改良法培养骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的实验研究 被引量：11

1

作者 郭立达 王捷 夏冰 《实用医学杂志》 CAS 2006年第2期131-133,共3页

目的:研究大鼠骨髓基质干细胞的生长特点和在诱导条件下的成骨能力。方法:通过改良的骨髓培养法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,应用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的诱导分化培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并检测骨钙素的分... 目的:研究大鼠骨髓基质干细胞的生长特点和在诱导条件下的成骨能力。方法:通过改良的骨髓培养法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,应用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的诱导分化培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并检测骨钙素的分泌、碱性磷酸酶的活性和细胞矿化作用。结果:原代培养基质干细胞首先形成细胞集落,12d时集落间接近融合;传代细胞体积变大,约5～7d传代一次。诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,并出现了矿化结节。结论:骨髓基质干细胞易于分离培养及体外扩增,成骨能力肯定,可作为骨组织工程的种子细胞。 展开更多

关键词 成骨细胞 骨髓基质干细胞 诱导分化 大鼠

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人骨唾液蛋白基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 被引量：13

2

作者 王捷 董燕 +2 位作者 张宏斌 武婕 郑文岭 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期325-329,共5页

利用RT PCR技术 ,从人骨膜组织总RNA中扩增长度为 1kb的人骨唾液蛋白 (bonesialoprotein ,BSP)基因编码区序列 ,克隆至pBluescriptⅡ ,进行双链核苷酸序列测定 .构建人BSP毕赤酵母表达质粒pPICZaA hBSP并导入毕赤酵母PichiapastorisGS1 ... 利用RT PCR技术 ,从人骨膜组织总RNA中扩增长度为 1kb的人骨唾液蛋白 (bonesialoprotein ,BSP)基因编码区序列 ,克隆至pBluescriptⅡ ,进行双链核苷酸序列测定 .构建人BSP毕赤酵母表达质粒pPICZaA hBSP并导入毕赤酵母PichiapastorisGS1 1 5 .SDS PAGE和Western印迹检测rhBSP的分泌表达 .采用镍离子亲合层析纯化rhBSP并检测生物学活性 .结果表明 ,克隆片段与基因库所登录的序列相一致 ,分泌表达的rhBSP His融合蛋白分子量约为 6 7kD ,占培养上清总蛋白的 80 % ,浓度约为 0 2 4 8g L 。 展开更多

关键词 骨 唾液糖蛋白 分泌表达 毕赤酵母

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骨唾液蛋白(BSP)高稳定表达对乳腺癌骨转移的促进作用 被引量：13

3

作者 杜红延 王捷 +2 位作者 杨静 郑霖 刘大志 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期815-816,829,共3页

目的了解乳腺癌细胞中骨唾液蛋白(BSP)高稳定表达对其骨转移的影响,为乳腺癌骨转移的预防和治疗寻找新的药物靶点。方法通过鸡胚尿囊绒膜实验和骨条黏附实验确定BSP的高稳定表达对乳腺癌细胞血管侵袭能力及骨条黏附能力的影响。将乳腺... 目的了解乳腺癌细胞中骨唾液蛋白(BSP)高稳定表达对其骨转移的影响,为乳腺癌骨转移的预防和治疗寻找新的药物靶点。方法通过鸡胚尿囊绒膜实验和骨条黏附实验确定BSP的高稳定表达对乳腺癌细胞血管侵袭能力及骨条黏附能力的影响。将乳腺癌细胞种植于鸡胚尿囊膜的上部空腔,经过孵育收集下囊腔血管组织,PCR检测人特异的Alu基因,以了解乳腺癌细胞的血管侵袭能力;将乳腺癌细胞与经胶原酶和胰蛋白酶消化的骨条共同孵育,胰酶消化收集乳腺癌细胞,通过染色测定OD_(488)值来确定乳腺癌细胞对骨条的黏附。结果空白对照组和未经转染的乳腺癌细胞组各5个鸡胚中均没有扩增出人的Alu基因,BSP高稳定表达的乳腺癌细胞MDA-MB-231BO(pI)和MDA-MB-231BO(piE))各5个鸡胚中分别有4个和3个扩增出人Alu基因;乳腺癌细胞MDA-MB-231BO(pI)和MDA-MB-231BO(pID)的骨条黏附实验测得的488nm处的吸光度值分别为0.580±0.046和0.490±0.039,明显高于未经转染的乳腺癌细胞组(0.260±0.021,P<0.05)和空白对照组(0.034±0.003,P<0.01)。结论BSP的高稳定表达增加了乳腺癌细胞的血管侵袭能力,提高了乳腺癌细胞的骨条黏附能力,可能对乳腺癌的骨转移有一定促进作用。 展开更多

