黄病毒抗I型干扰素作用机制的研究进展 被引量：1

1

作者 赵慧 秦鄂德 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期473-475,共3页

关键词 干扰素Ⅰ型 黄病毒属

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西尼罗病毒Chin-01株5′非编码区(UTR)中复制相关元件的功能研究

2

作者 李晓峰 姜涛 +5 位作者 陈水平 韩剑峰 邓永强 秦成峰 于曼 秦鄂德 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期816-822,共7页

目的研究西尼罗病毒Chin-01株5′非编码区(UTR)中复制相关元件的功能,为探讨该病毒基因组复制的分子机制提供理论依据。方法通过生物信息学分析,初步筛选出Chin-01株5′UTR中可能的复制相关位点,并构建相应的重组亚基因组突变体,然后以... 目的研究西尼罗病毒Chin-01株5′非编码区(UTR)中复制相关元件的功能,为探讨该病毒基因组复制的分子机制提供理论依据。方法通过生物信息学分析,初步筛选出Chin-01株5′UTR中可能的复制相关位点,并构建相应的重组亚基因组突变体,然后以上此为模板,经体外RdRp活性分析及凝胶阻滞试验,观察NS5的RdRp活性及与突变体的结合能力,再将突变位点引入该病毒感染性全长cDNA克隆,初步观察突变体恢复病毒的生物学特性。结果5′UTR中第45-60位核苷酸缺失的突变体无法合成子链,与NS5的结合能力也显著降低。第8和9位核苷酸改变的突变体则丧失了合成子代RNA及与NS5的结合能力,第8、9、69和70位核苷酸突变后形成的结构恢复突变体则可以合成子链RNA,并可与NS5特异性结合。同时,第45-60位核苷酸缺失及第8和9位核苷酸突变的恢复病毒的增殖能力也显著降低。结论Chin-01株5′UTR中的第45-60位及第8、9、69和70位核苷酸维持的结构可能是该病毒基因组复制的关键位点。 展开更多

关键词 西尼罗病毒 5′非翻译区 病毒非结构蛋白质类

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鼠肝炎冠状病毒非结构蛋白1内保守序列LLRKxGxKG的功能研究

3

作者 林磊 吴晓燕 +1 位作者 常国辉 祝庆余 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期508-512,共5页

目的研究鼠肝炎冠状病毒(MHV)非结构蛋白1(NSP1)内的保守氨基酸序列LLRKxGxKG的功能。方法扩增并构建MHVNSP1正常基因及LLRKxGxKG序列缺失突变的NSP1基因,分别将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,获得真核表达质粒。用所构建的真核表达质... 目的研究鼠肝炎冠状病毒(MHV)非结构蛋白1(NSP1)内的保守氨基酸序列LLRKxGxKG的功能。方法扩增并构建MHVNSP1正常基因及LLRKxGxKG序列缺失突变的NSP1基因,分别将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,获得真核表达质粒。用所构建的真核表达质粒转染L929细胞,经新城疫病毒(NDV)刺激诱导后,采用ELISA法检测IFN-β的表达水平,观察NSP1正常或突变蛋白对IFN-β表达的影响。通过与含CAT和Luc报告基因的重组质粒进行共转染,观察NSP1正常或突变蛋白对IFN-β启动子活性和干扰素刺激应答元件(ISRE)活性的影响。通过与三种报告基因(pRLuc-CMV、pGL3-basic、pGL3-control)共转染,观察NSP1正常或突变蛋白对共转染基因表达的影响。结果MHVNSP1对真核细胞产生干扰素有一定的影响,并可显著抑制IFN-β启动子或ISRE应答元件的活性,且该抑制作用不受LLRKxGxKG序列缺失的影响。同时,MHVNSP1还可强烈抑制多种共转染报告基因的表达。该抑制作用在LLRKxGxKG序列缺失后显著降低。结论MHVNSP1对Ⅰ型干扰素信号通路有特异的抑制作用。LLRKxGxKG序列是MHVNSP1的一个重要功能域,在抑制共转染基因表达过程中发挥着重要作用。 展开更多

