癌相关成纤维细胞的特性及其调控肿瘤进程的研究进展

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作者 万令飞 杨慧 +4 位作者 葛晨 刘蕴慧 岳文 裴雪涛 阎新龙 《生物技术通讯》 CAS 2020年第1期75-82,共8页

肿瘤组织是由恶性上皮细胞及其周围的基质细胞微环境形成的复杂混合体。在肿瘤的发生发展过程中,肿瘤细胞与肿瘤微环境相互作用相互影响,其中癌相关成纤维细胞(CAF)是肿瘤微环境的重要组成部分。CAF不仅促进肿瘤细胞的增殖与转移、肿瘤... 肿瘤组织是由恶性上皮细胞及其周围的基质细胞微环境形成的复杂混合体。在肿瘤的发生发展过程中,肿瘤细胞与肿瘤微环境相互作用相互影响,其中癌相关成纤维细胞(CAF)是肿瘤微环境的重要组成部分。CAF不仅促进肿瘤细胞的增殖与转移、肿瘤微血管生成以及耐药性产生,还能抑制机体的抗肿瘤免疫,从而促进肿瘤的恶性进展。本文简要综述癌相关成纤维细胞的特性及其在调控肿瘤发生发展中的作用。 展开更多

关键词 癌相关成纤维细胞 肿瘤微环境 靶向治疗

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过表达Miro1慢病毒载体的构建及Miro1高表达间充质干细胞稳定转染细胞株的建立与鉴定

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作者 陈镜伊 赵玲萍 +2 位作者 刘雯丽 习佳飞 梁志欣 《解放军医学院学报》 CAS 北大核心 2023年第4期408-416,共9页

背景线粒体转移是干细胞发挥免疫修复功能的重要机制之一,Miro1是线粒体转移过程的关键蛋白,但其动力学研究欠缺研究模型。目的构建过表达Miro1的间充质干细胞稳转细胞株,为线粒体动力学研究间充质干细胞的抗炎修复机制提供细胞模型。... 背景线粒体转移是干细胞发挥免疫修复功能的重要机制之一,Miro1是线粒体转移过程的关键蛋白,但其动力学研究欠缺研究模型。目的构建过表达Miro1的间充质干细胞稳转细胞株,为线粒体动力学研究间充质干细胞的抗炎修复机制提供细胞模型。方法通过PCR扩增目的基因后进行Gibson反应、转化及Gateway等方法构建载体,并对载体进行酶切鉴定。慢病毒感染间充质干细胞后,使用嘌呤霉素进行药物筛选获得稳转细胞株。后续分为三组进行相关鉴定。(1)BMSC组:正常间充质干细胞;(2)Con-BMSC组:慢病毒空载体感染的间充质干细胞;(3)Miro^(Hi)-BMSC组:过表达Miro1的慢病毒载体感染的间充质干细胞。通过RT-qPCR、Western blot检测上述三组细胞Miro1的表达水平,并进行划痕试验、水平迁移实验、成骨及成脂诱导分化以鉴定干细胞特性。结果所构建的载体完成酶切鉴定,并成功获得过表达Miro1重组慢病毒载体pLV-EGFP:T2A:Puro-EF1A>mRhot1/HA。经m RNA和蛋白水平检测,Miro^(Hi)-BMSC组的Miro1表达高于BMSC组和Con-BMSC组(P<0.05),干细胞水平、垂直迁移能力三组间差异无统计学意义(P>0.05),三组干细胞均可成功进行成脂及成骨诱导分化。结论通过慢病毒载体成功构建Miro1Hi-BMSCs稳转细胞株,且该稳转株仍保留干细胞特性,可用于间充质干细胞调控线粒体转移的相关研究。 展开更多

关键词 Miro1蛋白 慢病毒载体 间充质干细胞 线粒体 细胞接触依赖性转移

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胚胎干细胞来源的拟血岛巨噬细胞对红细胞分化的促进作用 被引量：1

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作者 李璇 王晓玲 +12 位作者 崔甜甜 范增 赵玲萍 颜颢 徐振钊 何丽娟 周军年 王海洋 张彪 曾泉 习佳飞 岳文 裴雪涛 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期1180-1189,共10页

目的探索胚胎干细胞体外向红细胞诱导分化过程中出现的拟血岛结构中巨噬细胞的表型,以及拟血岛巨噬细胞对红细胞分化的作用。方法利用单细胞聚团拟胚体(Spin-EB)方法诱导人胚胎干细胞向红细胞分化,流式细胞术和成像流式细胞术分析诱导... 目的探索胚胎干细胞体外向红细胞诱导分化过程中出现的拟血岛结构中巨噬细胞的表型,以及拟血岛巨噬细胞对红细胞分化的作用。方法利用单细胞聚团拟胚体(Spin-EB)方法诱导人胚胎干细胞向红细胞分化,流式细胞术和成像流式细胞术分析诱导体系中红系细胞和巨噬细胞特征标志物的表达及细胞形态,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测红系及巨噬细胞特征标记基因在转录水平的表达情况,利用免疫荧光染色鉴定拟血岛巨噬细胞的表型,并分析拟血岛巨噬细胞对红系细胞分化的作用。结果吉姆萨染色结果显示,胚胎干细胞体外诱导过程中出现了类似于体内红细胞发育中的血岛结构;免疫荧光染色显示,此拟血岛结构为红系细胞(CD235a)围绕在巨噬细胞(CD68)的周围。该拟血岛巨噬细胞表型为CD45+CD235a+CD163+CD169+CD106+(比例为0.092%±0.013%),与体内血岛巨噬细胞相似,流式细胞术结果亦表明CD45+CD235a+CD163+CD106+CD169+的血岛巨噬细胞被CD235a+红系细胞包围。去除拟血岛结构后诱导所得CD71+CD235a+细胞占比为37.37%±1.68%,明显低于未处理组(46.97%±4.16%,P<0.05)。免疫荧光染色结果显示,CD169+巨噬细胞周围的红系细胞表达CD43。结论胚胎干细胞体外红系诱导体系中可形成与体内血岛类似的拟血岛样结构,拟血岛巨噬细胞可能通过CD169与CD43的相互作用促进体外红细胞分化。 展开更多

