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IAV绝对定量PCR构建及其在体外感染巨噬细胞中的实验研究
1
作者 阙婷 蓝利 +6 位作者 张潇剑 袁江浪 孔星星 樊晓晖 张增峰 唐深 罗小玲 《广西医科大学学报》 CAS 2022年第4期637-642,共6页
目的:构建实时荧光定量PCR(RT-qPCR)绝对定量法检测甲型流感病毒(IAV),研究其在检测IAV体外感染巨噬细胞(Mφ)中病毒复制动态变化的应用效能。方法:佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞刺激活化为Mφ,分为Mφ组和Mφ感染组[IAV的感染复数(MOI)为0.... 目的:构建实时荧光定量PCR(RT-qPCR)绝对定量法检测甲型流感病毒(IAV),研究其在检测IAV体外感染巨噬细胞(Mφ)中病毒复制动态变化的应用效能。方法:佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞刺激活化为Mφ,分为Mφ组和Mφ感染组[IAV的感染复数(MOI)为0.1、0.5、1、1.5、2、5、10、15、20,共9个感染剂量组]。构建RT-qPCR绝对定量检测法检测IAV体外感染Mφ模型中细胞内和培养上清病毒核酸拷贝数;CCK-8法检测24 h内不同MOI的流感病毒对Mφ细胞活性的影响,选取10^(5)~10^(6) TCID50的最佳MOI作为感染模型剂量;采用红细胞凝集实验(HA)检测感染模型细胞内和培养上清的病毒生物合成水平。结果:构建RT-qPCR的标准曲线为Y=-3.345X+38.454,具有良好的线性关系,检测下限为10^(2) copies/μL,10倍稀释梯度在10^(3)~10^(8)区分度和重复性良好;与Mφ组相比,随着MOI增加,Mφ活性下降(P<0.05),感染后贴壁Mφ形态出现变圆悬浮、胞质内大量颗粒、胞体模糊和细胞破裂等变化,且MOI越大,病变程度越严重;以105~106TCID50为依据,选取MOI=0.5、1、2、5、10作为Mφ体外感染的剂量;体外感染的细胞内和培养上清病毒核酸浓度随MOI增大而升高;Mφ感染组细胞内病毒标本HA效价均为1∶64,培养上清的HA效价在1∶32~1∶64。结论:构建RT-qPCR绝对定量法成功检测到体外感染Mφ细胞内和培养上清病毒核酸拷贝数呈逐渐增加趋势,并与细胞病变程度呈正相关关系;HA结果无法准确区分病毒复制趋势,RT-qPCR绝对定量法的敏感度和区分度均较HA高。 展开更多
关键词 荧光定量PCR IAV 巨噬细胞 体外模型
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黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)多克隆抗体的制备和应用 被引量：5
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作者 贺菽嘉 顾永耀 +5 位作者 肖绍文 张庆梅 陈芳 罗彬 付骏 谢小薰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期104-108,共5页
目的制备兔抗人黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)多克隆抗体,鉴定其免疫学特性,并进行初步应用。方法对构建的p MAL-C2/MAGE-D4重组质粒进行原核表达及纯化,获得MBP/MAGE-D4融合蛋白,并以此蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。抗体经蛋白A凝胶... 目的制备兔抗人黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)多克隆抗体,鉴定其免疫学特性,并进行初步应用。方法对构建的p MAL-C2/MAGE-D4重组质粒进行原核表达及纯化,获得MBP/MAGE-D4融合蛋白,并以此蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。抗体经蛋白A凝胶柱亲和层析法纯化后,通过SDS-PAGE检测其纯度;间接ELISA、Western blot法检测抗体的效价及特异性;免疫组织化学染色法检测肺癌组织中MAGE-D4的表达及定位。结果获得纯度较高的抗MAGE-D4多克隆抗体,ELISA检测抗体的效价为1∶256 000,Western blot法分析显示MAGE-D4多克隆抗体可特异性识别MAGE-D4重组蛋白,免疫组织化学结果表明,该抗体能识别肺癌组织中的内源性MAGE-D4蛋白,表达的阳性率为69.6%(17/23)。结论制备的MAGE-D4多克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度。 展开更多