关键词 唾液糖蛋白类 乳腺肿瘤 肿瘤转移

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抗重组人骨唾液酸蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：6

4

作者 王捷 刘增田 +3 位作者 杨太成 杨静 冼江 刘大志 《中国生化药物杂志》 CAS CSCD 2006年第6期323-325,共3页

目的研制重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法以纯化的rhBSP免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗rhBSP mAb;用亚型鉴定试剂条鉴定IgG亚类;ELISA鉴定mAb的特异性和效价。结果获得2株能稳定分泌特异性mAb的抗rh... 目的研制重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法以纯化的rhBSP免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗rhBSP mAb;用亚型鉴定试剂条鉴定IgG亚类;ELISA鉴定mAb的特异性和效价。结果获得2株能稳定分泌特异性mAb的抗rhBSP的杂交瘤细胞系AHB1和AHB5,Ig亚类分别为IgG2a和IgG1,轻链均为κ型,其效价分别为1×10-3和1×10-7。腹水mAb经Protein A亲和色谱柱纯化后,纯度达92%以上。结论获得抗rhBSP的mAb,为进一步研究BSP的生物学功能和用于临床诊断实验研究创造了条件。 展开更多

关键词 人骨唾液酸蛋白 单克隆抗体 重组 制备 特性鉴定

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抗克伦特罗噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定 被引量：9

5

作者 潘科 王弘 +4 位作者 张宏斌 王捷 雷红涛 杨金易 孙远明 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2005年第11期51-54,共4页

利用噬菌体展示技术构建克伦特罗(CBL)单链抗体(scFv)库,从中筛选CBL特异性噬菌体scFv,从而成功扩增出抗CBL的VL,VH基因片段并采用重叠延伸PCR拼接为全长的scFv基因片段,抗体库库容约为1.6×104,经4轮吸附—洗脱—扩增的富集,采用... 利用噬菌体展示技术构建克伦特罗(CBL)单链抗体(scFv)库,从中筛选CBL特异性噬菌体scFv,从而成功扩增出抗CBL的VL,VH基因片段并采用重叠延伸PCR拼接为全长的scFv基因片段,抗体库库容约为1.6×104,经4轮吸附—洗脱—扩增的富集,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法筛选到6个具有CBL结合活性的噬菌体scFv,为进一步大量表达CBL单链抗体奠定了基础. 展开更多

关键词 克伦特罗 单链抗体 噬菌体展示

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骨唾液蛋白非融合荧光蛋白载体的构建及其在特异性骨转移乳腺癌细胞中的稳定表达 被引量：3

6

作者 杜红延 王捷 +3 位作者 郭勇 郑霖 杨静 刘大志 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期410-412,共3页