关键词 冠状病毒属 肝炎病毒 鼠 病毒非结构蛋白质类 保守序列

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小RNA对细菌生物膜形成的调控研究进展 被引量：1

4

作者 高肖芳 刘子中 +2 位作者 李文亮 杨瑞馥 韩延平 《军事医学》 CSCD 北大核心 2017年第6期530-533,542,共5页

小RNA在细菌的生长过程中发挥重要调控作用,在感受到外界信号,如营养物浓度、温度、pH值和渗透压的改变时,小RNA可通过影响靶标基因的表达以适应环境的变化。细菌由浮游状态向固体附着生长状态的转变过程中自身会产生一种细胞外基质,即... 小RNA在细菌的生长过程中发挥重要调控作用,在感受到外界信号,如营养物浓度、温度、pH值和渗透压的改变时,小RNA可通过影响靶标基因的表达以适应环境的变化。细菌由浮游状态向固体附着生长状态的转变过程中自身会产生一种细胞外基质,即生物膜,其主要由蛋白质、多糖和DNA组成。最新研究表明,小RNA在调控细菌生物膜形成的系统中发挥着重要的作用。小RNA通过与靶标mRNA碱基配对或与调节蛋白相互作用,在细菌生物膜形成中发挥调控作用。该文综述了小RNA对细菌生物膜形成的调控机制和途径,阐述了3种经典的小RNA调控细菌生物膜形成的模型,以及小RNA调控对细菌生物膜形成的研究现状和发展方向。 展开更多

关键词 小RNA 生物膜 C-DI-GMP

原文传递

基于神经氨酸酶活性检测的板蓝根品质的生物评价 被引量：57

5

作者 李寒冰 鄢丹 +4 位作者 王伽伯 王京燕 贝祝春 魏丽 肖小河 《药学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期162-166,共5页

采用流感病毒神经氨酸酶(NA)体外活性荧光检测法测定板蓝根的NA抑制生物活性,并建立板蓝根抗病毒生物效价检测方法。研究表明板蓝根具有抑制NA的活性,IC50=(0.90±0.20)mg·mL-1(相当于生药),其量效曲线形状与阳性对照药磷酸奥... 采用流感病毒神经氨酸酶(NA)体外活性荧光检测法测定板蓝根的NA抑制生物活性,并建立板蓝根抗病毒生物效价检测方法。研究表明板蓝根具有抑制NA的活性,IC50=(0.90±0.20)mg·mL-1(相当于生药),其量效曲线形状与阳性对照药磷酸奥司他韦相似,提示二者对NA的抑制可能具有相同的作用方式。采用"质反应平行线"法设计和优化的板蓝根抗病毒生物效价检测方法,重复性较好(RSD=5.78%),实际样品检测结果均能通过可靠检验(偏离直线P>0.05、偏离平行P>0.05)。研究结果表明,所建立的生物效价检测方法可以作为板蓝根品质生物评价的方法之一。 展开更多

关键词 板蓝根 抗病毒活性 神经氨酸酶 生物效价 品质评价

原文传递

实时荧光定量PCR检测莫氏立克次体 被引量：14

6

作者 杨晓 陈梅玲 +3 位作者 温博海 牛东升 孙长俭 李青凤 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期1054-1056,共3页

目的采用TaqMan-MGB探针建立检测莫氏立克次体的实时荧光定量PCR。方法依据莫氏立克次体外膜蛋白B基因(ompB)设计引物和探针,以克隆的ompB作模板建立实时荧光定量PCR方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线... 目的采用TaqMan-MGB探针建立检测莫氏立克次体的实时荧光定量PCR。方法依据莫氏立克次体外膜蛋白B基因(ompB)设计引物和探针,以克隆的ompB作模板建立实时荧光定量PCR方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.995);该方法能检出<10拷贝的莫氏立克次体DNA,敏感性为普通PCR的1000倍。用该方法检测莫氏立克次体DNA,结果为阳性,但是检测其他相关细菌DNA的结果均为阴性。用该方法检测莫氏立克次体感染豚鼠血标本,50%样本检测为阳性,而普通PCR检测结果均为阴性。结论该实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,适合于快速检测样本中微量莫氏立克次体DNA,可用于临床实验室快速确诊地方性斑疹伤寒。 展开更多

