猪传染性胃肠炎病毒检测基因芯片的构建 被引量：14

1

作者 曹三杰 黄小波 +1 位作者 文心田 肖国生 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期121-124,共4页

采用PCR扩增制备TGEV的靶基因并进行纯化，对基因芯片的最佳靶基因点样质量浓度、探针质量浓度、杂交温度、杂交时间进行筛选，选择构建检测芯片的最适靶基因，进行基因芯片探针最佳标记方法试验。结果表明，质粒PCR扩增和采用异丙醇沉... 采用PCR扩增制备TGEV的靶基因并进行纯化，对基因芯片的最佳靶基因点样质量浓度、探针质量浓度、杂交温度、杂交时间进行筛选，选择构建检测芯片的最适靶基因，进行基因芯片探针最佳标记方法试验。结果表明，质粒PCR扩增和采用异丙醇沉淀纯化的靶基因质量好，基因芯片最佳靶基因点样质量浓度为200mg／L，最佳探针质量浓度为3000μg／L，预杂交时间为1h，杂交时间为3～6h，杂交温度为48℃，以S、S3、sM、M、N、ORF7、POL等7个靶基因为构建TGEV检测芯片的最适靶基因，确定了多重PCR扩增标记TGEV探针的最佳体系，Cy3-dCTP标记浓度为2．5μmol／L，构建的TGEV检测芯片与标记的混合探针杂交效果好。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎病毒 检测 基因芯片 构建

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基因芯片技术在鸡病毒性疾病诊断中的应用 被引量：1

2

作者 杨国淋 文心田 +4 位作者 曹三杰 黄小波 马锐 常晓霞 张仙 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2015年第10期57-60,共4页

禽流感、新城疫均为一类传染病,传染性强,发病率高;鸡传染性囊病、鸡传染性支气管炎等也是影响我国家禽养殖业健康发展最为常见的疾病。目前世界各国都十分重视对这些疾病的防治,努力研究一种准确、快速、特异性高的方法进行疾病的诊断... 禽流感、新城疫均为一类传染病,传染性强,发病率高;鸡传染性囊病、鸡传染性支气管炎等也是影响我国家禽养殖业健康发展最为常见的疾病。目前世界各国都十分重视对这些疾病的防治,努力研究一种准确、快速、特异性高的方法进行疾病的诊断。 基因芯片技术是随着人类基因组计划的研究应运而生,又称DNA微阵列。 展开更多

关键词 基因芯片技术 鸡传染性囊病 原位合成 病毒性疾病 人类基因组计划 家禽养殖业 禽流感病毒 DNA 基因表达分析 杂交信号

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携带猪传染性胃肠炎病毒S/N融合双基因的减毒沙门氏菌的构建与鉴定 被引量：1

3

作者 黄小波 李春松 +4 位作者 杨恒 曹三杰 文心田 廖晓丹 张鑫淼 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期1273-1280,共8页

旨在构建携带猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S/N融合双基因的减毒沙门氏菌,并鉴定该疫苗菌株的生物学特性,为开展TGEV口服免疫研究奠定材料基础。采用PCR方法从克隆质粒19T-S和19T-N中分别扩增了TGEV的S基因(含主要抗原位点,2.1kb)和N基因(1.... 旨在构建携带猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S/N融合双基因的减毒沙门氏菌,并鉴定该疫苗菌株的生物学特性,为开展TGEV口服免疫研究奠定材料基础。采用PCR方法从克隆质粒19T-S和19T-N中分别扩增了TGEV的S基因(含主要抗原位点,2.1kb)和N基因(1.2kb),将S基因和N基因插入pVAX1载体,构建携带S/N融合双基因的真核表达质粒pVAX-S/N。将pVAX-S/N电转化减毒沙门氏菌SL7207,筛选获得重组菌株SL7207(pVAX-S/N),并对重组菌株SL7207(pVAX-S/N)的体外稳定性、目的基因在体内的转录、口服接种小鼠的安全性及在体内稳定性等特性进行了鉴定。结果表明,真核质粒pVAX-S/N构建成功,该质粒转染COS7中能表达2个目的蛋白,重组菌SL7207(pVAX-S/N)在Kan+抗性下体外培养稳定性好,口服接种小鼠3d可从回肠组织检测到目的基因的转录,以0.5×109、1×109和2×109 CFU口服对小鼠均具有安全性,重组菌在接种小鼠的肝、脾于4周左右逐渐被机体清除。结果表明成功构建TGEVS/N双基因疫苗SL7207(pVAX-S/N),该疫苗具有良好的稳定性与安全性等特点,为开展TGEV口服免疫研究奠定了基础。 展开更多