目的构建骨唾液蛋白(BSP)非融合荧光表达载体,建立稳定高效表达BSP和荧光蛋白的乳腺癌细胞系,为进一步研究BSP在乳腺癌细胞骨转移中的作用奠定基础。方法从构建好的pB hBSP载体中用PCR方法扩增hBSP基因,通过BglⅡ和PstⅠ两个限制性酶切... 目的构建骨唾液蛋白(BSP)非融合荧光表达载体,建立稳定高效表达BSP和荧光蛋白的乳腺癌细胞系,为进一步研究BSP在乳腺癌细胞骨转移中的作用奠定基础。方法从构建好的pB hBSP载体中用PCR方法扩增hBSP基因,通过BglⅡ和PstⅠ两个限制性酶切位点定向克隆至真核表达载体pIRES2EGFP,构建重组载体pIRES2hBSP EGFP。利用脂质体转染的方法将构建好的重组质粒转入特异性骨转移的乳腺癌细胞株MDA MB231BO中,并利用G418和流式细胞仪筛选阳性克隆。结果成功构建hB SP和EGFP非融合表达的真核表达载体pIRES2hBSP EGFP,并成功转染特异骨转移的乳腺癌细胞株,获得hBSP的稳定转染细胞株,荧光显微镜下可观察到荧光蛋白标记。结论真核表达载体pIRES2hBSP EGFP的构建及hBSP稳定转染细胞株的获得为研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定了的基础。 展开更多

关键词 骨唾液蛋白 荧光蛋白 乳腺癌细胞 基因转染 稳定表达 非融合荧光蛋白载体 特异性骨转移

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重组人骨唾液酸蛋白的纯化及生物学活性研究 被引量：3

7

作者 董燕 王捷 +2 位作者 谭刘欣 张宏斌 武婕 《中国生化药物杂志》 CAS CSCD 2006年第2期71-74,78,共5页

目的对毕赤酵母表达的重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)进行纯化和活性研究,为进一步研究BSP功能活性,揭示相关病理机制奠定基础。方法毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPICZαA-hbsp工程菌能高效分泌表达rhB-SP,采用Ni-NTA介质以亲和色谱法纯... 目的对毕赤酵母表达的重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)进行纯化和活性研究,为进一步研究BSP功能活性,揭示相关病理机制奠定基础。方法毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPICZαA-hbsp工程菌能高效分泌表达rhB-SP,采用Ni-NTA介质以亲和色谱法纯化rhBSP。通过羟基磷灰石(HA)晶体生长抑制实验、细胞黏附实验和鸡胚尿囊绒膜实验分析rhBSP的生物学活性。结果纯化的rhBSP达到电泳纯,并能抑制HA晶体生长,可介导乳腺癌细胞黏附和促进血管生成。结论纯化的rhBSP具有良好的生物学活性,可用于进一步研究BSP相关的病理、生理机制。 展开更多

关键词 人骨唾液酸蛋白 毕赤酵母 表达 纯化 活性

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BSP的高稳定表达对乳腺癌细胞生物学行为的影响 被引量：3

8

作者 杜红延 王捷 +2 位作者 郑霖 杨静 刘大志 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期428-430,共3页

目的研究骨唾液蛋白(BSP)的高稳定表达对乳腺癌细胞生物学行为的影响,揭示BSP在乳腺癌骨转移中的作用。方法通过细胞生长曲线实验、肿瘤细胞克隆形成率实验以及细胞黏附性实验,研究高稳定表达hBSP对乳腺癌细胞生物学行为的影响。结果hBS... 目的研究骨唾液蛋白(BSP)的高稳定表达对乳腺癌细胞生物学行为的影响,揭示BSP在乳腺癌骨转移中的作用。方法通过细胞生长曲线实验、肿瘤细胞克隆形成率实验以及细胞黏附性实验,研究高稳定表达hBSP对乳腺癌细胞生物学行为的影响。结果hBSP的高稳定表达增加了乳腺癌细胞MDA-MB-231BO(pI)和MDA-MB-231BO(pID)的生长速率,提高了其活性和致瘤性。乳腺癌细胞MDA-MB-231BO的克隆形成率为8.90%±0.53%,明显低于MDA-MB-231BO(pI)和MDA-MB-231BO(pID)(分别为15.6%±0.94%和12.8%±0.77%),同时乳腺癌细胞MDA-MB-231BO的细胞贴壁率OD620的值(0.29±0.017)也明显低于MDA-MB-231BO(pI)和MDA-MB-231BO(pID)(分别为0.52±0.03和0.43±0.03)。结论hBSP具有一定的自分泌作用,增加BSP的表达促进乳腺癌细胞骨转移的发生。 展开更多