关键词 莫氏立克次体 实时定量PCR 外膜蛋白B基因 地方性斑疹伤寒

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日本脑炎病毒非结构蛋白NS5对IFN-α介导的信号转导通路的抑制作用 被引量：6

7

作者 赵慧 邓永强 +6 位作者 陈水平 姜涛 韩剑峰 李晓峰 于学东 秦成峰 秦鄂德 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期811-815,共5页

目的探讨日本脑炎病毒抑制IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路过程中发挥关键作用的病毒特异蛋白,为阐明日本脑炎病毒抑制Ⅰ型IFN介导的JAK-STAT信号转导通路的作用机制奠定基础。方法分别构建日本脑炎病毒编码的7种非结构蛋白基因(NS1,N... 目的探讨日本脑炎病毒抑制IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路过程中发挥关键作用的病毒特异蛋白,为阐明日本脑炎病毒抑制Ⅰ型IFN介导的JAK-STAT信号转导通路的作用机制奠定基础。方法分别构建日本脑炎病毒编码的7种非结构蛋白基因(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)的重组真核表达载体。采用间接免疫荧光法和Western blotting观察它们在细胞内的表达及定位情况。利用含萤火虫荧光素酶(Luc)报告基因的重组载体pISRE-Luc,观察表达病毒不同非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路的活化程度。构建融合表达红色荧光蛋白的STAT1重组真核表达载体pRed-STAT1,利用该重组载体在表达病毒非结构蛋白的细胞内观察融合蛋白Red-STAT1在IFN-α作用下的细胞内定位情况。同时,对表达病毒非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的STAT1分子的磷酸化水平进行检测。结果日本脑炎病毒的7种非结构蛋白均可在哺乳动物细胞内正确表达,而且表达蛋白均位于细胞质中。在这7种非结构蛋白中,NS5可阻断STAT1分子的核转运及抑制STAT1分子的磷酸化水平,从而抑制IFN-α介导的细胞内JAK-STAT信号转导通路的活化。结论日本脑炎病毒的非结构蛋白NS5对Ⅰ型IFN系统的信号转导通路具有显著的抑制作用,可能是一种Ⅰ型IFN系统的拮抗蛋白。 展开更多

关键词 干扰素Ⅰ型 JAK-STAT信号转导通路 脑炎病毒 日本 病毒非结构蛋白质类

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添加扩增内标的PCR方法快速检测食品中的阪崎克罗诺杆菌 被引量：7

8

作者 张德福 赵禹宗 +5 位作者 张明 仪淑敏 赵文竹 汤轶伟 李春 励建荣 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期49-52,58,共5页

为了解决常规PCR方法检测阪崎克罗诺杆菌时因检测过程中环境和食品理化因素的影响而导致的假阴性结果的产生,本研究以细菌16S rRNA基因为扩增内标对照,以阪崎克罗诺杆菌特异性基因grx B为靶基因设计了一对特异性引物,并通过优化PCR反应... 为了解决常规PCR方法检测阪崎克罗诺杆菌时因检测过程中环境和食品理化因素的影响而导致的假阴性结果的产生,本研究以细菌16S rRNA基因为扩增内标对照,以阪崎克罗诺杆菌特异性基因grx B为靶基因设计了一对特异性引物,并通过优化PCR反应条件,最终建立了一种添加扩增内标的阪崎克罗诺杆菌PCR检测方法,可以指示PCR过程中因存在DNA聚合酶抑制剂而导致的假阴性结果。通过对20种细菌进行PCR检测显示,该方法对阪崎克罗诺杆菌具有良好的特异性。灵敏度实验结果表明,该检测方法对阪崎克罗诺菌纯DNA模板的检测灵敏度为2.15×102fg/μL,对阪崎克罗诺杆菌纯培养物的检测灵敏度为9.4×103CFU/m L。对人工污染婴幼儿奶粉的检测结果显示,阪崎克罗诺杆菌接种量为0.94 CFU/g的婴幼儿奶粉样品经过8 h增菌培养后,即可检出。食品样品检测结果表明,不添加扩增内标的PCR检测方法中出现的假阴性结果可被本方法检出。该检测方法特异性强、灵敏度较高,能消除阪崎克罗诺杆菌常规PCR检测方法中可能出现的假阴性结果,适用于婴幼儿配方乳粉、乳制品等食品中阪崎克罗诺杆菌的快速检测。 展开更多