关键词 减毒沙门氏菌 猪传染性胃肠炎病毒 融合双基因 构建 生物学特性

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猪传染性胃肠炎病毒S基因B、C位点的克隆与表达及间接ELISA方法的建立 被引量：2

4

作者 尹杰 杨恒 +5 位作者 曹三杰 黄小波 文心田 李洁萍 余正强 周军 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2015年第1期7-10,共4页

针对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因B、C抗原位点编码基因片段(SBC,下同)设计合成1对引物,用PCR方法扩增SBC基因,将该基因片段定向插入到原核表达载体p ET-32a(+)中,构建原核表达载体p ET-32a-SBC。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),在IPTG... 针对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因B、C抗原位点编码基因片段(SBC,下同)设计合成1对引物,用PCR方法扩增SBC基因,将该基因片段定向插入到原核表达载体p ET-32a(+)中,构建原核表达载体p ET-32a-SBC。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下表达大小约38 k D的蛋白,重组蛋白以包涵体的形式存在。Western blot分析表明,表达产物具有良好的免疫学活性。以纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测TGEV抗体的间接ELISA(TGEV SBC-ELISA)方法。表明建立的间接ELISA方法特异性和重复性良好,敏感性比血清中和试验高,可用于TGEV的检疫和流行病学调查。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎病毒 克隆与表达 诊断

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猪传染性胃肠炎病毒SC-H株的分离与鉴定 被引量：12

5

作者 黄小波 曹三杰 +2 位作者 文心田 杨恒 秦学远 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2008年第8期58-61,共4页

关键词 猪传染性胃肠炎病毒 鉴定 分离 H株 VIRUS 肠道传染病 临床症状 寒冷季节

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可视化芯片技术研究进展 被引量：5

6

作者 张仙 常晓霞 +5 位作者 赵松 马锐 杨国淋 黄小波 曹三杰 文心田 《动物医学进展》 北大核心 2015年第4期100-103,共4页

生物芯片具有准确、快速、高通量等优点而被广泛应用于生物学的各个领域。但芯片的设备的体积较大、价格昂贵、实验室环境要求高,普通实验室难以开展相关工作,在一定程度上制约了生物芯片的应用范围。可视化芯片技术是在常规芯片基础上... 生物芯片具有准确、快速、高通量等优点而被广泛应用于生物学的各个领域。但芯片的设备的体积较大、价格昂贵、实验室环境要求高,普通实验室难以开展相关工作,在一定程度上制约了生物芯片的应用范围。可视化芯片技术是在常规芯片基础上发展起来的一种技术类型,可分为可视化蛋白芯片和可视化基因芯片。可视化芯片应用新的标记方法取代传统的荧光标记,并借助相应的显色方法,使得试验结果能直接被肉眼所观察到。可视化生物芯片具有快速、可视、设备要求低等特点,近些年来被广泛应用于病原检测、基因突变检测及差异表达、酶功能研究等方面,具有潜在的应用前景。 展开更多

关键词 生物芯片 可视化基因芯片 可视化蛋白芯片 原理 应用

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减毒沙门氏菌递呈的TGEVS／N融合基因疫苗的口服免疫原性 被引量：2

7

作者 黄小波 张鑫淼 +4 位作者 曹三杰 文心田 李春松 梁恩涛 崔婷婷 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期594-600,共7页

