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小鼠骨髓和脂肪间充质干细胞定向分化能力的比较研究
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作者 钟家帅 冯玉梅 《天津医药》 CAS 2024年第2期129-135,共7页
目的探讨小鼠骨髓源性间充质干细胞(BM-MSCs)和脂肪源性间充质干细胞(AD-MSCs)的定向分化能力。方法从C57BL/6J小鼠股骨骨髓和腹股沟白色脂肪组织中分别分离和培养BM-MSCs和AD-MSCs,分别使用成骨、成软骨和成脂诱导分化培养基诱导两种... 目的探讨小鼠骨髓源性间充质干细胞(BM-MSCs)和脂肪源性间充质干细胞(AD-MSCs)的定向分化能力。方法从C57BL/6J小鼠股骨骨髓和腹股沟白色脂肪组织中分别分离和培养BM-MSCs和AD-MSCs,分别使用成骨、成软骨和成脂诱导分化培养基诱导两种细胞定向分化。采用茜素红、阿利新蓝和油红O染色检测成骨、成软骨和成脂分化程度;实时荧光定量PCR(q PCR)鉴定MSCs并检测定向分化相关基因Runx2、Sp7(成骨),Sox9、Col2a1(成软骨),Pparg和Cebpa(成脂)表达水平,确定细胞的定向分化能力。基于GEO数据库中GSE43804和GSE122778数据集的小鼠和人类BM-MSCs和AD-MSCs基因表达谱数据,分析差异表达基因及其富集的信号通路。结果分离培养得到的BM-MSCs和AD-MSCs细胞形态不同,AD-MSCs梭形形态更明显;两种细胞均表达CD29、CD44和CD90,不表达CD34和CD45。定向诱导后AD-MSCs的成骨和成脂分化程度高于BM-MSCs,而成软骨分化程度低于BM-MSCs(P<0.05);定向诱导后AD-MSCs中Runx2、Pparg和Cebpa mRNA表达水平高于BM-MSCs,Sox9 mRNA表达水平低于BM-MSCs(P<0.05)。小鼠和人的AD-MSCs高表达的基因富集于PPAR和WNT信号通路,BM-MSCs高表达的基因富集于软骨和骨发育信号通路。结论小鼠AD-MSCs成骨和成脂分化能力强于BM-MSCs,而成软骨分化能力弱于BM-MSCs,PPAR、WNT、软骨和骨发育信号通路的活化状态在决定BM-MSCs和AD-MSCs不同定向分化潜能中起重要调节作用。 展开更多
关键词 间质干细胞 骨髓 脂肪类 PPARγ Wnt信号通路 成骨分化 成软骨分化 成脂分化
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乳腺癌源性肿瘤相关成纤维细胞的永生化及鉴定
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作者 付豪 冯玉梅 《天津医科大学学报》 2024年第4期289-294,共6页
目的:构建可在体外稳定培养和传代的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)并鉴定其生物学特征。方法:取人乳腺浸润性导管癌组织,采用酶解-组织块培养法和差速贴壁法分离纯化CAFs,用免疫荧光检测α-肌动蛋白、血小板源性生长因子受体β和广谱细胞角... 目的:构建可在体外稳定培养和传代的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)并鉴定其生物学特征。方法:取人乳腺浸润性导管癌组织,采用酶解-组织块培养法和差速贴壁法分离纯化CAFs,用免疫荧光检测α-肌动蛋白、血小板源性生长因子受体β和广谱细胞角蛋白;采用人端粒酶表达慢病毒感染CAFs使其永生化;在商品化FGM-2(fibroblast growth medium-2)培养基的基础上添加谷氨酰胺、非必需氨基酸和抗坏血酸以优化培养条件,在体外连续培养传代,并用β-半乳糖苷酶染色鉴定各代细胞中衰老细胞的比例。对构建成功的CAF1、CAF2和CAF3细胞系进行高通量RNA测序,分析差异表达基因(DEGs)及其相关信号通路;基于3个CAF细胞系CAF亚型标志基因的表达水平,鉴定其生物学特征。结果:成功分离原代CAFs,并构建3株永生化CAF细胞系;成功优化了CAFs的培养条件,使CAF细胞系在体外培养时不易发生细胞衰老表型(t=2.972、7.049,均P<0.05);RNA测序结果分析显示,CAF1与CAF2有3150个DEGs,CAF2与CAF3有3544个DEGs;而CAF1与CAF3有343个DEGs。对DEGs进行GO富集分析(gene ontology enrichment analysis)表明,CAF2高表达基因主要参与蛋白水解、细胞外基质重塑、血管生成和细胞黏附等信号通路;CAF1和CAF3高表达基因主要参与细胞分裂、细胞周期、DNA损伤修复和有丝分裂等信号通路。对3个CAF细胞系亚型特征性分析表明,CAF1和CAF 3具有炎性CAFs特征,CAF2具有基质型CAFs特征。结论:成功构建得到3株可在体外稳定传代且具有不同生物学特征的CAF细胞系,为CAFs在乳腺癌发生和进展中作用机制的研究提供了可靠的细胞模型。 展开更多
