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定点突变鉴定Myxococcus sp.V11麦芽糖基海藻糖水解酶MTHase的催化中心
1
作者 陈允妲 李雪亮 +4 位作者 吴映函 赵晓艳 吴晓玉 王飞 陈金印 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期190-197,共8页
【目的】麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)是一种水解与α-1,1糖苷键相邻的α-1,4糖苷键,生成麦芽寡糖和海藻糖,是以淀粉为底物生产海藻糖工艺中的关键酶。实验室从菌株Myxococcus sp.V11基因组中克隆到麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因并异... 【目的】麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)是一种水解与α-1,1糖苷键相邻的α-1,4糖苷键,生成麦芽寡糖和海藻糖,是以淀粉为底物生产海藻糖工艺中的关键酶。实验室从菌株Myxococcus sp.V11基因组中克隆到麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因并异源表达,通过氨基酸序列分析和三维建模,推测其可能的催化中心氨基酸残基构成。【方法】通过对MTHase上可能存在的3个活性位点D256、E291、D386进行PCR介导定点突变,分别将其突变成为D256A、E291A和D386A。【结果】系统进化树结果表明Myxococcus sp.V11所产MTHase与已报道的Deinococcus radiodurans所产麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalose Trehalohydrolase,DR0464)相似度最高,但仅为49.23%,与已报道的淀粉酶相似度则有较大差异。氨基酸序列比对结果表明MTHase与其它来源的麦芽寡糖基海藻糖水解酶都具有相同的保守序列:GTFTPEG(113-119)、WGYDG(153-157)、ED(291-292)、GLXVXLDXVXNHXGPXGNY(184-202)、DGXRXDA(251-257)、IQNHDQ(382-387)。三联体活性中心(Asp256-Glu291-Asp386)均位于保守区域之内,其中Asp256是亲核试剂,Glu291是酸碱催化的质子供体,Asp386起着维持Glu291稳定构象的作用。以已解析的相似性最高的麦芽寡糖基海藻糖水解酶(PDB ID:2BHU)为模板,在SWISS-MODEL上通过同源建模得到MTHase的三维结构模型。MTHase与2BHU虽然相似性仅为49%,但都具有一个典型GH13家族糖苷水解酶所共有的(α/β)8桶状结构域。三维结构显示MTHase主要由3个结构域构成:催化结构域Domain A(Ala95-Asp316,Gln372-Ser512)形成一个典型的(α/β)_(8)桶状结构,Domain A的中间形成一个裂口,活性中心位于口袋之内;N端结构域(Domain B)主要为β-折叠结构,Domain C也由β-折叠构成,催化三联体Asp256-Glu291-Asp386位于靠近Domain C的位置。MTHase与底物连接的氨基酸残基Gly197,Pro198,Gly200,Asn201,Tyr202,Trp210,Asp316,Asp317,His320,Tyr337,Arg366,Asn390均与2BHU一致。通过定点突变,重组表达和活力测定,结果显示突变子D256A、E291A和D386A均彻底失去了淀粉酶活性。【结论】MTHase的活性中心由D256、E291和D386构成,与底物结合的氨基酸位点决定了其对不同底物的适应性。 展开更多
关键词 Myxococcus sp.V11 麦芽寡糖基海藻糖水解酶 定点突变 催化中心
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Streptomyces lavendulae X33海藻糖合酶基因克隆及酶学特性 被引量：2
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作者 陈允妲 李雪亮 +4 位作者 赵晓艳 张丽霞 吴晓玉 王飞 陈金印 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期901-909,共9页
【目的】海藻糖是一种由2个葡萄糖分子以α,α-1,1-糖苷键连接的非还原性双糖,在生物制品的保护剂方面具有良好的应用前景。海藻糖合酶(Trehalose Synthase,EC.5.4.99.16)可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,该反应仅需一步,且所... 【目的】海藻糖是一种由2个葡萄糖分子以α,α-1,1-糖苷键连接的非还原性双糖,在生物制品的保护剂方面具有良好的应用前景。海藻糖合酶(Trehalose Synthase,EC.5.4.99.16)可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,该反应仅需一步,且所用原料低廉,在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力。对链霉菌Streptomyces lavendulae X33中编码海藻糖合成酶的基因SlTs进行克隆,通过原核表达获得重组海藻糖合成酶,并研究其酶学性质。【方法】以Streptomyces lavendulae X33基因组DNA为模板,使用加尾PCR的方法克隆编码海藻糖合成酶的基因,构建含有组氨酸标签的重组表达载体,并将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。重组蛋白经Ni-NTA纯化,以麦芽糖为底物研究其酶学性质,包括最适温度、最适pH和pH稳定性及金属离子和抑制剂的影响。【结果】从菌株Streptomyces lavendulae X33基因组中克隆得到了海藻糖合成酶基因片段SlTs GenBank登录号为MW217513。