关键词 唾液糖蛋白类 乳腺肿瘤 肿瘤转移

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抗克伦特罗单链抗体表达载体的构建与鉴定 被引量：4

9

作者 王弘 梁艳 +5 位作者 杨金易 刘细霞 张宏斌 雷红涛 沈玉栋 孙远明 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期1470-1474,共5页

为构建克伦特罗(Clenbuterol,CBL)单链抗体(scFv)表达载体,实现其在大肠杆菌中的表达。以pCANTAB5E-CBL质粒为模板,扩增CBL的scFv基因,与pPICZαA载体重组,然后以重组质粒pPICZαA-scFv为模板扩增scFv及其相连的6个组氨酸(6×His)片... 为构建克伦特罗(Clenbuterol,CBL)单链抗体(scFv)表达载体,实现其在大肠杆菌中的表达。以pCANTAB5E-CBL质粒为模板,扩增CBL的scFv基因,与pPICZαA载体重组,然后以重组质粒pPICZαA-scFv为模板扩增scFv及其相连的6个组氨酸(6×His)片段,再与载体pBV220连接,转化大肠杆菌DH5α,阳性克隆质粒经酶切和PCR鉴定后进行目的片段的序列测定。重组菌经温度诱导表达重组单链抗体,并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用竞争ELISA检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒pBV220-scFv含有插入片段,与原序列的同源性达99.8%。重组蛋白的分子量接近37kD,能够被抗His标签单克隆抗体特异性识别且可被游离的CBL竞争性抑制,IC50值为4.55ng/mL。这说明我们成功构建了重组质粒pBV220-scFv并实现了其在大肠杆菌中的表达,为进一步进行CBL免疫法快速检测奠定了一定的基础。 展开更多

关键词 克伦特罗 重组单链抗体 原核表达

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hBSP与GFP非融合表达载体的构建及乳腺癌细胞转染条件优化 被引量：2

10

作者 杜红延 王捷 +3 位作者 郭勇 郑霖 杨静 刘大志 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2005年第11期46-50,共5页

为进一步研究骨唾液蛋白(BSP)在乳腺癌细胞骨转移的整个过程中的作用,首先要建立稳定高效表达BSP的乳腺癌细胞系.文中首先从构建好的pB-hBSP载体中亚克隆hbsp基因,构建重组质粒pIRES2-hBSP-EGFP,然后利用脂质体介导转染特异性骨转移的... 为进一步研究骨唾液蛋白(BSP)在乳腺癌细胞骨转移的整个过程中的作用,首先要建立稳定高效表达BSP的乳腺癌细胞系.文中首先从构建好的pB-hBSP载体中亚克隆hbsp基因,构建重组质粒pIRES2-hBSP-EGFP,然后利用脂质体介导转染特异性骨转移的乳腺癌细胞MDA-MB-231BO,优化一系列转染条件以提高转染效率,再利用G418和流式细胞仪筛选获得稳定转染细胞.结果发现:在96孔板中,细胞融合度达到90%;用1μg脂质体介导280 ng重组质粒转染10 h,转染效率最高可达(19.70±1.10)%. 展开更多

关键词 骨唾液蛋白 荧光蛋白 重组表达载体 乳腺癌细胞 转染 优化

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人骨唾液蛋白膜靶向表达载体的构建及在乳腺癌细胞中的表达 被引量：2

11

作者 杜红延 王捷 +2 位作者 郑霖 杨静 刘大志 《广东医学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期659-661,共3页