关键词 乳腺癌 肿瘤相关成纤维细胞 永生化 RNA测序分析 CAF亚型
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GATA3与FOXA1在luminal亚型乳腺癌细胞中相互作用的研究
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作者 赵帅 冯玉梅 《天津医科大学学报》 2024年第5期399-404,共6页
目的:探讨GATA3与FOXA1在luminal亚型乳腺癌细胞中的相互作用。方法:基于cBioportal For Cancer Genomics公共数据库中乳腺癌临床病例数据集,分析luminal A、luminal B和basal-like亚型乳腺癌组织中GATA3与FOXA1mRNA表达水平的相关性;... 目的:探讨GATA3与FOXA1在luminal亚型乳腺癌细胞中的相互作用。方法:基于cBioportal For Cancer Genomics公共数据库中乳腺癌临床病例数据集,分析luminal A、luminal B和basal-like亚型乳腺癌组织中GATA3与FOXA1mRNA表达水平的相关性;利用蛋白-蛋白相互作用数据库STRING和分析工具Cytoscape预测GATA3与FOXA1的相互作用。以luminal亚型的MCF-7和T-47D乳腺癌细胞以及basal-like亚型的MDA-MB-231和SUM-149PT乳腺癌细胞为研究对象,采用RT-qPCR和Western印迹检测GATA3和FOXA1的mRNA和蛋白表达水平;细胞免疫荧光检测GATA3和FOXA1的细胞定位;蛋白质免疫共沉淀验证GATA3与FOXA1之间的相互作用。结果:临床病例数据分析显示GATA3与FOXA1在luminal A、luminal B和basal-like亚型乳腺癌组织中mRNA的表达均呈正相关(r=0.4047、0.4761、0.5876,均P<0.0001)。蛋白质相互作用预测显示GATA3与FOXA1存在潜在的相互作用关系。Luminal乳腺癌细胞中GATA3和FOXA1的mRNA(t=80.95、79.73、33.84、33.60,均P<0.0001;t=15.24、5.21、14.95、14.93,均P<0.001)和蛋白(t=29.63、28.48、36.60、35.60,均P<0.0001;t=34.06、35.30、75.01、74.32,均P<0.0001)表达水平显著高于basal-like细胞。GATA3与FOXA1在MCF-7和T-47D细胞核中共定位。GATA3与FOXA1存在蛋白相互作用。结论:GATA3与FOXA1可能通过相互作用维持luminal亚型乳腺癌表型稳态,抑制肿瘤恶性进展。 展开更多
关键词 luminal亚型乳腺癌 GATA3 FOXA1 蛋白质相互作用
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胫骨注射和左心室注射乳腺癌细胞小鼠骨定植模型的研究
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作者 黄玉凡 李晓青 《天津医科大学学报》 2024年第3期200-204,共5页
目的:探讨胫骨注射和左心室注射乳腺癌细胞构建小鼠骨定植模型的方法。方法:通过对野生型MDA-MB-231乳腺癌细胞进行慢病毒感染,构建稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(LUC)的细胞株。将GFP+/LUC+标记的处于对数生长期的MDA-MB-231乳... 目的:探讨胫骨注射和左心室注射乳腺癌细胞构建小鼠骨定植模型的方法。方法:通过对野生型MDA-MB-231乳腺癌细胞进行慢病毒感染,构建稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(LUC)的细胞株。将GFP+/LUC+标记的处于对数生长期的MDA-MB-231乳腺癌细胞分别以6×10^(3)个/只和1×10^(5)个/只接种BALB/c-nu/nu小鼠和NOD/SCID小鼠,构建胫骨注射模型和左心室注射模型。