关键词 胚胎干细胞 巨噬细胞 体外诱导 红细胞 拟血岛

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生物制造领域的机遇与挑战:发展类器官构建及培养的新技术 被引量：3

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作者 王思涵 裴雪涛 李艳华 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期312-319,共8页

类器官构建及培养技术是近年来新兴的前沿性科学技术,该技术已经被广泛用到组织器官发育、疾病发病机制、药物开发和再生医学等领域的研究之中。干细胞及组织器官发育分化调控的研究成果为类器官构建及培养技术的建立提供了重要的信息... 类器官构建及培养技术是近年来新兴的前沿性科学技术,该技术已经被广泛用到组织器官发育、疾病发病机制、药物开发和再生医学等领域的研究之中。干细胞及组织器官发育分化调控的研究成果为类器官构建及培养技术的建立提供了重要的信息。体外借助细胞外基质成分及细胞因子等构建出适宜于干细胞增殖、分化的三维微环境是类器官构建及培养技术的核心。在适宜的微环境中,干细胞及其分化的多种类型细胞可通过自组织形成与体内相应组织结构和功能相似的类器官。当前,多种类型的类器官构建及培养技术虽然得到广泛应用,但其技术体系仍具有操作的复杂性、产量的不确定性及获得的类器官结构和功能与体内组织存在较大差异性等难题。生物制造领域先进技术的引入推动了类器官技术的发展。本文将综述基质成分与细胞因子构建的三维微环境的研究进展,并讨论生物制造领域的先进技术在类器官构建与培养技术中的应用,例如微孔限定的培养技术可以控制类器官的生长发育,能用于制备大小均一及生物学特性相似的类器官;图案化技术使细胞按图案特征响应性地增殖与分化,可以精准控制类器官的生成;三维生物打印技术可以精确组装各类细胞,有助于构建具有复杂结构和区域特异性的类器官。类器官构建及培养技术是一个新兴的多学科交叉的创新技术,但是还应该看到其技术体系仍有待进一步改进及提升,以获得可准确展现体内相应组织器官结构和功能的类器官。 展开更多

关键词 类器官 三维微环境 干细胞 生物制造

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低剂量电离辐射对小鼠小肠类器官生物学特性的影响及二甲双胍对其辐射损伤的防护作用 被引量：1

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作者 宋妃灵 王思涵 +4 位作者 林小松 张博文 何丽娟 裴雪涛 李艳华 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS 北大核心 2021年第5期336-344,共9页

目的研究低剂量电离辐射(LDIR)对小鼠小肠类器官生物学特性的影响,并观察二甲双胍对其辐射损伤的防护作用。方法体外分离C57BL/6小鼠小肠隐窝,培养4 d后获得小鼠小肠类器官,进行100 mGy单次γ射线照射(100 mGy×1)或100 mGy 4次γ... 目的研究低剂量电离辐射(LDIR)对小鼠小肠类器官生物学特性的影响,并观察二甲双胍对其辐射损伤的防护作用。方法体外分离C57BL/6小鼠小肠隐窝,培养4 d后获得小鼠小肠类器官,进行100 mGy单次γ射线照射(100 mGy×1)或100 mGy 4次γ射线照射(100 mGy×4),分别建立小肠类器官单次或多次LDIR模型,于末次照射后第3天,通过形态学分析检测小肠类器官的出芽数量和表面积。小肠类器官多次LDIR模型于末次照射后2 h,分离单个细胞,通过γ-H2AX免疫荧光染色分析小肠类器官细胞核内γ-H2AX焦点数。进行二甲双胍预处理多次LDIR模型(二甲双胍+100 mGy×4),即在每次照射前2 h向小肠类器官培养基中加二甲双胍1 mmol·L^(-1),末次照射后第3天或末次照射后2 h,分别检测小肠类器官的出芽数量和表面积及细胞核内γ-H2AX焦点数。结果成功建立了小鼠小肠类器官单次和多次LDIR模型。形态学分析结果显示,与对照组相比,单次LDIR模型组小肠类器官的出芽数量和表面积无明显差异;多次LDIR模型组小肠类器官的出芽数量和表面积明显减少(P<0.01)。免疫荧光染色结合共聚焦成像分析结果显示,与对照组相比,多次LDIR后模型组小肠类器官细胞核内γ-H2AX焦点数明显增多(P<0.01)。与多次LDIR模型组相比,二甲双胍+100 mGy×4组小肠类器官的出芽数量和表面积均明显增加(P<0.01),且细胞核内γ-H2AX焦点数明显减少(P<0.01)。结论单次LDIR对小肠类器官生长无明显影响。多次LDIR可延缓小鼠小肠类器官生长发育,造成肠上皮细胞DNA损伤。二甲双胍对小鼠小肠类器官多次LDIR损伤具有防护作用。 展开更多