目的构建人骨唾液蛋白(BSP)膜靶向表达载体,并转染人乳腺癌细胞,筛选获得稳定转染细胞,为进一步体内外研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定基础。方法通过PCR的方法从pB-hBSP载体中亚克隆人骨唾液蛋白hbsp基因,定向克隆至细胞膜靶向定位... 目的构建人骨唾液蛋白(BSP)膜靶向表达载体,并转染人乳腺癌细胞,筛选获得稳定转染细胞,为进一步体内外研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定基础。方法通过PCR的方法从pB-hBSP载体中亚克隆人骨唾液蛋白hbsp基因,定向克隆至细胞膜靶向定位真核表达载体pDisplayTM中,构建中间重组载体pDisplay-hB-SP,再次通过PCR的方法从构建的pDisplay-hBSP载体中亚克隆出膜靶向信号肽、hbsp以及细胞膜定位蛋白基因,定向克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP,构建重组复合载体pID-hBSP-EGFP,利用脂质体转染特异性骨转移的乳腺癌细胞。结果重组载体pDisplay-hBSP和pID-hBSP-EGFP插入目的片段的测序结果与Genbank中发表的BSP序列基本一致。结论成功构建了人骨唾液蛋白膜靶向表达载体,并且经转染后成功在特异性骨转移的乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO中表达。为下一步进行体内外试验研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定基础。 展开更多

关键词 骨唾液蛋白 细胞膜 绿色荧光蛋白 乳腺癌细胞 表达

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低功率毫米波辐照对HL60细胞增殖的影响 被引量：2

12

作者 赖晃文 赖声礼 +3 位作者 杨传红 冼江 武婕 江悦华 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期831-833,共3页

目的为探讨低功率毫米波对HL60细胞活力影响的机制。方法应用细胞培养、活细胞计数、光镜、电镜及增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)免疫组化染色及图像分析等方法,检测低功率(功率密度约2mW/cm2)及频率41.32GH... 目的为探讨低功率毫米波对HL60细胞活力影响的机制。方法应用细胞培养、活细胞计数、光镜、电镜及增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)免疫组化染色及图像分析等方法,检测低功率(功率密度约2mW/cm2)及频率41.32GHz的毫米波辐照HL60白血病细胞增殖的影响;分为辐照时间15、30、45、60min组和对照组(0min组)共5组。结果与对照组比较,毫米波辐照45min和60min组,HL60细胞活性增加和PCNA阳性细胞增多,光镜观察各组未见明显差别,超微结构显示HL60细胞形态呈增殖改变。结论低功率毫米波辐照对HL60细胞有促进增殖的作用。 展开更多

关键词 毫米波 HL60细胞 增殖细胞核抗原 超微结构

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骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向诱导分化 被引量：5

13

作者 郭立达 王捷 夏冰 《生命的化学》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期190-192,共3页

骨髓基质干细胞具有间充质干细胞的特性,表现为较强的增殖能力和向多种间充质细胞分化的潜能。目前已经建立了体外培养骨髓基质干细胞的方法,可定向诱导为成骨细胞。成骨细胞是骨组织形成过程中的一种重要细胞,在骨缺损的修复过程中起... 骨髓基质干细胞具有间充质干细胞的特性,表现为较强的增殖能力和向多种间充质细胞分化的潜能。目前已经建立了体外培养骨髓基质干细胞的方法,可定向诱导为成骨细胞。成骨细胞是骨组织形成过程中的一种重要细胞,在骨缺损的修复过程中起关键作用,特别对构建用于修复骨缺损的组织工程化骨组织来说尤其重要,但成骨分化的调控机制和应用值得进一步研究。 展开更多

关键词 骨髓基质干细胞 诱导分化 成骨细胞

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改良体外培养方法及诱导剂配比条件下骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化(英文) 被引量：2

14

作者 郭立达 夏冰 王捷 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2008年第25期4971-4974,共4页

