鸭新城疫病毒河北分离株融合蛋白基因的分子特性分析 被引量：3

1

作者 翟文栋 陈立功 +4 位作者 董兵 李玉荣 段晓军 任玉红 董世山 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期94-99,共6页

为研究鸭新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）河北分离株HB／1／05／Dk的遗传变异特性，本试验通过RT—PCR方法扩增其融合蛋白（F）基因片段的5’端的451bp核苷酸，将其推导的氨基酸序列与GenBank已发表的31株NDV参考毒株进行... 为研究鸭新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）河北分离株HB／1／05／Dk的遗传变异特性，本试验通过RT—PCR方法扩增其融合蛋白（F）基因片段的5’端的451bp核苷酸，将其推导的氨基酸序列与GenBank已发表的31株NDV参考毒株进行比对分析，并根据F基因（47～420nt）对其进行基因分型。结果表明：鸭NDVHB／1／05／Dk分离株与参考毒株间的核苷酸和氨基酸的同源性分别为61．8％～98．4％和62．9％～97．6％，与鸡源NDVXJ-2／97株同源性最高；HB／1／05／Dk株F蛋白裂解位点氨基酸序列为^112R—R—Q-K—R—F^117，为强毒NDV的特征；该分离株属于基因VIId亚型。表明鸭NDV分离株可能来源于感染NDV的鸡群。 展开更多

关键词 新城疫病毒 鸭 F基因 序列分析 基因型

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蛋黄卵磷脂提取方法的研究 被引量：10

2

作者 刘颖 肖静静 +4 位作者 李硕绵 陈立功 王丽叶 王迎春 董世山 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期105-108,共4页

本试验比较了乙醇提取、先乙醇后丙酮提取和先丙酮后乙醇提取3种蛋黄卵磷脂提取方法,以期获得一种最优的提取方法。同时,在各提取方法中分别采用不同乙醇体积分数观察其对蛋黄卵磷脂提取效果的影响。试验采用钼黄比色法测定卵磷脂的含量... 本试验比较了乙醇提取、先乙醇后丙酮提取和先丙酮后乙醇提取3种蛋黄卵磷脂提取方法,以期获得一种最优的提取方法。同时,在各提取方法中分别采用不同乙醇体积分数观察其对蛋黄卵磷脂提取效果的影响。试验采用钼黄比色法测定卵磷脂的含量;通过薄层色谱法(TLC)定性检测蛋黄卵磷脂。结果表明:先利用95%的乙醇处理蛋黄,然后用丙酮脱油为最优蛋黄卵磷脂提取方法,卵磷脂的提取率、纯度和含量都较高,分别为8.6%,80.3%,6.9%。提取得到的蛋黄卵磷脂薄层色谱图和卵磷脂标准品的薄层色基本谱图一致。 展开更多

关键词 蛋黄 卵磷脂 薄层色谱 提取

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重组猪IL-7在真核细胞的分泌表达及生物活性分析 被引量：1

3

作者 温洁霞 林洪羽 +5 位作者 王利月 李文艳 张考 陈慧慧 仲飞 李秀锦 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期98-101,106,共5页

为了解猪IL-7(pIL-7)在防治猪免疫抑制性传染病及疫苗生物佐剂中的作用,通过RT-PCR方法从猪脾脏中扩增出含有自身信号肽序列的pIL-7 cDNA基因,将其克隆到pcDNA3.1A表达载体上,构建出羧基端与Myc/His融合的pIL-7基因真核表达载体pcDNA3.1... 为了解猪IL-7(pIL-7)在防治猪免疫抑制性传染病及疫苗生物佐剂中的作用,通过RT-PCR方法从猪脾脏中扩增出含有自身信号肽序列的pIL-7 cDNA基因,将其克隆到pcDNA3.1A表达载体上,构建出羧基端与Myc/His融合的pIL-7基因真核表达载体pcDNA3.1A-pIL-7/MH。由磷酸钙介导将pcDNA3.1A-pIL-7/MH质粒转染人类胚胎肾细胞293T(HEK293T)使其进行瞬时表达,以Western-blot检测构建的pIL-7基因表达载体是否可介导重组pIL-7在真核细胞中进行分泌型表达。然后利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化表达的重组pIL-7,并通过淋巴细胞增殖试验检测其的生物活性。结果表明,扩增的pIL-7基因序列与GenBank序列完全一致;构建的表达载体可介导重组pIL-7在真核细胞HEK293T中进行分泌型表达。表达的重组pIL-7对猪脾淋巴细胞有明显的促增殖效应。由此可见,利用真核细胞表达的重组pIL-7具有生物活性。 展开更多