关键词 小肠类器官 电离辐射 DNA损伤 二甲双胍

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逆转录病毒介导的稳定表达E4orf1和绿色荧光蛋白的胎肝窦内皮细胞株的建立 被引量：1

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作者 李慧琳 谢小燕 +8 位作者 王思涵 韩毅 范增 白云 何丽娟 南雪 裴海云 岳文 裴雪涛 《生物技术通讯》 CAS 2018年第4期451-458,共8页

目的:为构建优化的内皮细胞用于造血干细胞(HSCs)的支持培养,通过逆转录病毒载体系统建立稳定表达腺病毒E4区开放读框1(E4orf1)和绿色荧光蛋白(GFP)的人胎肝窦内皮细胞(HFLSECs)株。方法:利用Plat-A细胞将质粒MSCV-N E4orf1和p MX-GFP... 目的:为构建优化的内皮细胞用于造血干细胞(HSCs)的支持培养,通过逆转录病毒载体系统建立稳定表达腺病毒E4区开放读框1(E4orf1)和绿色荧光蛋白(GFP)的人胎肝窦内皮细胞(HFLSECs)株。方法:利用Plat-A细胞将质粒MSCV-N E4orf1和p MX-GFP分别包装为逆转录病毒,共同感染HFLSECs,将原代培养的HFLSECs和转基因的HFLSECs分别在含有0.5、1、2、4μg/m L嘌呤霉素的EGM-2培养基中培养,以测试最适药物筛选浓度,药筛1周后通过流式细胞分选获得稳定转染E4orf1的GFP^+HFLSECs(E4orf1-GFP/HFLSECs)。通过密度梯度离心法从脐带血中分离单个核细胞,利用免疫磁柱分选获得CD34^+造血干/祖细胞(HSPCs),以E4orf1-GFP/HFLSECs作为饲养层联合SCF、TPO、Flt-3L等3种基础造血相关因子进行体外扩增和半固体造血细胞集落培养。结果:0.5μg/m L嘌呤霉素在5 d内即能完全杀死HFLSECs,而转基因的HFLSECs可以正常存活,以此药物浓度加压筛选1周,后续通过流式分选GFP阳性细胞,阳性率为90.5%,在E4orf1-GFP/HFLSECs饲养层支持下,人脐带血来源的CD34^+细胞15 d扩增了360倍,是单纯细胞因子悬浮培养组的2.2倍,且扩增后的HSPCs在体外仍具有多种造血集落形成能力。结论:该细胞株的建立将为构建造血干细胞体外培养体系及研究造血细胞的发育分化提供适宜的微环境。 展开更多

关键词 肝窦内皮细胞 逆转录病毒 腺病毒E4区开放读框1(E4orf1) 造血干细胞

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AFT024细胞对人胚胎干细胞来源造血祖细胞的体外维持作用研究

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作者 朱美琪 张博文 +6 位作者 吴旭敏 李基晟 宋妃灵 范增 何丽娟 裴雪涛 李艳华 《军事医学》 CAS 2022年第8期561-568,共8页

目的建立小鼠胎肝基质细胞系AFT024细胞与人胚胎干细胞(hESC)来源造血祖细胞共培养体系,探究AFT024细胞对hESC来源造血祖细胞体外特性维持和扩增作用。方法建立hESC向造血祖细胞定向诱导分化的培养体系,采用拟胚体诱导方法,分三阶段添... 目的建立小鼠胎肝基质细胞系AFT024细胞与人胚胎干细胞(hESC)来源造血祖细胞共培养体系,探究AFT024细胞对hESC来源造血祖细胞体外特性维持和扩增作用。方法建立hESC向造血祖细胞定向诱导分化的培养体系,采用拟胚体诱导方法,分三阶段添加不同细胞因子获得造血祖细胞,将hESC来源造血祖细胞与AFT024细胞进行共培养,对照组为无滋养层培养组。培养4 d后,通过细胞计数、流式细胞术分析、集落培养实验等检测造血祖细胞数量、比例及造血集落形成能力的变化;通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对造血干/祖细胞增殖和分化相关基因的表达水平进行检测,以确定AFT024是否具有体外维持造血祖细胞特性的能力。结果hESC经三阶段诱导培养14后,可分化并产生大量悬浮的造血祖细胞,CD34^(+)CD43^(+)细胞比例为(22.63±2.65)%,CD34^(+)CD45^(+)细胞比例为(23.67±2.15)%;免疫荧光染色结果显示,AFT024细胞中有α-平没肌肌动蛋白(α-SMA)及Dlk-1蛋白的表达,以其为滋养层与造血祖细胞共培养4 d后,造血祖细胞比例显著高于无滋养层培养组。造血集落形成实验结果显示,滋养层培养组产生的造血集落总数显著高于无滋养层组。结论AFT024对hESC来源造血祖细胞的体外特性具有一定的维持作用。 展开更多

关键词 人胚胎干细胞 造血祖细胞 AFT024细胞 体外特性维持

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损伤抑制基因Dsup对人胚胎干细胞生物学性质的影响 被引量：1

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作者 刘志瑞 张彪 +6 位作者 张铭铭 周军年 张博文 习佳飞 裴雪涛 曾泉 岳文 《军事医学》 CAS CSCD 2023年第5期326-333,345,共9页