目的研究携带猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S/N融合基因的重组减毒沙门氏菌的口服免疫原性。方法将真核质粒pVAX-S/N电转化鼠伤寒减毒沙门氏菌SL7207,筛选获得疫苗菌株SL7207(pVAX-S/N)。将菌株SL7207(pVAX-S/N)及对照组SL7207(pVAX-S)以1&#... 目的研究携带猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S/N融合基因的重组减毒沙门氏菌的口服免疫原性。方法将真核质粒pVAX-S/N电转化鼠伤寒减毒沙门氏菌SL7207,筛选获得疫苗菌株SL7207(pVAX-S/N)。将菌株SL7207(pVAX-S/N)及对照组SL7207(pVAX-S)以1×109 CFU/只灌胃免疫小鼠,测定免疫小鼠诱导的抗TGEV(和抗沙门氏菌均SL7207)的血清IgG及肠道粘膜IgA抗体动态水平,同时测定42d免疫小鼠的干扰素水平。结果菌株SL7207(pVAX-S/N)构建成功,首免后2～6周可诱导产生抗TGEV(和抗沙门氏菌SL7207)的血清IgG,第4～6周可诱导产生抗TGEV(和抗沙门氏菌均SL7207)的肠道粘膜IgA,SL7207(pVAX-S/N)诱导的IgG和IgA抗体最高滴度均略高于SL7207(pVAX-S),但差异不明显(P>0.05)。SL7207(pVAX-S/N)免疫42d小鼠诱导的干扰素浓度为659.45pg/mL,低于SL7207(pVAXD-S)组。结论 S/N融合基因疫苗SL7207(pVAX-S/N)具有良好的口服免疫原性,但与SL7207(pVAX-S)无明显差异。 展开更多

关键词 减毒沙门氏菌 猪传染性胃肠炎病毒 融合双基因 构建 免疫原性

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TGEV双基因嵌合表达质粒pVAX-S-N的构建及体外表达 被引量：2

8

作者 杨恒 曹三杰 +2 位作者 黄小波 文心田 秦学远 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期254-257,共4页

采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)SC-H株S基因5′端主要抗原位点片段和N基因,插入pMD19-T载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒19T-N与19T-S。从T载体上将S、N基因切下,以亚克隆方法插入真核表达载体pVAX1,构建嵌合表达S、N基... 采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)SC-H株S基因5′端主要抗原位点片段和N基因,插入pMD19-T载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒19T-N与19T-S。从T载体上将S、N基因切下,以亚克隆方法插入真核表达载体pVAX1,构建嵌合表达S、N基因的重组质粒pVAX-S-N。对重组质粒PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况。结果表明,重组质粒构建正确且在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光。真核表达质粒pVAX-S-N的成功构建为进一步研究TGEV核酸疫苗奠定了物质基础。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎病毒 S基因 N基因 构建 真核表达

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禽呼肠孤病毒σC基因的克隆和表达 被引量：2

9

作者 黄小波 凌珊珊 +3 位作者 曹三杰 文心田 王存伟 陈元坤 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期836-840,共5页

采用RT-PCR技术设计扩增禽呼肠孤病毒(ARV)S1133毒株的σC基因,将扩增基因克隆至pMD-19T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定,克隆的基因片段为ARVσC基因。将该基因重组至pET32a(+)原核表达载体上成功构建了表达载体pET32a-σC。该重组质粒... 采用RT-PCR技术设计扩增禽呼肠孤病毒(ARV)S1133毒株的σC基因,将扩增基因克隆至pMD-19T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定,克隆的基因片段为ARVσC基因。将该基因重组至pET32a(+)原核表达载体上成功构建了表达载体pET32a-σC。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1.0 mmol/LIPTG诱导5 h得到最佳表达。表达重组蛋白的相对分子质量为54 000,以包涵体形式存在。经Western-blot分析表明,该重组蛋白能于ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。 展开更多

关键词 禽呼肠孤病毒 σC基因 pMD19T—σC pET32a-σC

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减毒沙门氏菌投递的TGEVS基因疫苗口服免疫猪的动态规律 被引量：2

10

作者 张小会 张丹 +6 位作者 梁恩涛 余敏 黄小波 曹三杰 文心田 文翼平 伍锐 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期33-38,共6页