SlTs全长1719 bp,编码一个572个氨基酸的蛋白SlTs,分子量大小为66 ku。氨基酸序列分析表明SlTs与来源于Thermomonospora curvata DSM 43183的海藻糖合酶最高相似性为84%,与其它已报道的海藻糖合酶有较大差异。序列比对的结果显示SlTs与已解析结构的海藻糖合酶TcTs(PDB.5h2t)等具有的基序“DGGYD”“NHTS”“QPDLN”“RXDAVPYL”“LLAEANQ”“LRNHDELTLE”高度保守,具有一个由Asp218-Glu260-Asp330构成的活性中心,表明SlTs归属于糖苷水解酶GH13家族。经异源表达,Ni^(2+)-NTA亲合层析后进行纯化。重组酶rSlTs最适反应温度为20℃,最适反应pH为7.5,在以麦芽糖为底物,最适反应条件下测得的比活力为67.6 U/mg。重组酶rSITs在20℃下处理1 h活力不变,处理9 h时,残留酶活为60%。但在50℃下处理0.5 h活力丧失,表明rSITs对热敏感。重组酶rSITs在pH5.0-8.0有活性,最适反应pH为6.0,在pH6.0-7.0处理12 h活力稳定。1 mmol/L Ca^(2+)对重组酶rSlTs有激活作用,Ni^(2+)、Zn^(2+)、Cu^(2+)对重组酶rSlTs有抑制作用,其余金属离子对酶活无影响。甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂和SDS对重组酶rSlTs有显著抑制作用,TritonX-100对酶活无显著影响。【结论】首次从Streptomyces lavendulae X33中克隆得到海藻糖合成酶,并对其进行了酶学性质研究,为开发新的海藻糖合成酶提供理论基础。 展开更多
关键词 Streptomyces lavendulae X33 海藻糖合酶 基因克隆 酶学特性
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菌株Chitinophaga sp.CH-1阿拉伯糖苷酶Ara1805基因克隆与表达 被引量：2
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作者 赵晓艳 朱庆圣 +4 位作者 朱红 鄢江月 吴晓玉 陈金印 王飞 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期182-188,共7页
阿拉伯糖苷酶协同木聚糖酶在低聚木糖的生产、废物的生物处理、食品或饲料养分的提高以及半纤维素的生物转化等方面起着非常重要的作用。噬几丁质细菌是可以滑动并形成粘孢子的革兰氏阴性细菌,因具有较强的几丁质酶活性而得名。采用PCR... 阿拉伯糖苷酶协同木聚糖酶在低聚木糖的生产、废物的生物处理、食品或饲料养分的提高以及半纤维素的生物转化等方面起着非常重要的作用。噬几丁质细菌是可以滑动并形成粘孢子的革兰氏阴性细菌,因具有较强的几丁质酶活性而得名。采用PCR方法从噬几丁质菌株Chitinophagasp.CH-1基因组DNA中克隆出编码阿拉伯糖苷酶基因ara1805,以pET29a为表达质粒,与其C末端6个组氨酸标签序列融合,在大肠杆菌中得到高效可溶性表达。SDS-PAGE测得酶的分子量为38 ku,与理论推算值相吻合。表达菌株粗酶经检测表现出α-L-阿拉伯糖苷水解酶活性。蛋白质序列分析和其他来源的阿拉伯糖苷水解酶表明Ara1805中可能存在的活性中心为Asp67,Glu186和Asp236,说明该蛋白确实可能具有阿拉伯糖苷酶功能。研究为今后理性设计阿拉伯糖苷水解酶以期提高其水解活性奠定了一定的理论基础。 展开更多
关键词 Chitinophaga sp.CH-1 阿拉伯糖苷酶 基因克隆
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Myxococcus sp.V11海藻糖合酶TreSⅡ分子改造 被引量：3
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作者 赵晓艳 陈允妲 +3 位作者 章雅倩 吴晓玉 王飞 陈金印 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期79-87,共9页
来源于黏细菌Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶(trehalose synthase,EC 2.4.1.245)TreSⅡ可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力,但TreSⅡ对热敏感,在60℃保温3h,酶活性丧失,限制了其应用范围... 来源于黏细菌Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶(trehalose synthase,EC 2.4.1.245)TreSⅡ可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力,但TreSⅡ对热敏感,在60℃保温3h,酶活性丧失,限制了其应用范围。目的:拟探索TreSⅡ影响热稳定性的氨基酸残基构成,通过对可能的氨基酸位点进行定点突变,以期获得耐热性的突变子,扩大TreSⅡ应用范围。方法:通过PCR介导的方法对TreSⅡ可能影响到热稳定性的氨基酸Q3、A283、W374、R449和Y537进行定点突变,以野生型重组酶为对照,比较突变型与野生型的最适反应温度和最适反应pH,通过测定不同温度下保存不同时间后的残留酶活,检测突变子的耐热效果。结果:研究表明突变子Q3D、A283R、W374D、R449Q和Y537H的比酶活与野生型无显著差异,且最适pH和最适反应温度也未发生改变;A283R、Y537H在60℃条件下,3h后活性剩余68%;Q3D、W374D、R449Q在温度60℃时,3h后活性剩余35%。结论:TreSⅡ分子结构中与金属离子结合的几个氨基酸残基的改变对蛋白质分子的耐热性具有显著影响。 展开更多
关键词 Myxococcus sp.V11 海藻糖合酶 定点突变 热稳定性
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