目的通过CRISPR/Cas9技术将水熊虫Dsup基因定点敲入胚胎干细胞(hESC-H9)的AAVS1位点,构建Dsup基因过表达的稳定细胞株,研究Dsup表达对hESC-H9生物学性质的影响。方法构建CRISPR/Cas9 AAVS1位点敲入系统,采用PCR技术扩增Dsup序列,并将其... 目的通过CRISPR/Cas9技术将水熊虫Dsup基因定点敲入胚胎干细胞(hESC-H9)的AAVS1位点,构建Dsup基因过表达的稳定细胞株,研究Dsup表达对hESC-H9生物学性质的影响。方法构建CRISPR/Cas9 AAVS1位点敲入系统,采用PCR技术扩增Dsup序列,并将其插入pAAVS1-Donor-GFP-Puro,将构建的pAAVS1-Dsup-GFP-Puro与pAAVS1-CRISPR-Cas9载体共同转染hESC-H9,通过CRISPR/Cas9技术介导的同源重组使Dsup基因插入hESC-H9的AAVS1位点,经嘌呤霉素筛选后利用流式分选技术分选GFP、TRA-1-60、SSEA-4等3种荧光标记阳性的细胞群,获得稳定敲入Dsup基因并保持干性的细胞。将获得的hESC-H9-Dsup传至第9代,对Dsup mRNA表达水平、GFP、细胞表面干性标志物(TRA-1-60、SSEA-4)以及干性基因(OCT4、SOX2、NANOG)进行检测,并研究hESC-H9-Dsup的增殖、凋亡以及辐射耐受情况,以探索Dsup基因对hESC-H9生物学活性的影响。结果成功构建pAAVS1-Dsup-GFPPuro重组供体质粒,与pAAVS1-CRISPR-Cas9质粒共同转染hESC-H9后通过药物筛选获得了在AAVS1位点敲入的hESC-H9-Dsup。经实时定量PCR检测,Dsup mRNA在hESC-H9-Dsup中成功表达,且其表达对hESC-H9表面干性标志物TRA-1-60、SSEA-4以及干性基因OCT4、SOX2、NANOG表达未见明显影响。hESC-H9-Dsup增殖速度稍高于hES-H9-Control/WT。hESC-H9-Dsup与hESC-H9-Control/WT凋亡无显著差异(P>0.05),但hESC-H9-Dsup的辐射耐受能力显著高于hESC-H9-Control(P<0.001)。结论成功构建了hESC-H9-Dsup,Dsup基因表达未对其生物学性质产生明显影响,且表现出明显的辐射耐受能力,为后续研究Dsup基因对人类细胞的影响及探讨可能的应用价值奠定了基础。 展开更多

关键词 Dsup 人胚胎干细胞 CRISPR/Cas9 细胞增殖 凋亡

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骨形成蛋白4对小鼠骨髓造血干/祖细胞体外扩增的作用研究

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作者 李允兴 赵家慧 +6 位作者 陈可一 张博文 李昀桥 范韬 何丽娟 裴雪涛 李艳华 《军事医学》 CAS CSCD 2023年第8期576-583,共8页

目的探究骨形成蛋白4(BMP4)对小鼠造血干/祖细胞(HSPC)体外扩增的作用。方法用磁珠分选法富集小鼠骨髓细胞中的c⁃Kit+造血细胞,分成对照组(添加基础培养基)及实验组(每天补充40 ng/ml BMP4)进行体外培养。培养4 d后,进行细胞计数及存活... 目的探究骨形成蛋白4(BMP4)对小鼠造血干/祖细胞(HSPC)体外扩增的作用。方法用磁珠分选法富集小鼠骨髓细胞中的c⁃Kit+造血细胞,分成对照组(添加基础培养基)及实验组(每天补充40 ng/ml BMP4)进行体外培养。培养4 d后,进行细胞计数及存活率分析,并结合流式细胞术分析细胞中HSPC的比例及数量,采用造血集落形成实验分析细胞的造血集落形成能力。在此基础上,结合BMP4信号通路抑制剂LDN193189(500 nmol/L)处理,通过流式细胞术检测阻断该信号通路对细胞中HSPC比例的影响,并结合实时荧光定量PCR(qRT⁃PCR)分析细胞中毒性应激和凋亡相关基因表达水平。结果c⁃Kit+造血细胞体外培养4 d后,对照组及实验组细胞数量分别是起始接种数量的(3.20±0.33)倍及(5.00±0.61)倍。结合流式细胞术对细胞中HSPC比例分析的结果,培养4 d后对照组及实验组Lineage^(-)Sca⁃1^(+)c⁃Kit^(+)(LSK)细胞数量分别较起始接种细胞中LSK细胞数量扩增了(2.62±0.09)倍及(5.67±0.11)倍。造血集落形成实验结果表明,对照组形成了(49.25±6.99)个集落,而实验组可形成(69.95±3.40)个集落。培养基中添加LDN193189(500 nmol/L)培养4 d后,LSK细胞数量为(3.16±0.43)×10^(4)个/孔,较未添加LDN193189组下降了(38.27±7.44)%。qRT⁃PCR结果表明,与对照组相比,BMP4处理组降低了蛋白质毒性应激相关基因和促凋亡相关基因的表达。结论BMP4处理能够促进小鼠骨髓造血细胞的体外扩增,并有效提高细胞中HSPC的增殖及造血细胞集落形成能力。 展开更多