目的研究TGEV S基因疫苗SL7207(PVAXD-TS)口服免疫仔猪后的动态免疫诱导规律。方法将口服疫苗SL7207(PVAXD-TS)、空载体菌株SL7207(PVAXD)以1.6×1011 CFU/头的剂量口服接种20日龄仔猪,以PBS为空白对照,2周后以2.0×1011 CFU的... 目的研究TGEV S基因疫苗SL7207(PVAXD-TS)口服免疫仔猪后的动态免疫诱导规律。方法将口服疫苗SL7207(PVAXD-TS)、空载体菌株SL7207(PVAXD)以1.6×1011 CFU/头的剂量口服接种20日龄仔猪,以PBS为空白对照,2周后以2.0×1011 CFU的剂量加强免疫。分别测定0、2、4、6和8周的血清IgG、IgA、TGEV中和抗体、细胞免疫反应IL-4、IFN-γ、外周血淋巴细胞增殖情况。结果仔猪口服免疫后第4周即可检测抗TGEV的特异性IgG和粪黏液IgA抗体;在免疫后第6周IgA、IgG、IL-4、IFN-γ抗体和外周血T淋巴细胞增殖与SL7207(PVAXD)、PBS间均存在统计学差异(P<0.01),并在第6周达到最高值;中和实验显示该疫苗诱导的血清IgG具有中和活性。结论证实以减毒沙门菌为载体的TGEV S基因疫苗口服免疫仔猪有较好的免疫原性。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎 减毒沙门氏菌 S基因 仔猪 免疫原性

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猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：1

11

作者 黄小波 李娜 +5 位作者 文心田 曹三杰 余慧 杨恒 秦学远 尹杰 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期994-998,共5页

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,通过间接ELISA法对融合细胞进行筛选,采用有限稀释法对阳性细胞进行4次亚克隆,获得了3株能稳定分泌N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细... 以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,通过间接ELISA法对融合细胞进行筛选,采用有限稀释法对阳性细胞进行4次亚克隆,获得了3株能稳定分泌N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为JY(4)-1、JY(4)-2、JY(4)-3。分别采用体外培养法、诱导腹水法和实体瘤法制备单克隆抗体,并用间接ELISA法检测其效价,结果显示,这3株杂交瘤细胞的细胞培养上清、小鼠腹水和血清的单抗效价均分别为1∶512、1∶105、1∶105,其中以诱导腹水法制备的单抗产量和效价最佳。间接免疫荧光试验结果显示,这3株单抗均能与TGEV感染的ST细胞产生特异性免疫荧光,而不与猪细小病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒等发生交叉反应;经鉴定,3株单抗的亚类均为IgG2a,这3株杂交瘤细胞具有良好的遗传稳定性。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎病毒 重组N蛋白 单克隆抗体 杂交瘤

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应用不对称PCR提高PRRSV-CSFV-JEV共检芯片的杂交效率 被引量：1

12

作者 张仙 邓静 +10 位作者 常晓霞 杨国淋 马锐 滑翔 赵玉佳 欧阳达 文心田 黄小波 曹三杰 文翼平 伍锐 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期51-55,64,共6页

目的比较采用普通RT-PCR和不对称PCR分别进行样品的直接荧光标记,应用于cDNA芯片杂交,分析其对芯片杂交效率的影响。方法以本实验室建立保存的重组质粒和病毒为模板,进行不对称RT-PCR引物浓度优化,应用普通RT-PCR与不对称RT-PCR进行直... 目的比较采用普通RT-PCR和不对称PCR分别进行样品的直接荧光标记,应用于cDNA芯片杂交,分析其对芯片杂交效率的影响。方法以本实验室建立保存的重组质粒和病毒为模板,进行不对称RT-PCR引物浓度优化,应用普通RT-PCR与不对称RT-PCR进行直接荧光标记,将标记的产物与制备的cDNA芯片杂交,在相同条件下完成杂交后芯片的洗涤与扫描,记录扫描图片与数据。结果与普通RT-PCR标记方法相比,应用不对称RT-PCR技术标记单链靶基因,能特异有效提高芯片的杂交效率。结论应用不对称RT-PCR技术对样品进行荧光标记后,与cDNA芯片杂交能提高芯片的杂交效率,有利于cDNA芯片的检测应用。 展开更多

关键词 不对称PCR CDNA芯片 标记

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猪胸膜肺炎放线杆菌ArcA基因在低氧环境下的转录变化

13

作者 段丽丽 文心田 +1 位作者 曹三杰 黄小波 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期1388-1394,共7页