背景：骨髓间充质干细胞取材方便，易于体外扩增，其体外培养方法及诱导分化仍需要改良。目的：对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养方法及诱导剂配比进行改良，观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的潜能。设计：观察实验。单位：解放军广... 背景：骨髓间充质干细胞取材方便，易于体外扩增，其体外培养方法及诱导分化仍需要改良。目的：对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养方法及诱导剂配比进行改良，观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的潜能。设计：观察实验。单位：解放军广州军区广州总医院医学实验科。材料：实验于2004-07／2006-06在解放军广州军区总医院医学实验科干细胞组织工程实验室完成，选用20只成年SD大鼠，清洁级，雌雄不拘，体质量140-180g，由解放军广州军区广州总医院动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。β-甘油磷酸纳，地塞米松，维生素C均为美国Sigma公司产品，羊抗大鼠骨钙素抗体购自美国DSL公司，S—P免疫组化试剂盒为福建迈新生物技术开发有限公司产品。方法：采用改良法进行细胞的培养及诱导细胞成骨。①骨髓间充质干细胞分离及培养：大鼠麻醉后处死分离双侧股骨、胫骨骨髓制备单细胞悬液接种于培养瓶中，培养后48及96h半量更换培养液，以去除未贴壁的造血细胞，以后每3d换液1次，进一步去除未贴壁的细胞，待细胞汇合约80％时，用0．25％胰蛋白酶消化，按1：2传代培养。将第2代骨髓间充质干细胞接种于6孔培养板和玻璃平皿中，48h后吸去基础培养液。②骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化：应用含终浓度分别为10mmol/L、10^-7mol/L、50mg／L的地塞米松、β-甘油磷酸纳和维生素C的诱导分化培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化。主要观察指标：①应用改良的培养方法及自行配比的培养液诱导分化后10d采用钙钻法测定碱性磷酸酶活性。②培养后12d采用免疫组织化学法检测骨钙素分泌情况。③诱导培养后2周采用Vonkossa染色检测细胞矿化作用。结果：①碱性磷酸酶活性：经诱导后细胞碱性磷酸酶染色明显，胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀，碱性磷酸酶活性部位呈棕黑色。②骨钙素分泌情况：细胞经诱导后骨钙素阳性较明显，胞核呈蓝色，胞浆呈棕色。③细胞矿化作用：细胞经诱导培养后呈复层生长，并出现不透明结节，Von kossa染色可见黑色的矿化结节颗粒，颗粒大小不均一，提示有矿化基质沉积。结论：改良法可成功培养及诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨。 展开更多

关键词 骨髓间充质干细胞 诱导分化 成骨 细胞 组织工程 大鼠

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抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白表达条件的初步研究 被引量：1

15

作者 刘细霞 王弘 +4 位作者 杨金易 张宏斌 雷红涛 沈玉栋 孙远明 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期161-165,共5页

初步研究抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(CBLscFv-AP)的表达条件,提高CBLscFv-AP融合蛋白的表达量。采用液体发酵法培养抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(CBLscFv-AP)基因工程菌,研究不同宿主菌、初始pH、诱导时期、诱导... 初步研究抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(CBLscFv-AP)的表达条件,提高CBLscFv-AP融合蛋白的表达量。采用液体发酵法培养抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(CBLscFv-AP)基因工程菌,研究不同宿主菌、初始pH、诱导时期、诱导时间和培养基对CBLscFv-AP融合蛋白表达量的影响以及重组质粒的稳定性。选用E·coliBL21(DE3)pLysS为宿主菌,在初始pH为7·4的LB培养基中培养至A600nm为0·8～0·9时,诱导表达8h,为CBLscFv-AP融合蛋白最佳表达条件。而且重组质粒pBV220-scFv-phoA具有较好的结构稳定性。在该表达条件下,提高了CBLscFv-AP融合蛋白的表达量,为进行大规模发酵生产CBLscFv-AP融合蛋白奠定基础。 展开更多

