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半固体培养法制备非洲猪瘟病毒pA104R蛋白的单克隆抗体
1
作者 刘蓓蓓 韦艳娜 +7 位作者 陈蓉 谢星 倪博 郝飞 张珍珍 白昀 袁厅 冯志新 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第4期682-689,共8页
为了快速、高效制备非洲猪瘟病毒(ASFV)单克隆抗体,本研究通过大肠杆菌系统表达并纯化了ASFV重组蛋白pA104R。以ASFV重组蛋白pA104R为抗原,分别比较了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂和常规弗氏佐剂两种免疫策略,并重点比较半固体培养法和常规... 为了快速、高效制备非洲猪瘟病毒(ASFV)单克隆抗体,本研究通过大肠杆菌系统表达并纯化了ASFV重组蛋白pA104R。以ASFV重组蛋白pA104R为抗原,分别比较了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂和常规弗氏佐剂两种免疫策略,并重点比较半固体培养法和常规有限稀释法来制备ASFV pA104R单克隆抗体的效率。结果显示,本研究获得了相对分子质量为3.5×104的ASFV重组可溶性蛋白pA104R,通过其与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫小鼠,在第21 d即可达到融合要求,本试验方法(重组蛋白pA104R与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫)较重组蛋白pA104R与常规弗氏佐剂免疫节省14 d时间。通过半固体培养法筛选单克隆的试验周期比有限稀释法缩短28 d,并减少了亚克隆的工作量。半固体培养法获得5株阳性杂交瘤细胞,挑选效价较高的3株(9A4、9H6、11F5)进行鉴定,重链均为IgG,轻链均为KAPPA。纯化后的3株单克隆抗体针对pA104蛋白和全病毒蛋白质的效价分别达1∶160000~1∶320000和1∶200~1∶400。本研究优选了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂结合半固体培养法筛选pA104R的单克隆抗体,为单克隆抗体制备提供了快速高效的新策略。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 pA104蛋白 单克隆抗体 半固体培养法
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基于双特异纳米抗体FMDV血凝检测方法的建立
2
作者 杨利 张浩明 +3 位作者 乔绪稳 陈瑾 郑其升 程海卫 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第3期514-521,共8页
本研究利用基因工程方法将抗口蹄疫病毒(FMDV)纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞(cRBC)纳米抗体NbRBC48的基因片段连接,构建双特异纳米抗体Nb205-48,其相对分子质量为3.5×10^(4),能同时与FMDV和cRBC反应。利用Nb205-48成功建立了可用... 本研究利用基因工程方法将抗口蹄疫病毒(FMDV)纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞(cRBC)纳米抗体NbRBC48的基因片段连接,构建双特异纳米抗体Nb205-48,其相对分子质量为3.5×10^(4),能同时与FMDV和cRBC反应。利用Nb205-48成功建立了可用于FMDV抗原检测的血凝方法,该方法检测灵敏度为1μg/ml,与其他病毒无交叉反应,且批内和批间重复性好。分别采用血凝法和夹心ELISA方法对3批次FMDV抗原进行了检测,二者检测结果基本吻合。本研究建立了基于双特异纳米抗体Nb205-48的血凝检测方法,该方法具有较好的灵敏度、特异性和重复性,且简便、快捷、成本低,其检测结果与传统的FMDV定量检测方法的检测结果相关性好,为检测口蹄疫疫苗生产过程中FMDV抗原的含量提供了新方法。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 双特异性纳米抗体 血凝检测法
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双靶向融合蛋白用于新城疫病毒La Sota株对鸭的免疫效率的提高作用
3
作者 李玲 祝博森 +4 位作者 朱婷 商璐 邓碧华 卢宇 徐海 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第12期2317-2323,共7页