关键词 黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4) 多克隆抗体 肿瘤相关抗原
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人胶质瘤中HIF1A和MAGED4的表达及调控关系初探 被引量：2
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作者 王平 闭水清 +7 位作者 刘畅 农蔚霞 邹小琼 薛春红 王燕靖 李枫 张庆梅 谢小薰 《中国临床新医学》 2022年第10期945-950,共6页
目的探讨缺氧诱导因子1A(HIF1A)和黑色素瘤相关抗原D4(MAGED4)在人胶质瘤中的表达情况,并分析HIF1A对MAGED4表达的影响。方法通过基因表达谱交互式分析(GEPIA)数据库收集人胶质瘤组织样本数据681例,正常脑组织样本数据207例,比较其MAGED... 目的探讨缺氧诱导因子1A(HIF1A)和黑色素瘤相关抗原D4(MAGED4)在人胶质瘤中的表达情况,并分析HIF1A对MAGED4表达的影响。方法通过基因表达谱交互式分析(GEPIA)数据库收集人胶质瘤组织样本数据681例,正常脑组织样本数据207例,比较其MAGED4 mRNA和HIF1A mRNA表达水平。通过中国胶质瘤基因组图谱(CGGA)数据库中下载693例胶质瘤患者的mRNA-seq_693数据集及相应的临床信息,分析MAGED4 mRNA和HIF1A mRNA表达的相关性,以及二者与患者临床特征指标的关联性。应用氯化钴模拟体外缺氧环境,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)和蛋白免疫印记(WB)实验探讨沉默胶质瘤细胞HIF1A表达对MAGED4表达变化的影响。结果基于GEPIA数据库的分析结果显示,低级别胶质瘤(LGG)和胶质母细胞瘤(GBM)组织的HIF1A mRNA和MAGED4 mRNA水平均高于正常脑组织,差异有统计学意义(P<0.05)。基于CGGA数据库的分析结果显示,MAGED4 mRNA表达水平与HIF1A mRNA表达水平呈正相关(r=0.322,P=0.000)。MAGED4 mRNA高表达组年龄<40岁、异柠檬酸脱氢酶(IDH)突变型的人数比例大于MAGED4 mRNA低表达组,差异有统计学意义(P<0.05),两组性别、肿瘤类型、世界卫生组织(WHO)肿瘤分级,O6-甲基鸟瞟-DNA甲基转移酶(MGMT)启动子甲基化状态、1p/19q共缺失情况比较差异无统计学意义(P>0.05)。将HIF1A siRNA转染至U87-MG和U251细胞,并在缺氧条件下培养48 h,RT-qPCR和WB实验结果显示,HIF1A下调后,MAGED4的表达水平也显著下降。结论HIF1A和MAGED4均高表达于胶质瘤,且两者呈正相关。胶质瘤细胞中HIF1A可调控MAGED4的表达。 展开更多
关键词 胶质瘤 缺氧诱导因子1A 黑色素瘤相关抗原D4 氯化钴
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2-DG抑制糖酵解和线粒体自噬调控M1型巨噬细胞极化 被引量：6
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作者 蓝春花 陈成英 +7 位作者 蓝利 王新航 常升搏小吉 袁江浪 孔星星 陆彩玲 李习艺 唐深 《广西医科大学学报》 CAS 2021年第4期704-709,共6页
目的:研究2-脱氧-d-葡萄糖(2-DG)对M1型巨噬细胞炎症极化的调控作用,初步探索糖酵解及线粒体自噬在其中的作用机制。方法:将THP-1细胞分为3组:M0组[100 nmol/L佛波酯(PMA)刺激48 h极化为M0型]、M1组(M0组基础上用10 ng/mL LPS和20 ng/mL... 目的:研究2-脱氧-d-葡萄糖(2-DG)对M1型巨噬细胞炎症极化的调控作用,初步探索糖酵解及线粒体自噬在其中的作用机制。方法:将THP-1细胞分为3组:M0组[100 nmol/L佛波酯(PMA)刺激48 h极化为M0型]、M1组(M0组基础上用10 ng/mL LPS和20 ng/mL IFN-γ共刺激48 h诱导极化为M1型)、M1+2-DG组(M1组基础上加入10 mmol/L 2-DG)。