采用活体成像观察肿瘤细胞在活体小鼠体内的定植部位及分布情况;X线检测观察骨损伤的位置及程度;苏木素-伊红(HE)染色和广谱角蛋白(Pan CK)免疫组化染色定位骨中的肿瘤细胞。结果:经荧光显微镜及活细胞成像检测,表达GFP和LUC的慢病毒对MDA-MB-231细胞感染效率高达95%,且继续传代后GFP和LUC表达效率无明显减退,可用于后续实验。胫骨注射4 h后进行活体成像观察,结果显示小鼠右下肢胫骨出现LUC信号;左心室注射后立即进行活体成像观察,发现肿瘤细胞已循环至全身,表明已成功构建胫骨注射模型及左心室注射模型。30 d进行活体成像观察发现,胫骨注射模型和左心室注射模型腿部出现LUC信号,表明腿部有定植灶形成。X线结果也表明存在骨损伤。HE染色和Pan CK免疫组化染色证实胫骨注射MDA-MB-231乳腺癌细胞小鼠模型100%出现骨定植灶,定植率高,而左心室注射MDA-MB-231乳腺癌细胞小鼠模型仅20%出现骨定植灶。结论:运用活体成像、X线等检测技术联合病理学分析评估胫骨注射及左心室注射乳腺癌细胞骨定植小鼠模型,可提高结果分析的准确性,能为乳腺癌转移机制研究、抗转移治疗等提供实验和理论依据。 展开更多
关键词 胫骨注射 左心室注射 骨定植
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PTH(1-34)诱导骨矿化小鼠实验动物模型的构建及鉴定
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作者 王红丽 李晓青 《天津医科大学学报》 2025年第2期134-138,共5页
目的:探讨骨骼发育及矿化过程,构建骨矿化小鼠实验动物模型。方法:采用甲状旁腺激素(PTH)(1-34)经腹腔注射,诱导6周龄NOD-SCID雌性小鼠成骨细胞分化及骨组织矿化,从而构建骨矿化小鼠实验动物模型。进一步应用Micro-CT检测骨密度,应用钙... 目的:探讨骨骼发育及矿化过程,构建骨矿化小鼠实验动物模型。方法:采用甲状旁腺激素(PTH)(1-34)经腹腔注射,诱导6周龄NOD-SCID雌性小鼠成骨细胞分化及骨组织矿化,从而构建骨矿化小鼠实验动物模型。进一步应用Micro-CT检测骨密度,应用钙黄绿素和盐酸四环素荧光标记检测骨矿化沉积率,应用冯库萨染色鉴定钙盐沉积,并应用马松染色检测骨胶原容积分数,以鉴定小鼠骨组织矿化水平,确定骨矿化小鼠模型是否构建成功。结果:Micro-CT检测发现,PTH(1-34)诱导20 d可以显著增加骨小梁相对体积分数(BV/TV,t=9.473,P<0.001)和骨小梁厚度(Tb.Th,t=18.64,P<0.001),显著减少骨小梁间距(Tb.Sp,t=7.794,P<0.01)。双荧光标记显示,PTH(1-34)处理后骨矿化沉积率(MAR)显著提高(t=29.99,P<0.001)。冯库萨染色显示,PTH(1-34)处理组冯库萨阳性面积(VK.A)显著增加(t=2.914,P<0.05)。马松染色显示,PTH(1-34)处理后胶原容积分数(CVF)显著提升(t=13.94,P<0.001)。结论:PTH(1-34)可有效诱导小鼠骨骼矿化,成功构建骨矿化小鼠实验动物模型。 展开更多
关键词 甲状旁腺激素(1-34) 骨矿化 骨密度 实验动物模型
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DNA损伤修复蛋白PARP1聚ADP-核糖基化有丝分裂蛋白BUB3调控HeLa细胞的有丝分裂 被引量:1
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作者 杨雪 徐波 《陆军军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第16期1682-1692,共11页
目的探讨DNA损伤修复蛋白聚ADP-核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP1]对HeLa细胞有丝分裂的影响及其分子机制。方法使用流式细胞术、细胞免疫荧光、活细胞成像检测PARP1对HeLa细胞有丝分裂进程的影响。采用染色体核型分析... 目的探讨DNA损伤修复蛋白聚ADP-核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP1]对HeLa细胞有丝分裂的影响及其分子机制。方法使用流式细胞术、细胞免疫荧光、活细胞成像检测PARP1对HeLa细胞有丝分裂进程的影响。采用染色体核型分析、细胞免疫荧光检测PARP1对HeLa细胞染色体稳定性的影响。