关键词 骨形成蛋白4 造血干/祖细胞 体外扩增 蛋白毒性应激 凋亡

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生长停滞特异性基因6对成骨前体细胞辐射损伤后增殖作用的研究

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作者 郁锦程 张静 +5 位作者 范增 何丽娟 岳文 裴雪涛 蒋少云 李艳华 《军事医学》 CAS 北大核心 2019年第10期727-732,共6页

目的研究生长停滞特异性基因6(growth arrest-specific gene 6,gas6)在成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)辐射损伤后凋亡及增殖中的作用。方法体外建立MC3T3-E1细胞辐照损伤模型,通过流式细胞术检测辐照对该细胞凋亡和增殖的影响;通过qRT-PCR... 目的研究生长停滞特异性基因6(growth arrest-specific gene 6,gas6)在成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)辐射损伤后凋亡及增殖中的作用。方法体外建立MC3T3-E1细胞辐照损伤模型,通过流式细胞术检测辐照对该细胞凋亡和增殖的影响;通过qRT-PCR和ELISA方法检测该细胞在辐照后gas6基因表达及蛋白分泌变化;使用gas6小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对MC3T3-E1辐照损伤模型进行处理,通过BrdU掺入实验结合流式细胞术分析其对该细胞增殖的影响;使用AXL抑制剂R428对其辐照损伤模型进行处理,通过BrdU掺入实验检测GAS6作用受体阻断后对该细胞增殖的影响,以探究潜在的分子机制。结果成功建立MC3T3-E1辐照损伤模型,流式分析结果表明,9 Gyγ射线照射能引起MC3T3-E1的凋亡;qRT-PCR以及ELISA实验结果显示,9 Gyγ射线照射导致其gas6基因表达及蛋白分泌显著增加;流式分析结果表明,gas6的沉默表达会显著抑制辐照损伤的MC3T3-E1的增殖,AXL受体抑制剂R428能显著抑制辐射损伤MC3T3-E1的增殖,提示GAS6/AXL轴在MC3T3-E1辐射损伤再生中发挥正性调控作用。结论GAS6具有促进MC3T3-E1辐射损伤后再生的作用。 展开更多

关键词 成骨细胞前体细胞 生长停滞特异性基因6 辐射损伤 细胞凋亡 细胞增殖

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丝氨酸代谢在脐带血红系细胞增殖过程中的作用研究

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作者 李基晟 陈琳 +8 位作者 张博文 习佳飞 姜佳楠 范增 吕洋 何丽娟 乔海晅 裴雪涛 李艳华 《军事医学》 CAS 2021年第9期660-666,共7页

目的通过探索氨基酸代谢对红系细胞体外扩增的影响,为提高脐带血红系细胞体外扩增的效率以制备大量的红系细胞奠定基础。方法高效液相色谱法(HPLC)测定脐血单个核细胞(MNC)中造血细胞向红系细胞分化及增殖过程中培养基内氨基酸的消耗情... 目的通过探索氨基酸代谢对红系细胞体外扩增的影响,为提高脐带血红系细胞体外扩增的效率以制备大量的红系细胞奠定基础。方法高效液相色谱法(HPLC)测定脐血单个核细胞(MNC)中造血细胞向红系细胞分化及增殖过程中培养基内氨基酸的消耗情况,筛选出消耗多的氨基酸;进一步选择人脐带血来源的红系祖细胞系(HUDEP-2)作为研究对象,对其培养体系进行特定氨基酸的缺乏与补加,通过细胞计数、EdU掺入实验结合流式细胞术等方法分析特定氨基酸在红系细胞扩增过程中的作用;向红系培养体系中添加特定氨基酸代谢的抑制剂,进一步评价该氨基酸代谢在红系细胞扩增过程中的作用。结果HPLC法检测发现,红系细胞定向分化及增殖过程中丝氨酸的消耗最为显著。在缺乏丝氨酸的培养体系中,红系祖细胞系HUDEP-2的增殖与存活受到明显抑制,但丝氨酸的缺乏并不影响HUDEP-2细胞表面红系细胞特征蛋白的表达。向红系培养基中添加丝氨酸分解代谢的关键酶抑制剂——丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)抑制剂SHIN1后,发现SHIN1明显抑制HUDEP-2的增殖与存活。结论丝氨酸是维持红系细胞增殖能力的关键氨基酸,其分解代谢产生的一碳单位可能是红系细胞增殖所必需的,该结果为体外进一步提高脐带血红系细胞的扩增效率提供了实验依据。 展开更多

关键词 HUDEP-2 氨基酸 丝氨酸 红系分化 丝氨酸羟甲基转移酶抑制剂

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β-拉帕醌联合帕博西尼抑制肝内胆管细胞癌细胞及肿瘤干细胞球的增殖 被引量：1

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作者 杨慧 韩瑞刚 +9 位作者 万令飞 葛晨 刘蕴慧 王海洋 张彪 曾泉 范增 阎新龙 岳文 裴雪涛 《军事医学》 CAS 北大核心 2019年第10期761-766,共6页