为研究低氧条件对猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)血清1型ArcA基因表达的影响,并探讨ArcA在低氧环境中的作用机制,作者建立了体外培养模型,在低氧环境中培养APP,采用半定量RT-PCR方法,以看家基因recF为内参,检... 为研究低氧条件对猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)血清1型ArcA基因表达的影响,并探讨ArcA在低氧环境中的作用机制,作者建立了体外培养模型,在低氧环境中培养APP,采用半定量RT-PCR方法,以看家基因recF为内参,检测ArcA基因在低氧条件下的表达水平。结果表明ArcA基因在常氧条件下不转录或低转录,而在低氧环境下高转录,并呈现转录量先升高后降低的趋势。这表明ArcA基因可能是胸膜肺炎放线杆菌潜在的毒力基因,在致病过程中发挥重要作用。 展开更多

关键词 半定量RT-PCR 猪胸膜肺炎放线杆菌 ArcA基因 缺氧

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三株递呈猪流行性腹泻病毒S基因的减毒鼠伤寒沙门菌的生物学特性研究

14

作者 梁恩涛 陈杰 +4 位作者 黄小波 文心田 曹三杰 吴学婧 朱书权 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期279-287,共9页

为了探究减毒沙门菌递呈不同长度猪流行性腹泻病毒(PEDV)S基因的可行性,本研究对3株携带不同长度S基因片段的减毒鼠伤寒沙门菌进行了生物学特性评估。主要进行了对所构建的重组减毒沙门菌菌株SL7207(pVAX-S499-650)(长456bp,编码S蛋白N... 为了探究减毒沙门菌递呈不同长度猪流行性腹泻病毒(PEDV)S基因的可行性,本研究对3株携带不同长度S基因片段的减毒鼠伤寒沙门菌进行了生物学特性评估。主要进行了对所构建的重组减毒沙门菌菌株SL7207(pVAX-S499-650)(长456bp,编码S蛋白N末端499—650位氨基酸)、SL7207(pVAX-S499-789)(长873bp,编码S蛋白N末端499—789位氨基酸)和前期构建的菌株SL7207(pVAXD-S1-789)(长2 367bp,编码S蛋白N末端1—789位氨基酸)的生物学特性研究,包括生长曲线测定、携带质粒的体内/外稳定性、回肠组织内的转录、在小鼠体内动态增殖规律、小鼠口服的安全性等。结果表明:SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)、SL7207(pVAXDS1-789)3种口服菌株均具有较高的稳定性;携带的目的基因可在肠道组织内转录;菌株在小鼠肝、脾中增殖约5周后逐渐被机体清除;小鼠口服具有良好的安全性。本研究结果表明减毒鼠伤寒沙门菌SL7207可递呈不同长度的S基因抗原片段,为后续开展3种菌株的实际口服免疫效果比较研究奠定了基础。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 S基因 减毒鼠伤寒沙门菌 口服 生物学特性

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携带TGEV DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及安全性与免疫性分析 被引量：9

15

作者 杨恒 刘佳文 +2 位作者 曹三杰 黄小波 文心田 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期72-77,共6页

【目的】探讨以减毒沙门氏菌为载体,进行TGEV DNA疫苗口服免疫可行性。【方法】通过RT-PCR扩增TGEV四川株(SC-H)S基因5’端约2.1 kb的主要抗原位点片段,将其插入真核表达载体pVAX1,构建重组质粒pVAX-S,体外转染COS-7细胞,间接免疫荧光检... 【目的】探讨以减毒沙门氏菌为载体,进行TGEV DNA疫苗口服免疫可行性。【方法】通过RT-PCR扩增TGEV四川株(SC-H)S基因5’端约2.1 kb的主要抗原位点片段,将其插入真核表达载体pVAX1,构建重组质粒pVAX-S,体外转染COS-7细胞,间接免疫荧光检测S基因表达。通过电转化将pVAX-S转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建SL7207(pVAX-S)重组菌,并在体外感染小鼠腹腔巨噬细胞,以RT-PCR、间接免疫荧光检测细胞内S基因的转录与表达情况。将SL7207(pVAX-S)重组菌以5×108、1×109、2×109CFU剂量口服接种BALB/c小鼠,分析其安全性,并以1×109CFU剂量的重组菌3次免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA检测免疫小鼠的血清IgG与肠道粘膜IgA抗体。【结果】成功构建重组质粒pVAX-S,且重组质粒能在COS7细胞中表达。重组菌SL7207(pVAX-S)感染巨噬细胞后检测到目的基因的转录、表达。小鼠口服接种不同剂量重组菌,具有良好的安全性。免疫小鼠于二免后两周可检测到针对TGEV S蛋白的特异性血清IgG与肠道粘膜IgA抗体,且三免后两周与SL7207(pVAX1)空载体免疫组间分别存在显著性差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)。【结论】携带TGEV DNA疫苗的减毒沙门氏菌小鼠试验显示了良好的免疫原性与安全性。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎病毒 S基因 减毒沙门氏菌 DNA疫苗 安全性 免疫原性