实时荧光定量PCR(qPCR)法检测M1型巨噬细胞极化相关基因肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6、CXC趋化因子配体-10(CXCL-10)、环加氧酶(COX)-2mRNA表达水平,微量法酶活性试剂盒检测糖酵解限速酶己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性。Western blotting法检测Beclin-1、PTEN诱导激酶1(PINK1)表达水平。并比较3组溶酶体、线粒体荧光信号强度及细胞内活性氧(ROS)含量。结果:与M0组比较,M1组TNF-α、IL-6、CXCL-10、COX-2mRNA表达水平明显升高,HK、PK和LDH活性增加,溶酶体荧光信号增强,线粒体荧光信号降低,细胞内ROS升高,线粒体自噬相关蛋白Beclin-1、PINK1表达升高(均P<0.05)。与M1组比较,M1+2-DG组TNF-α、IL-6、CXCL-10、COX-2mRNA水平明显降低,HK、PK和LDH活性下降,溶酶体荧光信号降低,线粒体荧光信号增强,细胞内ROS降低,Beclin-1、PINK1蛋白表达降低(P<0.05)。结论:2-DG可能通过抑制M1型巨噬细胞糖酵解和ROS产生,降低细胞线粒体自噬水平,下调M1型巨噬细胞极化相关标志物的表达,负调控M1型巨噬细胞炎症极化。 展开更多
关键词 2-DG M1型巨噬细胞 糖酵解 线粒体自噬 极化
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4-辛基衣康酸抑制糖酵解调控M2型巨噬细胞极化 被引量：1
5
作者 陈成英 蓝利 +7 位作者 袁江浪 孔星星 王新航 刘彧冰 李菡 陆彩玲 李习艺 唐深 《广西医科大学学报》 CAS 2022年第4期577-582,共6页
目的:研究4-辛基衣康酸(4OI)对M2型巨噬细胞(Mφ)极化的干预作用,初步探讨糖酵解及脂肪酸氧化在其中的作用机制。方法:将Mφ分为M0组(100 nmol/L佛波酯刺激48 h诱导为M0型)、M2组[M0组基础上用20 ng/mL白细胞介素4(IL-4)刺激48 h诱导为M... 目的:研究4-辛基衣康酸(4OI)对M2型巨噬细胞(Mφ)极化的干预作用,初步探讨糖酵解及脂肪酸氧化在其中的作用机制。方法:将Mφ分为M0组(100 nmol/L佛波酯刺激48 h诱导为M0型)、M2组[M0组基础上用20 ng/mL白细胞介素4(IL-4)刺激48 h诱导为M2型]、M2+4OI-L组(M2组基础上用100μmol/L 4OI处理12 h)、M2+4OI-H组(M2组基础上用200μmol/L 4OI处理12 h)。实时荧光定量PCR检测M2型Mφ极化相关标志物白细胞介素10(IL-10)、甘露糖受体(MRC-1)、细胞趋化因子(CCL-22)、DC特异性细胞间黏附分子3结合非整合素(CD209)、细胞因子信号抑制物(SOCS1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)、脂肪酸氧化限速酶碱棕榈酰基转移酶-1α(CPT-1α)的mRNA表达水平;微量法酶活性试剂盒检测糖酵解限速酶己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)活性,刃天青法检测细胞内呼吸链代谢酶活性。结果:M0极化为M2时,与M0组比较,伪足伸出细胞和梭形细胞占比和M2型极化相关标志物CCL-22、IL-10、MRC-1、CD209、SOCS1和PPAR-γmRNA表达水平上升(P<0.01);HK和PK活性升高(P<0.05);CPT-1αmRNA水平和线粒体呼吸链代谢酶活性升高(P<0.01)。4OI干预后,与M2组比较,伪足伸出细胞和梭形细胞占比和M2型极化相关标志物CCL-22、IL-10、MRC-1、CD209、SOCS1和PPAR-γmRNA表达水平下降(P<0.05);HK和PK活性降低(P<0.05);CPT-1αmRNA水平进一步升高(P<0.01);线粒体呼吸链代谢酶活性无明显变化。结论:4OI可能通过抑制M2型Mφ糖酵解降低M2型Mφ极化相关标志物的表达,通过进一步促进脂肪酸氧化水平,维持M2细胞内线粒体呼吸链代谢酶活性和细胞氧化磷酸化稳定。 展开更多
关键词 4-辛基衣康酸 M2型巨噬细胞 糖酵解 代谢
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白脂素包涵体表达纯化及其功能评价
