrook7H9(7... 放线菌目戈登菌属支气管戈登菌存在于环境中,在机体免疫力下降时可感染致病。从1例肺部感染4年的78岁患者痰标本中分离出1株菌株,经聚合酶链反应(PCR)扩增16SrRNADNA,序列比对分析证实为支气管戈登菌。该菌株在含蔗糖的Middlebrook7H9(7H9-L)半固体培养基上呈煎蛋样嵌入性生长,在含氯化钠的92-3TB(92-3TB-L)液体培养基也生长,而在罗氏培养基、BACTECMGIT-960、不含氯化钠的92-3TB(92-3TB-B)液体培养基及不含蔗糖的Middlebrook7H9(7H9-B)半固体培养基不生长。涂片抗酸染色显微镜下可见大小不等的抗酸染色阴性球状或短杆状菌。传代培养2代后可见橘红色菌落,涂片抗酸染色可见少量抗酸染色弱阳性杆状菌,革兰染色及扫描电子显微镜观察菌体为杆状。结果表明,从患者痰液中分离的菌株为L型支气管戈登菌,提示肺部感染迁延不愈的免疫力低下患者需考虑感染L型支气管戈登菌的可能。 展开更多

关键词 支气管戈登菌 L型 感染

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人ENO1(Enolase-α)基因的原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体的制备

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作者 王玉凤 幺坤 +1 位作者 关泉林 祝秉东 《现代肿瘤医学》 CAS 2014年第11期2538-2542,共5页

目的:构建人ENO1(human Enolase-α)基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白的表达,利用纯化后的蛋白制备具有活性的ENO1多克隆抗体。方法:用PCR方法从胃癌MKN45细胞全基因组中扩增出目的基因ENO1,将目的基因和原核表达载体pET30a(+)分别双酶... 目的:构建人ENO1(human Enolase-α)基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白的表达,利用纯化后的蛋白制备具有活性的ENO1多克隆抗体。方法:用PCR方法从胃癌MKN45细胞全基因组中扩增出目的基因ENO1,将目的基因和原核表达载体pET30a(+)分别双酶切,回收酶切产物并用T4连接酶连接,获得重组质粒pET30a(+)-ENO1。将重组质粒转入大肠埃希菌菌株BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化,利用纯化的ENO1活性蛋白作为抗原免疫家兔,制备抗血清多克隆抗体,并用Western blot检测其特异性。结果:目的基因与原核表达载体经双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果表明重组人ENO1基因序列与NCBI(NM_001428.3)公布序列一致。经SDS-PAGE分析,结果显示重组蛋白的分子量约在47kDa,条带单一,无杂带出现,主要以可溶性形式存在。Western blot证实多克隆抗体制备成功。结论:成功表达、纯化了ENO1融合蛋白,制备了具有高特异性的多克隆抗体,为进一步肿瘤疫苗的研制和肿瘤标志物快速诊断的研究奠定基础。 展开更多

关键词 烯醇化酶-α 原核表达 纯化 多克隆抗体

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两株鼻疽诺卡菌临床分离株的鉴定

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作者 李文杰 同重湘 +1 位作者 姜元 高娃 《分子诊断与治疗杂志》 2012年第6期389-392,共4页

目的应用基因测序方法对2株疑似非结核分枝杆菌的菌株进行初步菌种鉴定,指导临床用药治疗。方法将2株临床分离菌株1520、4108分别接种于罗氏培养基,观察其菌落生长状况;取生长对数期菌落,抽提菌株DNA;PCR扩增16SrDNA基因序列,对其PCR产... 目的应用基因测序方法对2株疑似非结核分枝杆菌的菌株进行初步菌种鉴定,指导临床用药治疗。方法将2株临床分离菌株1520、4108分别接种于罗氏培养基,观察其菌落生长状况;取生长对数期菌落,抽提菌株DNA;PCR扩增16SrDNA基因序列,对其PCR产物进行测序和NCBI网站Blast同源性比对,以进行菌株的初步鉴定。结果编号为1520、4108两株菌株,在罗氏培养基上生长迅速,均可见淡黄色粗颗粒样小菌落,疑似非结核分枝杆菌;以PCR扩增两株菌的16SrDNA基因序列,结果与鼻疽诺卡菌(Nocardia farcinica)同源性极高,比例均达到99%。结论从肺科急诊患者体内分离到的菌株1520、4108为鼻疽诺卡菌,而不是非结核分枝杆菌,为临床在治疗方案上提供了有力的证据。同时,DNA测序分析能够快速、简便、准确地鉴定到菌种,为实验室疑难菌型鉴定提供了技术保障。 展开更多