关键词 克伦特罗 单链抗体 碱性磷酸酶 融合蛋白 表达条件

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重组人血管生长素包涵体复性条件研究 被引量：1

16

作者 王捷 李烈军 +1 位作者 张宏斌 林白雪 《中国生化药物杂志》 CAS CSCD 2007年第4期257-259,共3页

目的 摸索重组人血管生长素（rhANG）复性影响条件,以提高rhANG的复性效率.方法 超声波破碎菌体,变性萃取rhANG包涵体.分析rhANG包涵体起始浓度、氧化型、还原型谷胱甘肽比例、盐酸胍和添加精氨酸对复性的影响.结果 在0.1 mol/L Tris-HC... 目的 摸索重组人血管生长素（rhANG）复性影响条件,以提高rhANG的复性效率.方法 超声波破碎菌体,变性萃取rhANG包涵体.分析rhANG包涵体起始浓度、氧化型、还原型谷胱甘肽比例、盐酸胍和添加精氨酸对复性的影响.结果 在0.1 mol/L Tris-HCl pH 7～8,还原型、氧化型谷胱甘肽比率为5,盐酸胍为0.2～0.5 mol/L,起始蛋白质浓度0.1～0.2 mg/mL时,rhANG蛋白复性率为60%;0.5 mol/L L-精氨酸有助于复性.结论 初步优化rhANG包涵体复性参数,为rhANG的放大制备创造了条件. 展开更多

关键词 重组 人血管生长素 包涵体 复性

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大鼠骨髓基质干细胞的成骨诱导及鉴定 被引量：1

17

作者 郭立达 王捷 夏冰 《中国康复医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期678-679,F0005,共3页

目的:研究大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)在体外培养、诱导后的形态学改变及生物活性,探讨BMSCs作为骨组织工程种子细胞的可能性和可行性。方法:通过改良的骨髓培养法分离成年大鼠BMSCs,经条件培养液诱导培养后,进行形态学观察和碱性磷酸酶(... 目的:研究大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)在体外培养、诱导后的形态学改变及生物活性,探讨BMSCs作为骨组织工程种子细胞的可能性和可行性。方法:通过改良的骨髓培养法分离成年大鼠BMSCs,经条件培养液诱导培养后,进行形态学观察和碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)的测定。结果:经过体外成骨诱导的BMSCs表现出增殖、聚集、结节和矿化期的阶段性形态特征,同时在诱导2周后表达ALP活性,在结节期和矿化期OCN表达呈阳性。结论:体外成骨定向诱导的BMSCs具有典型的成骨细胞的形态和功能性特征,可以作为骨组织工程的种子细胞。 展开更多

关键词 骨髓基质干细胞 成骨诱导 碱性磷酸酶 骨钙素

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大鼠骨髓间充质干细胞定向成骨诱导的动态观察(英文) 被引量：1

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作者 郭立达 夏冰 王捷 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2008年第16期3175-3178,共4页

背景：骨髓间充质干细胞由于其具有多向分化潜能和高增殖潜能而在组织工程领域具有广泛的应用前景。目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞在向成骨细胞分化过程中细胞及生物活性变化。设计、时间和地点：随机对照实验,实验于2004-07/2006-06... 背景：骨髓间充质干细胞由于其具有多向分化潜能和高增殖潜能而在组织工程领域具有广泛的应用前景。目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞在向成骨细胞分化过程中细胞及生物活性变化。设计、时间和地点：随机对照实验,实验于2004-07/2006-06在解放军广州军区广州总医院医学实验科干细胞组织工程实验室完成。材料：成年清洁级SD大鼠20只,雌雄不拘用于取骨髓。方法：按随机数字表法将动物分为实验组和对照组,每组10只。通过改良的骨髓培养法分离成年大鼠骨髓间充质干细胞,对照组以基础培养液（10%胎牛血清＋高糖DMEM＋100U/L青霉素＋100U/L链霉素＋2mmol/L谷氨酰胺）培养,实验组用条件培养液（基础培养液,10mmol/Lβ-甘油磷酸纳,10^-7mol/L地塞米松,50mg/L维生素C）进行诱导培养。一段时间后制备细胞爬片。主要观察指标：①用倒置显微镜和透射电子显微镜进行细胞形态学观察。②采用Gomori改良钙钴法进行碱性磷酸酶染色,应用免疫细胞化学染色方法测定骨钙素的表达。结果：骨髓间充质干细胞接种48h后,较多细胞贴壁,72h后增殖,生长良好;7-9d时细胞融合率可达到80%。透射电镜下骨髓间充质干细胞的细胞核较大,形态幼稚。经过体外成骨诱导的骨髓间充质干细胞表现出增殖、聚集、结节和矿化期的阶段性形态特征,诱导1周后表达碱性磷酸酶活性,2周后骨钙素表达呈阳性。结论：骨髓间充质干细胞经体外成骨定向诱导1周后进入成骨细胞的转化过程,并可以保持一定程度的增殖活性,可作为骨组织工程的种子细胞。 展开更多