关键词 阪崎克罗诺杆菌 扩增内标 假阴性 PCR检测

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结核分枝杆菌RD-1区编码蛋白的结构和功能 被引量：8

9

作者 李浩 徐俊杰 陈薇 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1260-1266,共7页

RD-1(region of difference-1)被认为在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的致病机理中起着关键的作用.RD-1基因全长9.5kb,开放读码框从Rv3871～Rv3879c,分别编码9种不同的蛋白质.RD-1区在卡介苗(bacillusCalmette-Guerin,B... RD-1(region of difference-1)被认为在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的致病机理中起着关键的作用.RD-1基因全长9.5kb,开放读码框从Rv3871～Rv3879c,分别编码9种不同的蛋白质.RD-1区在卡介苗(bacillusCalmette-Guerin,BCG)中是缺失的.研究结果显示,RD-1区是结核分枝杆菌的主要毒力因素之一,同时RD-1区参与了一种新的分泌系统ESX-1,这种分泌系统能够促进某些特定蛋白的分泌.ESX-1分泌的两种主要蛋白质CFP-10(culture filtrateprotein of10ku)和ESAT-6(early secreted antigenic target of6ku)能够形成牢固的1∶1的复合体,这两种蛋白质能够协同分泌而且能够引起T细胞反应,并可能作为理想的靶抗原在结核的预防和诊断中发挥作用. 展开更多

关键词 结核分枝杆菌(MTB) RD-1区 CFP-10 ESAT-6

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西尼罗病毒Chin-01株基因组非编码区的序列测定及分析 被引量：2

10

作者 李晓峰 姜涛 +5 位作者 陈水平 韩剑峰 邓永强 秦成峰 于曼 秦鄂德 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期829-832,共4页

目的对西尼罗病毒(WNV)Chin-01株基因组非编码区(UTR)序列进行测定,了解其与已报道毒株的序列差异及系统发育关系。方法采用5′和3′RACE法对Chin-01株病毒基因组的UTR进行RT-PCR扩增,测定扩增产物序列,采用DNAstar软件对该株及其他9株... 目的对西尼罗病毒(WNV)Chin-01株基因组非编码区(UTR)序列进行测定,了解其与已报道毒株的序列差异及系统发育关系。方法采用5′和3′RACE法对Chin-01株病毒基因组的UTR进行RT-PCR扩增,测定扩增产物序列,采用DNAstar软件对该株及其他9株WNV的UTR进行序列同源性分析,同时构建了基于3′UTR的系统发育树,并用RNA structure软件预测其二级结构。结果Chin-01株基因组5′和3′UTR分别为96nt和630nt,序列同源性分析的结果表明,其5′UTR与其他9株的同源性均达到99%或100%,而3′区UTR与埃及Eg101株的同源性最高,达98·1%。5′UTR的起始核苷酸为AG,并含有一段与3′UTR互补的14nt序列。3′UTR的末端为CUOH,包含一段完全保守的5nt序列,以及三个保守的称为CS2、RCS2和CS1的基序。二级结构预测发现,Chin-01株5′UTR呈长茎环结构,3′UTR的3′端也可形成多个保守的茎环结构。结论Chin-01株与埃及Eg101株亲缘关系最为密切。 展开更多

关键词 西尼罗病毒 非翻译区 序列分析 蛋白质结构 二级

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2009年重庆地区手足口病病毒分离鉴定 被引量：4

11

作者 蔡丽君 王均 +1 位作者 常国辉 许红梅 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期594-597,共4页