关键词 非结核分枝杆菌 菌种鉴定 16SrDNA 鼻疽诺卡菌

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结核分枝杆菌抗原Ag85B-Mpt64 190-198-HspX融合蛋白免疫原性的初步观察 被引量：2

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作者 李青 姜雯雯 +6 位作者 雒彧 于红娟 宋楠楠 王秉翔 刘昕 张颖 祝秉东 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期103-107,共5页

目的为了建立对潜伏感染细菌的保护性免疫应答，本研究选择结核分枝杆菌休眠期、对数生长期最重要的保护性抗原HspX、Mpt64的190～198位的氨基酸多肽（CD8^＋T细胞表位）及Ag85B，构建融合蛋白Ag85B-Mpt64 190-198-HspX（AMH），并对其... 目的为了建立对潜伏感染细菌的保护性免疫应答，本研究选择结核分枝杆菌休眠期、对数生长期最重要的保护性抗原HspX、Mpt64的190～198位的氨基酸多肽（CD8^＋T细胞表位）及Ag85B，构建融合蛋白Ag85B-Mpt64 190-198-HspX（AMH），并对其免疫原性进行研究。方法PCR分别扩增Ag85B、Mpt64 190-198-HspX基因，并依次插入pET-28a质粒中，在大肠杆菌BL21中表达纯化AMH蛋白。将该蛋白和佐剂二甲基三十六烷基铵和卡介苗多糖核酸（DDA＋BCG—PSN）混合构建亚单位疫苗，分别于1、4、7周皮下免疫C57BL／6小鼠3次，最后一次免疫5周后检测体液免疫与细胞免疫反应。结果该融合蛋白以包涵体形式能在大肠杆菌中稳定表达，经Ni—NTA层析柱纯化得到纯度较高的蛋白；构建的亚单位疫苗免疫动物能产生针对结核杆菌特定抗原（PPD、Ag85B、Mpt64 190-198和HspX）的特异性的细胞免疫和体液免疫应答，具有较强的免疫原性。结论融合蛋白AMH作为结核亚单位疫苗候选的融合蛋白抗原有必要进一步研究。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 亚单位疫苗 融合蛋白 AG85B HSPX

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CFP21-ELISPOT方法的建立及其在结核分枝杆菌感染诊断中的应用 被引量：3

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作者 谢富佳 谭继英 +6 位作者 乔梅 梁正羽 王世婷 唐克峰 祝秉东 杨燕 章国平 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2011年第9期647-649,683,共4页

目的用酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)评价检测CFP21蛋白在结核分枝杆菌感染中的诊断效果,同时,比较CFP21、CFP10和ESAT6的应用价值。方法取28例临床确诊结核患者和26例健康志愿者外周血,分离单个核细胞(per... 目的用酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)评价检测CFP21蛋白在结核分枝杆菌感染中的诊断效果,同时,比较CFP21、CFP10和ESAT6的应用价值。方法取28例临床确诊结核患者和26例健康志愿者外周血,分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用CFP21、CFP10和ESAT6蛋白刺激,定量检测PBMC分泌的特异性γ干扰素(IFN-γ)水平,判断结核分枝杆菌感染情况。用ELISA检测血清抗结核抗体。结果 ELISA检测结核病患者血清结核抗体阳性率为57.1%;以CFP21、CFP10和ESAT6为抗原,用ELISPOT方法检测结核病患者IFN-γ阳性率分别为25.0%、39.3%和32.1%。结论应用CFP21蛋白作为抗原建立的ELISPOT方法有潜在的临床应用价值,但CFP21作为抗原用于结核分枝杆菌感染诊断的敏感性低于CFP10和ESAT6。 展开更多