使用蛋白免疫印迹和免疫共沉淀检测HeLa细胞有丝分裂期PARP1的蛋白表达及酶活性变化。使用蛋白质组质谱分析方法鉴定与PARP1在有丝分裂期具有特异性相互作用的蛋白并进行免疫共沉淀及聚ADP-核糖基化实验验证。结果流式细胞术和细胞免疫荧光结果显示,敲低PARP1或使用奥拉帕尼抑制PARP1的酶活性后,HeLa细胞对诺考达唑诱导的有丝分裂阻滞反应显著下降(P<0.05)。活细胞成像结果显示,敲低PARP1后HeLa细胞的平均有丝分裂时间缩短(P<0.01)。染色体核型分析和免疫荧光结果显示,敲低PARP1后非整倍体细胞和多极纺锤体细胞的比例明显增加(P<0.05)。蛋白免疫印迹结果显示有丝分裂期PARP1的蛋白表达量无明显变化,免疫共沉淀实验结果显示其酶活性显著增加。蛋白质组质谱鉴定和免疫共沉淀结果显示,PARP1与有丝分裂检查点复合体(mitotic checkpoint complex,MCC)的主要组成蛋白BUB3在有丝分裂期具有特异性相互作用,并且BUB3可以发生聚ADP-核糖基化修饰。结论DNA损伤修复蛋白PARP1可能通过上调其酶活性并聚ADP-核糖基化MCC蛋白BUB3以调控HeLa细胞有丝分裂的正常进行并维持其染色体稳定性。 展开更多
关键词 DNA损伤修复 有丝分裂 聚ADP-核糖聚合酶1 PARP抑制剂
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组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589抑制基底样乳腺癌生长和转移 被引量:1
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作者 庄慧萍 《天津医科大学学报》 2022年第5期478-482,共5页
目的:探究组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对基底样乳腺癌(BLBC)生长和转移的抑制作用。方法:通过MTT法和平板克隆实验检测LBH589对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和小鼠乳腺癌细胞系4T1增殖能力的影响;Transwell实验检测LBH589对细胞迁移和侵... 目的:探究组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对基底样乳腺癌(BLBC)生长和转移的抑制作用。方法:通过MTT法和平板克隆实验检测LBH589对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和小鼠乳腺癌细胞系4T1增殖能力的影响;Transwell实验检测LBH589对细胞迁移和侵袭能力的影响;实时荧光定量PCR和免疫印迹实验检测LBH589对细胞上皮-间质转化的作用;构建4T1乳腺癌细胞Balb/c小鼠脂肪垫成瘤模型,腹腔注射LBH589,观察4T1细胞成瘤和转移能力。结果:体外实验结果显示,与对照组相比,LBH589显著抑制MDA-MB-231和4T1细胞的增殖能力(t=11.37,P<0.05;t=18.18,P<0.05)、克隆形成能力(t=7.76,P<0.05;t=15.22,P<0.05)、迁移(t=8.8,P<0.05;t=18.0,P<0.05)和侵袭能力(t=8.24,P<0.05;t=15.99,P<0.05);与对照组相比,LBH589上调细胞的上皮标志物CDH1的mRNA(t=7.33,P<0.05)表达水平,抑制细胞的间充质标志物VIM和FN1的mRNA(t=5.57,P<0.05;t=6.3,P<0.05)和蛋白(t=8.37,P<0.05;t=11.3,P<0.05)表达水平;体内实验结果表明,给予LBH589治疗显著抑制肿瘤的生长(t=6.3,P<0.05),并抑制其肺转移(P<0.05)。结论:LBH589能够抑制BLBC细胞增殖和转移,具有潜在的临床应用价值。 展开更多
关键词 HDACIs LBH589 基底样乳腺癌 增殖 转移
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FOXQ1敲除乳腺癌MCF7细胞株的构建及其功能初探
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作者 杨欢 冯玉梅 《天津医科大学学报》 2023年第5期500-506,共7页