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减毒沙门氏菌载体及其在疫苗研究中的应用进展 被引量：6

16

作者 黄小波 曹三杰 +1 位作者 文心田 杨恒 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期478-480,共3页

关键词 沙门氏菌载体 减毒沙门氏菌 疫苗载体 黏膜免疫反应 真核表达质粒 原核表达质粒 基因工程 免疫原性

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猪传染性胃肠炎病毒S-N融合双基因疫苗的构建及其免疫原性分析 被引量：5

17

作者 黄小波 杨恒 +4 位作者 曹三杰 文心田 李春松 廖晓丹 张鑫淼 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期848-853,共6页

为了构建TGEV S-N融合双基因疫苗并分析其免疫原性,从S、N基因克隆质粒中以PCR扩增了S基因(2.1kb,含A、B、C、D抗原位点)和N基因(1.2kb),将S基因插入pVAX1载体构建了pVAX-S质粒,再将N基因插入pVAX-S中S基因末端,构建了融合表达S、N双基... 为了构建TGEV S-N融合双基因疫苗并分析其免疫原性,从S、N基因克隆质粒中以PCR扩增了S基因(2.1kb,含A、B、C、D抗原位点)和N基因(1.2kb),将S基因插入pVAX1载体构建了pVAX-S质粒,再将N基因插入pVAX-S中S基因末端,构建了融合表达S、N双基因的重组质粒pVAX-S-N,将pVAX-S-N转染COS7细胞以免疫荧光试验进行S、N双基因的表达鉴定。用纯化的pVAX-S-N和作为对照的pVAX-S、pVAX1、PBS免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,分别测定免疫后第0、14、28、42天的小鼠血清IgG抗体,测定免疫后第42天小鼠外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+)的数量。结果,融合质粒pVAX-S-N可在COS7细胞特异性表达S、N两个蛋白,pVAX-S-N免疫小鼠后第14天即可诱导产生抗TGEV的特异性IgG,但pVAX-S-N诱导的抗体水平一直低于pVAX-S诱导的抗体水平,在免疫后第42天差异极显著(P<0.01);pVAX-S-N可激发小鼠产生细胞免疫应答,但pVAX-S-N组的CD3+、CD4+、CD8+数量均低于pVAX-S免疫组。研究结果表明,融合双基因疫苗pVAX-S-N具有免疫原性,但免疫效果却不如单基因疫苗pVAX-S的理想。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎病毒 S-N融合基因 DNA疫苗 免疫原性

原文传递

猪轮状病毒OSU株的培养特性与致病性研究 被引量：5

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作者 黄小波 徐璐 +1 位作者 曹三杰 文心田 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期120-123,147,共5页

目的开展猪轮状病毒OSU株的细胞培养特性及致病性研究,确定轮状病毒培养的关键技术与致病规律。方法以MA104细胞培养病毒,对预处理病毒的胰酶浓度与时间、维持液中最佳胰酶浓度等关键条件进行优化,透射电镜观察病毒粒子形态,测定病毒TCI... 目的开展猪轮状病毒OSU株的细胞培养特性及致病性研究,确定轮状病毒培养的关键技术与致病规律。方法以MA104细胞培养病毒,对预处理病毒的胰酶浓度与时间、维持液中最佳胰酶浓度等关键条件进行优化,透射电镜观察病毒粒子形态,测定病毒TCID50,口服感染3d龄仔猪进行致病性试验。结果病毒经20μg/mL胰酶预处理1h,37℃吸附细胞2h,维持液最佳胰酶浓度为4μg/mL,病毒典型细胞病变为病变细胞葡萄串状堆积、胞浆相连、拉网等病变。透射电镜下病毒粒子呈圆形车轮状,直径约80nm。病毒感染3日龄仔猪10h后出现典型的黄色水样腹泻,感染42h后死亡,剖检可见胃内有凝乳块、肠壁变薄充满液体,盲肠、结肠充气。主要病变为:肠上皮细胞变性、坏死、脱落;固有膜高度扩张、充血和伴有轻微出血;粘膜上皮脱落,粘膜下层水肿、炎性细胞浸润等。结论研究阐明了轮状病毒OSU株的培养特性与致病特征。 展开更多