目的探讨β-拉帕醌以及联合帕博西尼对肝内胆管细胞癌(ICC)细胞、肿瘤干细胞球的抑制作用及其作用机制。方法首先,利用CCK-8和克隆形成实验检测β-拉帕醌单药及与帕博西尼联用对人ICC HuCCT1和QBC939细胞系增殖的影响;其次利用肿瘤干细... 目的探讨β-拉帕醌以及联合帕博西尼对肝内胆管细胞癌(ICC)细胞、肿瘤干细胞球的抑制作用及其作用机制。方法首先,利用CCK-8和克隆形成实验检测β-拉帕醌单药及与帕博西尼联用对人ICC HuCCT1和QBC939细胞系增殖的影响;其次利用肿瘤干细胞球形成实验检测β-拉帕醌单药,帕博西尼单药及联合用药对人ICC细胞中肿瘤干细胞球形成的影响;进一步应用qRT-PCR和Western印迹检测β-拉帕醌处理组与对照组的肿瘤干性相关基因mRNA和蛋白表达水平的影响。结果β-拉帕醌单药及与帕博西尼联用对人ICC肿瘤干细胞球的形成具有显著的抑制作用,且协同效果更加显著。结论β-拉帕醌联合帕博西尼能够显著抑制人ICC细胞及肿瘤干细胞球的增殖。 展开更多

关键词 肝内胆管细胞癌 β-拉帕醌 帕博西尼 肿瘤干细胞球

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敲低微小染色体维持蛋白7对肝癌细胞生物学功能的影响 被引量：3

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作者 王东星 王海洋 +5 位作者 张彪 曾泉 范增 周军年 岳文 裴雪涛 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期584-591,597,共9页

目的研究微小染色体维持蛋白7(MCM7)在肝癌细胞中的功能及作用机制,建立MCM7低表达的肝癌细胞株。方法构建MCM7基因的p SicoR慢病毒干扰载体,对上述载体进行XbaⅠ和XhoⅠ双酶切和测序鉴定。鉴定正确后,在HEK293T细胞中进行慢病毒包装,... 目的研究微小染色体维持蛋白7(MCM7)在肝癌细胞中的功能及作用机制,建立MCM7低表达的肝癌细胞株。方法构建MCM7基因的p SicoR慢病毒干扰载体,对上述载体进行XbaⅠ和XhoⅠ双酶切和测序鉴定。鉴定正确后,在HEK293T细胞中进行慢病毒包装,并使用40%PEG浓缩后的慢病毒感染肝癌细胞,通过流式细胞术分选得到绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞,扩增后收集细胞进行Western印迹鉴定;利用CCK-8、克隆形成、三维培养、凋亡检测以及细胞迁移实验初探MCM7敲低对肝癌细胞生物学功能的影响。结果双酶切和测序结果表明,p SicoR-shMCM7-GFP质粒构建成功; Western印迹结果表明,MCM7的表达水平在分选后的稳转肝癌细胞株中明显下调;对稳转细胞株的生物学功能进行分析,发现在体外敲低MCM7能抑制肝癌细胞的增殖及迁移能力并促进细胞凋亡。结论敲低MCM7的表达对肝癌细胞的增殖和迁移能力有一定的抑制作用并促进细胞凋亡。 展开更多

关键词 肝细胞癌 微小染色体维持蛋白7 细胞增殖 细胞迁移 细胞凋亡

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肠器官芯片构建技术及应用研究进展 被引量：1

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作者 胡亮 裴雪涛 李艳华 《军事医学》 CAS CSCD 2023年第8期561-565,共5页

肠器官芯片是近年来新兴的体外肠道仿生模型,相对于传统的肠上皮细胞静态培养模型而言,肠芯片具有与体内肠组织相似的形态结构、可模拟肠组织微生理环境、可规模化定制并实现高通量药物筛选等优势,已广泛应用于肠道疾病模型制备、新药... 肠器官芯片是近年来新兴的体外肠道仿生模型,相对于传统的肠上皮细胞静态培养模型而言,肠芯片具有与体内肠组织相似的形态结构、可模拟肠组织微生理环境、可规模化定制并实现高通量药物筛选等优势,已广泛应用于肠道疾病模型制备、新药筛选和测试等研究领域。肠芯片建立于肠上皮细胞及其他多种类型细胞共培养的体系之上,并结合微工程技术构建肠道微绒毛、肠褶皱等肠道三维仿生结构,还通过使用微流控装置来模拟肠组织内的血液流动和生理蠕动等生物力学参数,使其具有天然肠组织相似的微生理特征并受到生物力学调控。该文主要从细胞共培养技术、微流控技术、微工程技术等方面对肠器官芯片构建技术的发展进行综述,同时总结了其在肠相关疾病模型模拟、药物筛选和测试等方面的应用。 展开更多

关键词 肠 人工生物器官 细胞共培养 微工程技术 疾病模型 药物临床前评价

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脐带间充质干细胞来源的外泌体有效扩增脐带血CD34^(+)细胞 被引量：1

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作者 何丽娟 张博文 +4 位作者 刘一鸣 贾雅丽 范增 李艳华 裴雪涛 《军事医学》 CAS 2022年第5期348-354,共7页