目的：对2009年2-4月重庆地区流行的手足口病（Hand-food-and-mouth disease,HFMD）病原进行分离鉴定,以调查本地区HFMD流行病原学情况。方法：采集47例手足口患儿脑脊液、疱疹液、粪便、咽拭子、肛拭子共100份标本,分别接种于人横纹肌... 目的：对2009年2-4月重庆地区流行的手足口病（Hand-food-and-mouth disease,HFMD）病原进行分离鉴定,以调查本地区HFMD流行病原学情况。方法：采集47例手足口患儿脑脊液、疱疹液、粪便、咽拭子、肛拭子共100份标本,分别接种于人横纹肌肉瘤细胞（Human rhabdomyosarcoma,RD）中进行病毒分离培养,对出现细胞病变（Cytopathic effect,CPE）的细胞上清,分别用肠道病毒通用引物、EV71属特异性引物和柯萨奇A16属特异性引物进行RT-PCR检测,并对PCR产物进行回收克隆测序鉴定,以确定本次疫情中肠道病毒（Enteroviruses,EV）的病原,将测序结果用生物学软件Bioedit同国际代表BrCr株进行序列比对及同源性相关分析,以鉴定此毒株遗传变异情况。结果：在处理后的100份HFMD患儿临床标本的细胞培养中,有份观察到明显的细胞病变,通过RT-PCR检测有7份呈肠道通用引物阳性,EV71特异性引物检测有3份呈阳性结果,而CA1特异性引物检测结果均为阴性,这3份EV71阳性临床标本来自2例门诊患儿和1例临床诊断疑似病例患儿,其PCR产物测序结果也证实为EV71病毒。结论：重庆地区2-4月发生的HFMD疫情主要是由EV71型引起的。 展开更多

关键词 手足口病 肠道病毒71型 分离鉴定

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TBEV对人神经细胞致病性的实验研究 被引量：1

12

作者 魏婧靖 李裕昌 +7 位作者 吴晓燕 司炳银 张雨 李靖 户义 祝庆余 杨银辉 康晓平 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期415-418,共4页

目的确定蜱传脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus，TBEV）对人神经母瘤细胞的感染性及复制增殖情况。方法将TBEV感染人神经母瘤细胞SK－N－SH，取不同时间点的细胞培养上清，分别采用real－timeRT－PCR方法及空斑测定的方法测定... 目的确定蜱传脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus，TBEV）对人神经母瘤细胞的感染性及复制增殖情况。方法将TBEV感染人神经母瘤细胞SK－N－SH，取不同时间点的细胞培养上清，分别采用real－timeRT－PCR方法及空斑测定的方法测定病毒滴度，以确定TBEV在SK－N－SH细胞中的复制增殖情况；同时进行细胞形态观察及免疫荧光检测，以确定TBEV感染后的SK－N－SH细胞形态变化。结果TBEV感染SK－N－SH细胞后，可进行大量复制增殖，感染后3d，病毒滴度达到峰值，可达2．92×10＾7PFU／ml，感染细胞产生明显的形态改变，免疫荧光法可检测到细胞内的病毒粒子。结论TBEV可在人神经母瘤细胞SK－N－SH中大量复制增殖，并可造成细胞明显的形态改变，因此人神经母瘤细胞SK-N-SH可以作为TBEV培养良好的细胞模型。 展开更多

关键词 蜱传脑炎病毒 神经细胞 致病性

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基于FRET构建A型肉毒毒素活性检测的高通量方法 被引量：1

13

作者 罗森 郭丽娜 +2 位作者 李涛 王琴 王慧 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2023年第1期15-21,共7页

目的利用荧光共振能量转移(FRET)构建针对A型肉毒毒素酶活性检测的高通量体外方法。方法构建只识别A型肉毒毒素的基于双荧光标记底物的重组表达质粒,将其构建的质粒转入大肠杆菌表达系统进行表达,对表达后的荧光标记底物重组蛋白进行纯... 目的利用荧光共振能量转移(FRET)构建针对A型肉毒毒素酶活性检测的高通量体外方法。方法构建只识别A型肉毒毒素的基于双荧光标记底物的重组表达质粒,将其构建的质粒转入大肠杆菌表达系统进行表达,对表达后的荧光标记底物重组蛋白进行纯化和透析并保存备用;利用A型肉毒毒素轻链(ALc)对重组蛋白进行酶切检测活性;对本检测方法的条件进行优化;ALc切割荧光标记底物测定其酶动力学参数K_(m)与K_(cat)值。结果重组表达质粒构建成功,通过大肠杆菌表达系统表达后检测明显出现目的条带,对其纯化后获得的重组蛋白纯度在90%左右,命名重组蛋白为CYA。对CYA通过酶ALc、B型肉毒毒素轻链(BLc)进行酶切鉴定,结果显示CYA只能被ALc酶切产生与预期相符的两个蛋白片段,不能被BLc酶切。对基于FRET底物的条件优化得到:设定滤光片灵敏度在65~110之间;实时动态检测间隔为2 min/次,动态检测时间为30~120 min,底物CYA合适的浓度范围0.5~32μmol/L。CYA在ALc酶作用下随时时间的变化与荧光值528与485的比值作图最小在0.5左右,最大时约为0.9。酶动力学参数测定ALc切割CYA的值K_(cat)值为(5±0.4)s^(-1)和K_(m)为(2.33±0.21)μmol/L。结论成功构建了基于FRET技术的A型肉毒毒素活性检测的高通量体外分析方法。 展开更多