本研究旨在探究双靶向融合蛋白用于新城疫病毒(NDV)La Sota毒株对鸭的免疫效率的提高作用,为提升鸭新城疫免疫防控能力做有益探索。将特异性结合囊膜病毒表面糖蛋白的红藻凝集素(GRFT)与靶向结合禽树突状细胞的纳米抗体分子(VHH)的编码... 本研究旨在探究双靶向融合蛋白用于新城疫病毒(NDV)La Sota毒株对鸭的免疫效率的提高作用,为提升鸭新城疫免疫防控能力做有益探索。将特异性结合囊膜病毒表面糖蛋白的红藻凝集素(GRFT)与靶向结合禽树突状细胞的纳米抗体分子(VHH)的编码基因进行串联表达,经大肠杆菌表达系统制备双靶向融合蛋白。利用组氨酸(His)标签纯化GRFT-VHH融合蛋白,采用有限稀释法定量评价融合蛋白与La Sota病毒的结合能力。用饱和结合融合蛋白的La Sota病毒制备疫苗,分组免疫无特定病原体(SPF)雏鸭,监测免疫后血凝抑制(HI)抗体效价以及IL-4、IFN-γ细胞因子水平。结果显示,构建的重组大肠杆菌能够高效表达融合蛋白,经Ni柱纯化回收的GRFT-VHH54、GRFT-VHH74蛋白质量浓度分别为230μg/mL、1350μg/mL,仅需100 ng融合蛋白即可完全结合1×10^(8)半数感染量(EID 50)病毒;NDV+GRFT-VHH54组免疫后21 d HI抗体效价达到7 log 22以上,血清中IL-4和IFN-γ含量分别为80.0 pg/mL、8.8 pg/mL,显著高于NDV单独免疫组(P<0.05)。双靶向融合蛋白GRFT-VHH54能够提高新城疫病毒La Sota株对鸭的免疫效率,可作为免疫增强剂做进一步的开发与应用。 展开更多
关键词 新城疫病毒 融合蛋白 靶向 免疫效率
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N端B细胞表位缺失的兔出血症病毒VP60蛋白的表达及其免疫原性
4
作者 刘维龙 胡波 +7 位作者 范志宇 魏后军 仇汝龙 宋艳华 陈萌萌 葛雷 熊富强 王芳 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第3期508-513,共6页
本研究将A3C单抗识别的VP60蛋白NTA区域作为识别标记,设计一系列编码VP60 NTA区域重叠多肽的基因序列并连接于pGEX-4T-1载体,确定A3C单抗识别的精确表位。然后构建重组质粒Bacmid-VP60△A3C,将Bacmid-VP60△A3C转染Sf9昆虫细胞,得到重... 本研究将A3C单抗识别的VP60蛋白NTA区域作为识别标记,设计一系列编码VP60 NTA区域重叠多肽的基因序列并连接于pGEX-4T-1载体,确定A3C单抗识别的精确表位。然后构建重组质粒Bacmid-VP60△A3C,将Bacmid-VP60△A3C转染Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒rBac-VP60△A3C。RT-PCR、HA、IFA和Western Blot鉴定结果表明,重组蛋白VP60△A3C在Sf9细胞中高效表达,电镜观察显示其形态和结构与兔出血症病毒VP60蛋白类似。将重组蛋白VP60△A3C以每只200μg免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,免疫后14 d,以兔出血症病毒WF株攻毒新西兰兔。结果表明,免疫组无死亡,而对照组全部死亡。本研究结果为制备表位缺失的兔出血症亚单位疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 VP60蛋白 B细胞表位 免疫原性
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CVC1302通过小鼠骨髓源树突状细胞对免疫反应的调控 被引量：1
5
作者 侯立婷 于晓明 +5 位作者 杜露平 张元鹏 程海卫 陈瑾 郑其升 侯继波 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2023年第6期1380-1385,共6页
为获得C57BL/6小鼠骨髓源树突状细胞(DC)的体外制备方法并探讨免疫增强剂CVC1302对DC免疫调控的影响,取8周龄的C57BL/6小鼠骨髓细胞,在体外经过重组鼠源粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(Recombinant mouse granulocyte-macrophage colony-s... 为获得C57BL/6小鼠骨髓源树突状细胞(DC)的体外制备方法并探讨免疫增强剂CVC1302对DC免疫调控的影响,取8周龄的C57BL/6小鼠骨髓细胞,在体外经过重组鼠源粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(Recombinant mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, rm GM-CSF)诱导分化为DC。诱导当天与诱导第3 d、第7 d时,用倒置显微镜观察细胞形态;诱导第7 d时,收获细胞,鉴定表型。利用流式细胞术评价CVC1302对DC表面分子表达水平的影响,用超高分辨率显微镜评价CVC1302对DC递呈抗原的影响,采用流式细胞术检测T淋巴细胞的活化数量,利用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)方法检测T淋巴细胞活化后干扰素γ(IFN-γ)的分泌水平。结果表明,体外诱导的DC在显微镜下具有非常典型的树突状细胞形态,流式细胞术检测结果表明,经典的1型树突状细胞(Conventional type 1 dendritic cell, cDC1)和经典的2型树突状细胞(Conventional type 2 dendritic cell, cDC2)亚群均可检测到。CVC1302能够显著促进DC表面分子活化并且增强DC对鸡卵清白蛋白(OVA)抗原的递呈;CVC1302能够显著活化T淋巴细胞并且提高T淋巴细胞活化后IFN-γ的分泌水平。本研究利用rm GM-CSF成功在体外刺激诱导DC的产生,并证实了CVC1302在体外同样具有促进DC成熟、DC对OVA抗原的递呈及T淋巴细胞活化的能力。 展开更多