目的 探讨脐带间充质干细胞外泌体(MSC-Exo)在脐带血CD34^(+)细胞扩增中的作用。方法 采用差速离心法从人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)培养上清中分离提取外泌体,透射电镜观察其形态特征,并采用纳米颗粒跟踪分析技术进行鉴定。利用免疫磁... 目的 探讨脐带间充质干细胞外泌体(MSC-Exo)在脐带血CD34^(+)细胞扩增中的作用。方法 采用差速离心法从人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)培养上清中分离提取外泌体,透射电镜观察其形态特征,并采用纳米颗粒跟踪分析技术进行鉴定。利用免疫磁珠分选法从新鲜脐带血中分离获得CD34^(+)造血干/祖细胞(HSPC),接种到24孔板中,在含有干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)等细胞因子的StemSpan无血清培养基中,实验组加50μg/ml外泌体,对照组加等体积PBS,分别在培养第6和12天,对HSPC扩增数量计数并进行统计分析;利用流式细胞仪检测2种培养条件下HSPC表面标志的表达情况,并于集落培养12 d后进行造血集落形成实验。结果 脐带血CD34^(+)细胞在培养扩增12 d,实验组细胞扩增数量是对照组的1.88倍,两者差异显著(P<0.01);进一步分析表明,培养至第6和12天,实验组中原始造血干细胞(pHSC)(CD34^(+)CD38^(-)CD90^(+)CD45RA-CD49f^(+))的数量分别是对照组的2.13和3.17倍,差异具有统计学意义(P<0.05);造血集落形成实验显示,集落培养12 d,实验组细胞形成的造血集落数量显著高于对照组,特别是代表原始造血分化潜能的混合系集落形成单位(CFU-GEMM)数量显著提高,是对照组的1.9倍,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 添加脐带MSC-Exo的无血清培养体系,对HSPC的扩增具有更强的促进能力,并能有效提高扩增产物中pHSC的比例。 展开更多

关键词 人脐带间充质干细胞 外泌体 扩增 CD34^(+)细胞

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线粒体示踪体系的建立及验证

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作者 吕琳 王思涵 +6 位作者 曾泉 段晗 毛壮 王唱垚 裴雪涛 王华 李艳华 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS 北大核心 2023年第12期928-935,共8页

目的通过构建稳定表达线粒体荧光报告系统的牙髓干细胞(DPSC)建立线粒体示踪体系,并采用该示踪体系研究间充质干细胞(MSC)向辐射损伤细胞输送线粒体。方法①构建质粒pSIN-EF1α-COX8A-DsRed2(简称COX8A-DsRed2),并进行基因测序和PCR鉴定... 目的通过构建稳定表达线粒体荧光报告系统的牙髓干细胞(DPSC)建立线粒体示踪体系,并采用该示踪体系研究间充质干细胞(MSC)向辐射损伤细胞输送线粒体。方法①构建质粒pSIN-EF1α-COX8A-DsRed2(简称COX8A-DsRed2),并进行基因测序和PCR鉴定;COX8A-DsRed2用293T细胞包装获得慢病毒(Lv-COX8A-DsRed2)并感染DPSC,采用荧光显微镜观测红色荧光蛋白DsRed2在DPSC线粒体的稳定表达(DPSC-COX8A-DsRed2)。②在DPSC-COX8A-DsRed2中使用荧光染色法观察DsRed2荧光蛋白与线粒体膜受体线粒体外膜转位酶20(TOMM20)和线粒体示踪试剂MitoTracker Green的共定位。③采用10 Gy X射线照射大鼠小肠隐窝上皮细胞系IEC-6建立细胞辐射损伤模型,并使用5(6)-羧基二乙酸荧光素N-琥珀酰亚胺酯(CFSE)荧光染料标记IEC-6细胞;于照射后,立即加入DPSCCOX8A-DsRed2,继续培养24 h,荧光显微镜观察DPSC-COX8A-DsRed2能否向辐照受损细胞递送线粒体。结果①载体成功插入基因COX8A和DsRed2基因序列,COX8A-DsRed2构建成功;DPSC-COX8ADsRed2细胞内表达红色荧光DsRed2;②荧光染色法结果显示,红色荧光报告系统DPSC-COX8ADsRed2与线粒体膜受体TOMM20、线粒体示踪试剂MitoTracker Green共定位于细胞线粒体;③DPSCCOX8A-DsRed2与辐射损伤IEC-6细胞共培养,荧光显微镜可观测到绿色荧光的IEC-6细胞中出现DPSC来源的红色荧光标记的线粒体,表明DPSC与IEC-6之间发生了线粒体转移。结论构建的线粒体荧光探针能够准确指示线粒体的转移,为下一步研究间充质干细胞线粒体转移在辐射损伤救治中的作用提供了理想工具。 展开更多

关键词 线粒体转移 线粒体荧光探针 间充质干细胞

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小鼠部分肝切除后肝脏再生机制初探 被引量：1

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作者 鲁玫昕 张铭铭 +5 位作者 赵玲萍 曾泉 习佳飞 裴雪涛 王海洋 岳文 《军事医学》 CAS 2022年第9期659-667,共9页