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作者 韦雪静 敖青青 +5 位作者 孟玲 徐怡璐 陆彩玲 唐深 王新航 李习艺 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期67-72,共6页
目的构建白脂素的原核表达质粒,表达及纯化重组白脂素蛋白,并初步探索其功能,为进一步研究白脂素作用机制及其生理病理作用提供依据。方法利用基因工程技术构建表达白脂素BL21菌株,经异丙基硫代半乳糖苷诱导,梯度尿素复性,亲和层析纯化... 目的构建白脂素的原核表达质粒,表达及纯化重组白脂素蛋白,并初步探索其功能,为进一步研究白脂素作用机制及其生理病理作用提供依据。方法利用基因工程技术构建表达白脂素BL21菌株,经异丙基硫代半乳糖苷诱导,梯度尿素复性,亲和层析纯化及去内毒素处理得到可用于细胞和动物实验的重组白脂素。采用血糖仪检测重组白脂素腹腔注射后C57小鼠血糖变化情况。Alamar Blue检测重组白脂素作用24 h对MIHA细胞活性的影响;重组白脂素刺激MIHA细胞24 h,用蒽酮法检测糖原含量。结果在37℃,A600 nm=0.8,IPTG终浓度为1 mmol/L诱导4 h目的蛋白表达效果较好。通过纯化和去内毒素处理,重组白脂素纯度大于95%,内毒素含量小于1 EU/mg,可以用于动物与细胞实验。腹腔注射重组白脂素60 min后C57小鼠血糖升高至峰值(重组白脂素组vs对照组P=0.021),120 min恢复到正常水平(重组白脂素组vs对照组P=0.03)。重组白脂素刺激MIHA细胞24 h,对细胞活性没有影响;检测糖原发现,不同浓度白脂素组糖原与对照组比较差异有统计学意义(P1=0.013,P2=0.036,P3=0.011)。结论通过原核表达系统成功表达及纯化了白脂素蛋白,该方法纯化后的白脂素具有降低MIHA细胞糖原含量及升高小鼠血糖的作用,这为白脂素功能的进一步研究提供了理论依据。 展开更多
关键词 原核表达与纯化 包涵体 白脂素 糖原分解 血糖
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体外牛磺酸抑制糖酵解调控M1型巨噬细胞极化 被引量：1
7
作者 孟玲 蓝春花 +3 位作者 蓝利 陆彩玲 李习艺 唐深 《营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期40-44,共5页
目的研究牛磺酸调控M1型巨噬细胞极化的分子机制。方法人急性单核细胞白血病细胞系THP-1细胞经100 nmol/L佛波酯处理24h后诱导分化为M0型巨噬细胞;M1型极化组—M0型巨噬细胞经10 ng/ml脂多糖和20 ng/ml干扰素γ刺激48h诱导极化为M1型巨... 目的研究牛磺酸调控M1型巨噬细胞极化的分子机制。方法人急性单核细胞白血病细胞系THP-1细胞经100 nmol/L佛波酯处理24h后诱导分化为M0型巨噬细胞;M1型极化组—M0型巨噬细胞经10 ng/ml脂多糖和20 ng/ml干扰素γ刺激48h诱导极化为M1型巨噬细胞;牛磺酸处理组—在M1型极化组的基础上,分别加入的牛磺酸与脂多糖、干扰素γ共培养48h。实时荧光定量PCR检测M1型巨噬细胞极化相关标志物:肿瘤坏死因子α(TNF-α)、环加氧酶2(COX-2)、CXC趋化因子配体-10(CXCL-10)和白细胞介素6(IL-6)的mRNA表达水平;微量法试剂盒分别检测糖酵解相关酶—己糖激酶(HK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性;用刃天青检测细胞内线粒体呼吸链代谢酶活性。结果M1型极化组:M1型极化相关标志物COX-2、TNF-α、IL-6和CXCL-10的mRNA水平明显升高,己糖激酶(HK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性均增加,线粒体呼吸链代谢酶活性降低;牛磺酸处理组:M1型巨噬细胞极化相关标志物COX-2、TNF-α、IL-6和CXCL-10的mRNA水平明显降低,己糖激酶(HK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性降低,线粒体呼吸链代谢酶活性增加。结论牛磺酸可能通过降低糖酵解水平,提高线粒体呼吸链代谢酶活性,抑制M1型巨噬细胞极化相关标志物的表达,调控巨噬细胞M1极化。 展开更多
关键词 牛磺酸 M1型巨噬细胞 极化 糖酵解 代谢 体外
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