关键词 骨髓间充质干细胞 成骨诱导 碱性磷酸酶 骨钙素

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低功率毫米波辐射对HL60白血病细胞基因表达谱的影响

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作者 赖晃文 江悦华 +3 位作者 张宏斌 赖声礼 王捷 武婕 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第4期133-137,共5页

应用基因芯片技术考察了经频率为41.32 GHz的毫米波辐射的HL60白血病细胞和未经毫米波辐射的HL60白血病细胞组的基因表达差异,并用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法验证了IL-7、EGF和LGALS3基因变化.结果表明,毫米波辐射60min后,HL60... 应用基因芯片技术考察了经频率为41.32 GHz的毫米波辐射的HL60白血病细胞和未经毫米波辐射的HL60白血病细胞组的基因表达差异,并用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法验证了IL-7、EGF和LGALS3基因变化.结果表明,毫米波辐射60min后,HL60细胞增殖,基因芯片检出基因表达上调18个和下调306个,在下调的基因中,RT-PCR检出IL-7、EGF和LGALS3基因下调的情况与基因芯片结果一致.这说明低功率毫米波可导致HL60细胞的基因表达谱发生变化,这些变化的基因与HL60细胞的增殖功能相关. 展开更多

关键词 细胞 毫米波 辐射 基因表达 寡核苷酸 基因芯片

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hBSP稳定转染乳腺癌细胞的筛选和鉴定

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作者 杜红延 王捷 +2 位作者 郑霖 杨静 刘大志 《广东医学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期874-876,共3页

目的筛选和鉴定人骨唾液蛋白(BSP)的荧光蛋白非融合表达载体和膜靶向表达载体稳定转染的乳腺癌细胞,为BSP在乳腺癌骨转移中作用的进一步体内、外研究奠定基础。方法经过4周400μg/mlG418的抗性筛选结合流式细胞仪荧光分选系统获得稳定... 目的筛选和鉴定人骨唾液蛋白(BSP)的荧光蛋白非融合表达载体和膜靶向表达载体稳定转染的乳腺癌细胞,为BSP在乳腺癌骨转移中作用的进一步体内、外研究奠定基础。方法经过4周400μg/mlG418的抗性筛选结合流式细胞仪荧光分选系统获得稳定转染乳腺癌细胞。采用RT-PCR、ELISA以及Western-blotting等方法检测和鉴定BSP在乳腺癌细胞中基因水平和蛋白水平的表达情况。结果筛选获得的乳腺癌细胞中BSP得到稳定表达,以β-肌动蛋白为内参,与空白对照相比BSP蛋白在基因水平上灰度比值从0.446分别增加为0.993和0.942;同时ELISA和Western-bolt实验结果证明BSP蛋白分泌表达和细胞内表达的量也均有所提高。结论稳定高表达BSP的乳腺癌细胞的获得为进一步BSP在乳腺癌骨转移中的作用的体内外试验研究奠定基础。 展开更多

关键词 骨唾液蛋白 稳定转染 乳腺癌细胞 筛选 鉴定

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