目的构建小鼠部分肝切除术(PH)后肝脏再生模型,初步探究肝脏再生的启动机制。方法对小鼠行PH手术,分别于术后12、24、36、48、72 h获取肝组织样本,同时设假手术组为对照,对肝组织进行病理、凋亡、BrdU掺入、增殖相关基因表达等检测;对... 目的构建小鼠部分肝切除术(PH)后肝脏再生模型,初步探究肝脏再生的启动机制。方法对小鼠行PH手术,分别于术后12、24、36、48、72 h获取肝组织样本,同时设假手术组为对照,对肝组织进行病理、凋亡、BrdU掺入、增殖相关基因表达等检测;对实验组与对照组肝组织的单细胞转录组数据进行生物信息学分析,评估上皮细胞的细胞周期分布,以明确肝脏再生启动的时间;同时解析肝星状细胞(HSC)在再生不同阶段的分泌谱,筛选可能在肝脏再生启动中发挥功能的分泌因子;在体外进行细胞共培养实验,通过实时定量PCR、免疫荧光染色等方法检测HSC对肝细胞增殖的影响。结果成功构建小鼠2/3 PH模型,BrdU掺入检测和实时定量PCR结果显示,小鼠肝脏在PH后的早期基本不增殖,术后36~48 h达到增殖高峰;单细胞转录组分析同样表明大量上皮细胞在PH后48 h进入细胞周期S期;建立了HSC在再生不同阶段的分泌基因表达谱,筛选获得了包括Fgf9等在内的可能参与肝脏再生启动的候选分泌因子集合;进一步体外共培养实验表明人肝星状细胞系LX-2能够促进人肝细胞系THLE-2增殖。结论在小鼠PH后肝脏再生早期,微环境中的HSC分泌了多种促进细胞增殖的因子,且体外培养的HSC能够促进肝细胞增殖,提示HSC参与肝脏再生的启动并可能发挥正向调控作用。 展开更多

关键词 部分肝切除术 肝脏再生 肝星状细胞 肝细胞增殖

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一种基于A549细胞与内皮细胞共培养的新型气液培养模型的建立

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作者 张雪妹 杨慧 +4 位作者 曾泉 习佳飞 岳文 阎新龙 周军年 《军事医学》 CAS CSCD 2023年第9期692-699,705,共9页

目的通过气-液界面(ALI)培养技术将人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549与内皮细胞共培养,探究内皮细胞存在条件下A549细胞表型和功能的变化。方法基于transwell培养体系建立气液共培养模型,A549细胞接种于transwell膜上表面,内皮细胞接种于transwel... 目的通过气-液界面(ALI)培养技术将人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549与内皮细胞共培养,探究内皮细胞存在条件下A549细胞表型和功能的变化。方法基于transwell培养体系建立气液共培养模型,A549细胞接种于transwell膜上表面,内皮细胞接种于transwell膜下表面,实时定量PCR(RT-qPCR)检测A549细胞经过传统ALI培养和ALI与内皮细胞共培养后的肺表面活性蛋白、细胞间连接以及与新冠病毒入侵细胞相关分子的表达,流式细胞术检测新冠病毒S蛋白截短体重组慢病毒的细胞感染率。结果通过比较分析,发现EA.hy926内皮细胞系较原代内皮细胞HUVEC更加适合建立新型ALI共培养模型。A549细胞经过传统ALI培养后肺表面活性蛋白SP-B、SP-D的表达上调,促进上皮钙黏蛋白E、紧密连接蛋白表达,新冠病毒受体神经紧张素1、去唾液酸糖蛋白受体1、含kringle跨膜蛋白1显著上调;而在ALI与内皮细胞共培养体系中,上述基因的上调更加显著(P<0.05),模型病毒粒子感染率较传统ALI培养的A549细胞显著上升(P<0.05)。结论成功构建A549细胞和EA.hy926内皮细胞共培养模型,为相关肺部疾病病理研究和药物筛选提供了新的研究模型。 展开更多

关键词 气-液界面培养 A549细胞 肺表面活性物质相关蛋白质类 细胞连接 S蛋白结合受体

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人血小板第4因子基因启动子报告基因载体的构建及转录活性分析

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作者 姜佳楠 覃金华 +5 位作者 范增 何丽娟 岳文 郑敏 李艳华 裴雪涛 《军事医学》 CAS 北大核心 2019年第10期733-738,共6页

目的构建人血小板第4因子(PF4)基因启动子-绿色荧光蛋白(GFP)报告基因载体PLVX-PF4-promoter-GFP,并检测其转录活性。方法在NCBI数据库中获得人PF4基因启动子5’端非编码区包含转录起始位点在内的-245^+49 bp的DNA序列。以正常人全血基... 目的构建人血小板第4因子(PF4)基因启动子-绿色荧光蛋白(GFP)报告基因载体PLVX-PF4-promoter-GFP,并检测其转录活性。方法在NCBI数据库中获得人PF4基因启动子5’端非编码区包含转录起始位点在内的-245^+49 bp的DNA序列。以正常人全血基因组DNA为模板,利用PCR扩增该序列,与GFP序列连接并插入到PLVX-tight-puro载体上,构建重组质粒PLVX-PF4-promoter-GFP。将其包装慢病毒并感染MEG01细胞,用嘌呤霉素筛选出稳转细胞株,并用12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯(PMA)诱导MEG01细胞分化成熟,通过流式细胞术检测GFP表达率,从而验证报告基因的转录活性。结果构建的载体PLVX-PF4-promoter-GFP经酶切鉴定及测序结果比对完全正确,将其转入MEG01细胞,经药物筛选获得了MEG01-PF4-GFP细胞株。流式细胞术检测结果表明,正常培养条件下的MEG01-PF4-GFP细胞中GFP阳性细胞率低[(5.467±0.2603)%],该细胞经PMA诱导分化后,GFP阳性细胞率显著升高[(24.93±2.571)%]。结论成功构建了人PF4启动子-GFP报告基因载体,为后续深入研究PF4基因的调控机制及巨核细胞发育分化的分子生物学机制奠定了基础。 展开更多

关键词 血小板因子4 巨核细胞 绿色荧光蛋白质类

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