关键词 酶联免疫斑点试验(ELISPOT) CFP21蛋白 CFP10蛋白 ESAT6蛋白 结核病 诊断

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二甲基三十六烷基铵-卡介苗多糖核酸在结核亚单位疫苗中的佐剂效应 被引量：2

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作者 宋楠楠 王秉翔 +9 位作者 史大中 傅林锋 雒彧 于红娟 韩少波 焦磊 郄亚卿 王洪海 张颖 祝秉东 《中华结核和呼吸杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期513-516,共4页

目的探讨二甲基三十六烷基铵（DDA）、卡介苗多糖核酸（BCG—PSN）作为结核病融合蛋白疫苗佐剂的免疫效应。方法采用热酚法制备BCG—PSN，与DDA联合作为融合蛋白AMM（Ag85B—MPT64 190-196-Mtb8．4）佐剂免疫小鼠，设卡介苗、生理盐水... 目的探讨二甲基三十六烷基铵（DDA）、卡介苗多糖核酸（BCG—PSN）作为结核病融合蛋白疫苗佐剂的免疫效应。方法采用热酚法制备BCG—PSN，与DDA联合作为融合蛋白AMM（Ag85B—MPT64 190-196-Mtb8．4）佐剂免疫小鼠，设卡介苗、生理盐水、弗氏不完全佐剂（IFA）及单独应用DDA或BCG—PSN一种佐剂的各组作为对照。应用ELISA和酶联免疫斑点法检测免疫小鼠的体液与细胞免疫反应。结果分离培养疫苗免疫小鼠的脾脏淋巴细胞，用特异性抗原Ag85B刺激后，AMM＋DDA＋BCG—PSN疫苗组、AMM＋DDA组和卡介苗组小鼠每1×10^6个脾淋巴细胞分泌γ-干扰素的细胞数分别为222±79、259±85和230±64，均明显高于AMM＋PBS组（40±4）、AMM＋IFA组（10±3）、AMM＋BCG．PSN组（132±18）和生理盐水组（8±4），差异有统计学意义（t值为2．923—7．118，均P〈0．05）；与单用DDA组比较，添加DDA和BCG—PSN两种佐剂的疫苗组小鼠血清抗体滴度Ig2／IgG，较高（0．125和0．025），但γ-干扰素分泌水平没有增高。结论AMM＋DDA＋BCG—PSN结核病亚单位疫苗能够引起较强的Th1细胞免疫为主的免疫反应，DDA＋BCG—PSN（尤其是DDA）具有增强结核病亚单位疫苗Th1细胞免疫应答的佐剂效应。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 疫苗 亚单位 卡介苗

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变性高效液相色谱法检测结核分枝杆菌利福平耐药基因突变的初步探索 被引量：2

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作者 李苗 司红艳 +5 位作者 郭璐 李培强 祝秉东 杨克虎 张颖 景涛 《中华结核和呼吸杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期128-131,共4页

目的探讨变性高效液相色谱（DHPLC）技术在MTB的利福平耐药菌株rpoB基因突变检测中的应用价值。方法PCR扩增MTB的rpoB基因利福平耐药决定区，扩增产物与野生型DNA链形成异源双链，在65．4℃柱温下进行DHPLC分析。对DHPLC不同峰型菌株的r... 目的探讨变性高效液相色谱（DHPLC）技术在MTB的利福平耐药菌株rpoB基因突变检测中的应用价值。方法PCR扩增MTB的rpoB基因利福平耐药决定区，扩增产物与野生型DNA链形成异源双链，在65．4℃柱温下进行DHPLC分析。对DHPLC不同峰型菌株的rpoB基因片段进行测序，评价DHPLC技术的敏感度和特异度。结果共分析46株MTB菌株，其中42株对利福平耐药，4株对利福平敏感。经DHPLC分析，产生15种不同图谱。测序结果表明，各图谱菌株突变特征不同。除D108和D24菌株的DHPLC峰形相同而突变特征不同外，其他菌株均为DHPLC峰型与基因多态性相一致，即DHPLC峰型相同则基因多态性相同，DHPLC峰型不同则基因多态性不同。结论DHPLC具有简便快捷、高通量和自动化的特点，敏感度和特异度高，可用于快速检测耐药MTB的基因突变。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 抗药性 突变 色谱法 高压液相

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