关键词 FRET 肉毒毒素 高通量检测

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应用细胞模型初筛抗人免疫缺陷病毒药物

14

作者 庄道民 刘思扬 +2 位作者 董如华 李国跃 李敬云 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期411-416,共6页

目的探讨采用已建立的细胞模型初筛抗人免疫缺陷病毒(HIV)药物的可靠性。方法以齐多夫定为阳性对照,使用HIV-1急性感染系统(MT-4/HIV-1ⅢB)、HIV-1耐药性毒株系统(MT-4/3TC耐药株)、HIV-1慢性感染系统(H9/HIV-1ⅢB)和HIV-1临床分离株感... 目的探讨采用已建立的细胞模型初筛抗人免疫缺陷病毒(HIV)药物的可靠性。方法以齐多夫定为阳性对照,使用HIV-1急性感染系统(MT-4/HIV-1ⅢB)、HIV-1耐药性毒株系统(MT-4/3TC耐药株)、HIV-1慢性感染系统(H9/HIV-1ⅢB)和HIV-1临床分离株感染系统(PBMC/HIV-1GX02),分别测定药物的细胞毒性和抗HIV-1活性,计算药物的半数细胞毒性浓度(TC50)、半抑制浓度(IC50)和治疗指数(TI)。同时对4种药物DPC961、牛膝多糖、艾乃吉1号和痰热清注射液进行了抗HIV活性检测。结果测定了齐多夫定在4种细胞-病毒系统的TC50,IC50和TI与文献报道相近。DPC961在4种细胞/病毒培养系统的TI分别为979,5348,3912和2745;牛膝多糖分别为323,223,2777和173;艾乃吉1号仅在MT-4/HIV-1ⅢB模型上T1为2.6。结论使用本细胞模型通过检测药物的TC50,IC50及TI进行药物初筛是可靠的。药物DPC961、牛膝多糖和艾乃吉Ⅰ号具有不同程度的体外抗HIV-1活性,痰热清注射液未检测到抗HIV-1活性。 展开更多

关键词 模型 细胞 药物评价 临床前 HIV-1 抗HIV药

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登革4型病毒5′非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用

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作者 于学东 姜涛 +8 位作者 陈水平 邓永强 韩剑峰 赵慧 李晓峰 刘然 于曼 秦成峰 秦鄂德 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期806-810,共5页

目的探讨登革4型病毒5′非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用。方法首先通过mfold3·2软件对登革4型病毒5′端RNA二级结构进行预测,确定了3个突变位点:SLB1,缺失位于短茎环82-87位5′UAR环化序列,并破坏其保守茎环结构;SLB2... 目的探讨登革4型病毒5′非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用。方法首先通过mfold3·2软件对登革4型病毒5′端RNA二级结构进行预测,确定了3个突变位点:SLB1,缺失位于短茎环82-87位5′UAR环化序列,并破坏其保守茎环结构;SLB2,在次环引入突变破坏其环状结构(M77G/C);SLB3,突变仅涉及核苷酸,不破坏该次环二级结构(M77-78AG/GA)。然后在含有海肾荧光素酶(Renilla Luciferase,R·luc)报告基因的复制子(DEN-R·luc2A-RP)基础上,利用重叠PCR构建上述突变体。将突变体(包括相关的阳性和阴性对照复制子)分别线性化并体外转录成RNA后,取等量各转录体RNA,以脂质体法分别转染BHK-21细胞。通过间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR、R·luc报告基因技术和实时定量RT-PCR对突变体的复制和翻译水平进行检测。结果SLB1突变体的翻译水平并未受到显著影响,但其复制水平出现显著下调。SLB2突变体的翻译水平亦未受到显著影响,但其复制水平受到完全抑制;SLB3突变体的复制和翻译水平均受到了完全抑制。结论登革4型病毒5′非编码区SLB元件对基因组RNA复制和翻译具有重要的调控作用。 展开更多