目的:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在乳腺癌细胞MCF7中稳定敲除FOXQ1,并初探其在缺氧环境中的功能。方法:Cas9慢病毒感染MCF7构建工具细胞,在工具细胞中分别转染靶向3个不同靶位点的FOXQ1-crRNA+tracrRNA,用T7E1酶筛选出编辑效率高的细... 目的:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在乳腺癌细胞MCF7中稳定敲除FOXQ1,并初探其在缺氧环境中的功能。方法:Cas9慢病毒感染MCF7构建工具细胞,在工具细胞中分别转染靶向3个不同靶位点的FOXQ1-crRNA+tracrRNA,用T7E1酶筛选出编辑效率高的细胞挑取单克隆细胞株;利用T7E1酶、Sanger测序和Western印迹检测FOXQ1基因的编辑和表达情况;Western印迹检测常氧/缺氧条件下细胞FOXQ1表达情况;在常氧/缺氧条件下通过划痕实验和transwell实验检测细胞迁移能力;通过METABRIC数据库分析乳腺癌中FOXQ1与HIF1A及其编码蛋白靶基因LOX、LDHA和GLUT3表达的相关性。结果:筛选出转染靶向CCCGTGCGCATCCAGGACAT序列的FOXQ1-crRNA的细胞具有最高编辑效率;T7E1酶切、Sanger测序和Western印迹结果显示稳定敲除FOXQ1的乳腺癌MCF7细胞构建成功;缺氧促进MCF7细胞FOXQ1的表达;缺氧促进MCF7的迁移能力(t=3.78,P<0.01;t=11.94,P<0.001),敲除FOXQ1后缺氧对MCF7迁移能力的促进作用被抑制(t=0.63,P=0.55;t=2.54,P=0.064)、(t=2.46,P<0.05;t=4.95,P<0.05),乳腺癌中FOXQ1与HIF1A、LOX、LDHA和GLUT3的表达均显著正相关(P<0.0001)。结论:通过CRISPR/Cas9系统成功构建了FOXQ1基因稳定敲除的乳腺癌MCF7细胞株,并发现FOXQ1介导了缺氧对MCF7细胞迁移能力的促进作用,为进一步探究乳腺癌的缺氧微环境中FOXQ1的功能及其机制奠定了基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 FOXQ1 基因敲除 乳腺癌 缺氧
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MMTV-PyMT转基因小鼠自发成瘤乳腺癌细胞的分离培养及鉴定
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作者 颜文欣 冯玉梅 《天津医科大学学报》 2023年第1期9-14,共6页
目的:分离培养小鼠乳腺肿瘤病毒介导多瘤病毒中间T抗原(MMTV-PyMT)转基因小鼠自发成瘤的乳腺癌细胞,初步研究其生长特性、分子表型、体内成瘤和转移能力。方法:取MMTV-PyMT小鼠自发成瘤的乳腺癌组织(n=3),采用酶解贴壁培养法进行原代细... 目的:分离培养小鼠乳腺肿瘤病毒介导多瘤病毒中间T抗原(MMTV-PyMT)转基因小鼠自发成瘤的乳腺癌细胞,初步研究其生长特性、分子表型、体内成瘤和转移能力。方法:取MMTV-PyMT小鼠自发成瘤的乳腺癌组织(n=3),采用酶解贴壁培养法进行原代细胞分离并传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态特征;采用CCK-8检测细胞的增殖能力;通过Western印迹检测细胞的雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)表达以鉴定细胞分子亚型。将分离培养的细胞接种于C57BL/6雌性小鼠(n=4)乳腺脂肪垫,观察细胞成瘤能力和生长特性;取肿瘤组织和内脏器官,制备组织切片后采用苏木精-伊红(HE)染色,观察组织形态学特点;采用免疫组织化学(IHC)染色检测ER、PR、HER2及Ki-67蛋白表达,分析分子分型。结果:成功分离得到MMTV-PyMT转基因小鼠自发成瘤的乳腺癌细胞(MMTV-PyMT细胞)并可稳定生长和传代,细胞倍增时间为56.0 h;MMTV-PyMT细胞可在C57BL/6雌性小鼠乳腺脂肪垫成瘤并生长,但未见远处内脏转移。该细胞在细胞学和组织学中的分子分型皆为HER2过表达亚型,肿瘤组织中Ki-67阳性表达率为34%。结论:成功构建得到可体外稳定传代并具有体内成瘤能力的HER2过表达分子亚型小鼠乳腺癌细胞系,该细胞可作为HER2过表达亚型乳腺癌体内、外实验研究的细胞模型。 展开更多
关键词 小鼠乳腺癌细胞系 原代培养 HER2过表达分子亚型
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