关键词 猪轮状病毒 培养特性 人工感染 致病性

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减毒沙门菌递呈的猪传染性胃肠炎病毒S基因与猪IL-6基因双启动子DNA疫苗的构建 被引量：2

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作者 黄小波 李春松 +4 位作者 曹三杰 文心田 张鑫淼 杨恒 张亮 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期921-926,共6页

从猪传染性胃肠炎病毒克隆质粒pMD19T-S中扩增了2.1kb的S基因片段(含完整的A、B、C、D 4个抗原位点序列),以RT-PCR从猪外周血淋巴细胞中扩增了猪白细胞介素6(IL-6)(658bp),插入同一双启动子真核表达载体pVAXD的2个多克隆位点,构建了共表... 从猪传染性胃肠炎病毒克隆质粒pMD19T-S中扩增了2.1kb的S基因片段(含完整的A、B、C、D 4个抗原位点序列),以RT-PCR从猪外周血淋巴细胞中扩增了猪白细胞介素6(IL-6)(658bp),插入同一双启动子真核表达载体pVAXD的2个多克隆位点,构建了共表达S与IL-6基因的双启动子表达质粒pVAXD-S-IL-6,转染COS7细胞进行转录和表达鉴定。将质粒pVAXD-S-IL-6电转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,筛选获得重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6),并对重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6)的体外稳定性和口服小鼠的安全性进行了鉴定。结果表明该双启动子真核表达质粒pVAXD-S-IL-6构建成功,RT-PCR检测到转染的COS-7细胞中2个目的基因的转录,间接免疫荧光试验结果显示表达产物可与猪抗猪传染性胃肠炎病毒血清发生特异性反应。重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6)在含卡那霉素的抗性培养基中稳定性好,以1×109 CFU灌胃接种小鼠具有良好的安全性。本研究构建了猪传染性胃肠炎病毒的新型口服疫苗株SL7207(pVAXD-S-IL-6),为开展其免疫原性评价奠定了基础。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎病毒 S基因 IL-6基因 减毒鼠伤寒沙门菌 构建 鉴定

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四种血清型胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立 被引量：1

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作者 陈华美 曹三杰 +1 位作者 文心田 肖国生 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期825-829,共5页

根据胸膜肺炎放线杆菌（APP）外膜蛋白OmlA序列设计种特异性引物，根据血清型1、2、6、7荚膜多糖（CPS）序列分别设计型特异性引物，通过优化PCR扩增条件，分别扩增出OralA（952bp）、CPS1（630bp）、CPS2（504bp）、CPS6（720bp）、CPS... 根据胸膜肺炎放线杆菌（APP）外膜蛋白OmlA序列设计种特异性引物，根据血清型1、2、6、7荚膜多糖（CPS）序列分别设计型特异性引物，通过优化PCR扩增条件，分别扩增出OralA（952bp）、CPS1（630bp）、CPS2（504bp）、CPS6（720bp）、CPS7（389bp）特异性片段，建立了既可对APP进行定性检测又可对APP1、2、6、7进行定型检测的多重PCR。特异性试验表明，此多重PCR能从APP1～4、6～10标准株中扩增出与引物相应的特异性片段；对猪副嗜血杆菌、猪肺炎霉形体、多杀性巴氏杆菌、肠炎沙门菌、猪链球菌、大肠杆菌和猪丹毒杆菌进行扩增，均未扩增出片段。敏感性试验表明，此多重PCR能够检测到DNA的量为10pg。45头疑似病猪病料的细菌分离鉴定结果与此多重PCR的鉴定结果一致。上述结果表明，建立的多重PCR适合于APP1、2、6、7的鉴别诊断及流行病学调查。 展开更多

关键词 胸膜肺炎放线杆菌 外膜蛋白基因 荚膜多糖基因 多重PCR 检测

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