关键词 登革热病毒 复制子 基因 报告 病毒复制 翻译

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登革1型病毒广州2006年分离株的基因组特征与进化分析

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作者 韩剑峰 于曼 +4 位作者 陈水平 姜涛 李晓峰 秦成峰 秦鄂德 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期1055-1058,共4页

目的对2006年分离自广州登革热患者血清的4株登革1型病毒(GZ57/06、GZ63/06、GZ69/06和GZ128/06)进行全基因组序列测定,并同其他毒株序列进行比对分析,以了解其基因组序列特征及可能的传播来源。方法将登革1型病毒分离株基因组分为9个... 目的对2006年分离自广州登革热患者血清的4株登革1型病毒(GZ57/06、GZ63/06、GZ69/06和GZ128/06)进行全基因组序列测定,并同其他毒株序列进行比对分析,以了解其基因组序列特征及可能的传播来源。方法将登革1型病毒分离株基因组分为9个片段进行RT-PCR扩增,5′与3′末端序列采用RACE法扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序。通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析。结果测序获得的4株广州登革1型病毒基因组全长均为10735核苷酸(nt),编码3393个氨基酸。5′和3′端各有一段非编码区,长度分别为94nt和462nt。4株病毒的编码区与非编码区核苷酸及氨基酸序列存在一些差异,其中GZ57/06、GZ63/06和GZ69/06毒株的基因组核苷酸和氨基酸序列同源性均在99%以上,而GZ128/06株变异较其他3株大,编码区差异尤其明显。序列比对分析表明,GZ57/06、GZ63/06和GZ69/06毒株均与泰国2001年分离毒株ThD1/0049/01和ThD1/0102/01同源性最高,而GZ128/06毒株与缅甸1998年分离毒株D1.Myanma.r31987/98同源性最高。这些新分离毒株与东南亚毒株属于同一基因型。结论新分离毒株可能来自泰国等东南亚国家和地区,不同毒株表型差异可能与其基因组特征具有密切关系。 展开更多

关键词 登革热病毒 基因组 病毒 序列分析 进化 分子

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登革1型病毒NS1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 被引量：1

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作者 梅竹 邓永强 +4 位作者 曹飞 于曼 朱舜亚 秦成峰 秦鄂德 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期659-661,共3页

目的重组表达登革1型病毒NS1蛋白并制备多克隆抗体。方法通过RT-PCR扩增编码登革1型病毒NS1蛋白的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)后经酶切测序鉴定,获得重组质粒pET-NS1。进一步使用IPTG诱导表达,经免疫印迹鉴定后,采用蛋... 目的重组表达登革1型病毒NS1蛋白并制备多克隆抗体。方法通过RT-PCR扩增编码登革1型病毒NS1蛋白的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)后经酶切测序鉴定,获得重组质粒pET-NS1。进一步使用IPTG诱导表达,经免疫印迹鉴定后,采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中纯化回收融合蛋白,并通过透析对目的蛋白进行复性;纯化复性后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光法测定抗体效价。结果成功构建了高效表达登革1型病毒NS1蛋白的原核表达载体,表达的重组NS1蛋白占菌体蛋白总量的50%以上,以包涵体形式存在;免疫印迹表明表达的重组NS1蛋白能够为登革病毒兔抗血清识别,纯化后纯度可达95%以上;免疫小鼠后获得了效价>1∶1000的抗登革病毒NS1蛋白的鼠多克隆抗体。结论原核表达的重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,诱导产生的多克隆抗体能够有效识别天然NS1蛋白,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体的生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 登革热病毒 病毒非结构蛋白质类 重组表达 抗体