关键词 C57BL/6小鼠 树突状细胞 CVC1302 抗原递呈 T淋巴细胞活化
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H9亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力 被引量：1
6
作者 张雪花 王卫华 +3 位作者 武奇 李丁 平继辉 梅梅 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2023年第9期1901-1907,共7页
H9N2亚型禽流感病毒(AIV)变异快、传染性强,由病毒流行株制备而成的灭活疫苗达不到完全保护的效果,导致H9N2亚型禽流感时有发生。为研发具有广谱保护性的H9亚型禽流感疫苗,本研究利用生物信息技术,对H9亚型AIV HA基因序列进行分析,设计... H9N2亚型禽流感病毒(AIV)变异快、传染性强,由病毒流行株制备而成的灭活疫苗达不到完全保护的效果,导致H9N2亚型禽流感时有发生。为研发具有广谱保护性的H9亚型禽流感疫苗,本研究利用生物信息技术,对H9亚型AIV HA基因序列进行分析,设计获得HA基因序列。将HA基因构建于杆状病毒表达系统,表达的重组HA蛋白血凝效价为1×2^(12),与不同分支H9亚型AIV阳性血清具有良好的交叉反应活性。将重组蛋白制备成疫苗(rHA疫苗)免疫10日龄雏鸡,免疫后28 d将不同亚分支的H9亚型AIV流行毒株115和YZ株分别以1×10^(6)EID_(50)(半数鸡胚感染量)感染试验鸡,rHA疫苗组交叉保护效力明显优于商品苗组。本研究结果表明H9亚型禽流感广谱型亚单位疫苗具有较好的应用前景,可以用于防控H9 AIV感染。 展开更多
关键词 H9亚型禽流感 HA基因 杆状病毒表达系统 广谱亚单位疫苗 免疫
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鹅星状病毒衣壳蛋白的表达及其免疫的小鼠B细胞受体组库特征分析
7
作者 赵冬敏 刘青涛 +3 位作者 韩凯凯 黄欣梅 刘宇卓 李银 《江苏农业学报》 2025年第3期549-558,共10页
本研究根据鹅星状病毒(GoAstV)衣壳蛋白(Cap)基因序列,通过人工合成获得衣壳蛋白基因片段,并构建重组杆状病毒rBV-Cap。通过间接免疫荧光检测、Western Blot鉴定和透射电镜观察,发现rBV-Cap在sf9细胞中高效表达,衣壳蛋白可自组装形成与... 本研究根据鹅星状病毒(GoAstV)衣壳蛋白(Cap)基因序列,通过人工合成获得衣壳蛋白基因片段,并构建重组杆状病毒rBV-Cap。通过间接免疫荧光检测、Western Blot鉴定和透射电镜观察,发现rBV-Cap在sf9细胞中高效表达,衣壳蛋白可自组装形成与天然鹅星状病毒结构相似的病毒样颗粒。将纯化的衣壳蛋白免疫BALB/c小鼠,酶联免疫吸附试验(ELISA)和病毒噬斑减少中和试验结果表明,重组衣壳蛋白具有较好的免疫原性,可诱导小鼠产生高水平抗体。为进一步探究B细胞免疫应答特征,分别摘取对照小鼠和免疫后的小鼠脾脏组织,利用单细胞免疫谱测序技术对B细胞受体(BCR)组库进行测序分析。结果表明,对照小鼠BCR重链(H)-CDR3多肽链长度主要为13 aa,免疫后的小鼠BCR重链(H)-CDR3多肽链长度主要为14 aa。与对照相比,免疫后的小鼠免疫球蛋白G(IgG)数量和占比升高,表明Cap蛋白能够有效刺激小鼠产生IgG抗体。与对照相比,Cap蛋白免疫后的小鼠BCR组库多样性指数(D50值)降低,表明免疫后BCR多样性降低。但是免疫后的小鼠某些克隆型细胞数量增加,表明免疫会引起特定克隆型的扩增。对照小鼠对IGHV1、IGHV2、IGHV5基因的取用频率较高,而免疫后的小鼠对IGHV1、IGHV6、IGHV9基因的取用频率较高。对照小鼠和免疫后的小鼠对IGHJ基因的取用频率无显著差异。与对照相比,免疫后小鼠的IGHV7-3-IGHJ2配对和IGHV2-6-2-IGHJ2配对的频率增加。免疫后的小鼠体内存在IGHV2-2-IGHJ1和IGHV5-1-IGHJ1配对,而对照小鼠体内未检测到这2种类型的配对,表明Cap蛋白免疫导致小鼠V-J基因配对发生改变。本研究结果为基于B细胞表位的亚单位疫苗研发提供了理论支持。 展开更多
关键词 新型鹅星状病毒 衣壳蛋白 B细胞受体 互补决定区
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