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猪链球菌胞壁蛋白SSU05_0272对人脑微血管内皮细胞β-catenin的调控 被引量：1

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作者 陈哲 郑玉玲 +3 位作者 郝淮杰 律清宇 姜永强 吕淑霞 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期500-502,共3页

目的:研究猪链球菌细胞壁蛋白SSU05_0272对人脑微血管内皮细胞β-catenin的调控。方法:采用免疫荧光、实时定量PCR、Western blot等方法从基因转录和表达水平研究SSU05_0272对人脑微血管内皮细胞β-catenin的调控。结果:实时定量PCR结... 目的:研究猪链球菌细胞壁蛋白SSU05_0272对人脑微血管内皮细胞β-catenin的调控。方法:采用免疫荧光、实时定量PCR、Western blot等方法从基因转录和表达水平研究SSU05_0272对人脑微血管内皮细胞β-catenin的调控。结果:实时定量PCR结果显示SSU05_0272蛋白能下调β-catenin在人脑微血管内皮细胞中的表达;免疫荧光和免疫印迹结果也显示,SSU05_0272蛋白能下调β-catenin在人脑微血管内皮细胞中的含量。结论:SSU05_0272调控人脑微血管内皮细胞β-catenin的表达。 展开更多

关键词 猪链球菌 人脑微血管内皮细胞 SSU05_0272 Β-CATENIN

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含有CRISPR序列的噬菌体耐受菌的筛选 被引量：1

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作者 滑玉会 黄勇 +5 位作者 张志毅 安小平 米志强 尹秀云 陈建魁 童贻刚 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2014年第6期833-836,共4页

人工设计合成规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)序列特异性引物,将从临床分离的大肠埃希菌株作为模板,采用PCR扩增方法筛选含有CRISPR系统的大肠埃希菌;利用噬菌斑法从医院未经消毒处理的污水中分离大肠埃希菌噬菌体,经过PEG沉淀的方法... 人工设计合成规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)序列特异性引物,将从临床分离的大肠埃希菌株作为模板,采用PCR扩增方法筛选含有CRISPR系统的大肠埃希菌;利用噬菌斑法从医院未经消毒处理的污水中分离大肠埃希菌噬菌体,经过PEG沉淀的方法浓缩得到高滴度的噬菌体,再用该筛选噬菌体感染上述含有CRISPR的大肠埃希菌以筛选耐受该噬菌体的大肠埃希菌菌株。最后从70株大肠埃希菌中筛选到42株含有CRISPR序列的菌株,然后采用噬菌斑法分离到1株大肠埃希菌E.coli 147-30的裂解性噬菌体IME-EC1,在此基础上利用E.coli 147-30筛选到1株耐受噬菌体IME-EC1的大肠埃希菌菌株,命名为E.coli 147-30R1。 展开更多

关键词 CRISPR系统 大肠埃希菌 噬菌体 噬菌体耐受

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流感病毒灭活疫苗研究进展 被引量：4

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作者 吕进 王希良（审校者） 《国际免疫学杂志》 CAS 2007年第2期125-128,F0003,共5页

流感病毒灭活疫苗白1945年在美国首先获准上市以来，已广泛应用于临床。但由于其不能刺激机体产生分泌型免疫球蛋白A（sIgA）的粘膜免疫保护作用；制备过程严重依赖于鸡胚；接种途径单一；以及不同型别间交叉免疫保护效果较差等缺点，... 流感病毒灭活疫苗白1945年在美国首先获准上市以来，已广泛应用于临床。但由于其不能刺激机体产生分泌型免疫球蛋白A（sIgA）的粘膜免疫保护作用；制备过程严重依赖于鸡胚；接种途径单一；以及不同型别间交叉免疫保护效果较差等缺点，限制了其应用范围。我国白2005年7月1日起禁止肌肉注射免疫中使用铝盐佐剂，为流感病毒灭活疫苗的研究提出了新的课题——提高流感病毒灭活疫苗的安全性、有效性，以应对流感的暴发流行。 展开更多

关键词 流感病毒 灭活疫苗 粘膜佐剂

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