关键词 重组猪白细胞介素-7 真核表达 生物活性

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β-CD去除蛋黄卵磷脂中胆固醇工艺的研究 被引量：1

4

作者 李硕绵 李妹玲 +2 位作者 乔宁 王迎春 董世山 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第6期137-139,288,共4页

为了优化蛋黄卵磷脂中胆固醇的去除工艺,建立适合大规模生产低胆固醇蛋黄卵磷脂的工艺流程,试验采用薄层色谱法和皂化比色法定性和定量测定胆固醇,利用β-环状糊精(β-CD)的包埋吸附作用去除胆固醇,研究不同条件参数对胆固醇去除率的影... 为了优化蛋黄卵磷脂中胆固醇的去除工艺,建立适合大规模生产低胆固醇蛋黄卵磷脂的工艺流程,试验采用薄层色谱法和皂化比色法定性和定量测定胆固醇,利用β-环状糊精(β-CD)的包埋吸附作用去除胆固醇,研究不同条件参数对胆固醇去除率的影响。结果表明:10 g鲜蛋黄液经乙醇萃取卵磷脂后添加1.6 gβ-CD,常温下混合搅拌10 min,5 000 r/min离心10 min,得到的卵磷脂制品胆固醇去除率可达99.00%。 展开更多

关键词 蛋黄 卵磷脂 胆固醇 β-环状糊精(β-CD) 优化 工艺

原文传递

外源卵黄抗体在鸡血清中衰减规律的研究

5

作者 薛晓阳 刘聚祥 +5 位作者 陈立功 王迎春 褚军 刘颖 肖静静 董世山 《中国家禽》 北大核心 2012年第16期64-66,共3页

自发现卵黄抗体以来,鉴于其来源便捷,提取简单,许多学者在生物领域进行了广泛的研究应用,其优点也得到了充分的肯定。随着人民生活水平的提高,对食品安全的要求越来越严格。多年来兽药使用不规范导致的药物残留和耐药性问题迫使人们重... 自发现卵黄抗体以来,鉴于其来源便捷,提取简单,许多学者在生物领域进行了广泛的研究应用,其优点也得到了充分的肯定。随着人民生活水平的提高,对食品安全的要求越来越严格。多年来兽药使用不规范导致的药物残留和耐药性问题迫使人们重新审视如何有效合理的防治动物疾病。国内外抗病毒药物及抗生素的限制使用范围逐步扩大，抗病毒药物替代品的研究日益受到重视，成为亟待解决的问题…。卵黄抗体的生产成本低、产量大、绿色无残留污染等优点为畜牧业的绿色生产带来了希望。市场上鸡法氏囊卵黄抗体和鹅小鹅瘟卵黄抗体都取得较好疗效心’，为临床治疗、动物保健、饲料添加剂等提供了新的解决途径。资料显示针对卵黄抗体的研究多集中在提取方法和临床效果方面，而对于注射卵黄抗体后在体内的衰减规律未见报道。因此，本研究在注射卵黄抗体后不同时间测定血清抗体效价，揭示抗体的衰减规律，为临床更好地利用卵黄抗体治疗疾病提供理论依据。 展开更多

关键词 卵黄抗体 衰减规律 鸡血清 抗病毒药物 临床治疗 血清抗体效价 动物疾病 绿色生产

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仔猪肠黏膜上皮细胞体外培养及其对小檗碱适应性的研究 被引量：2

6

作者 李妹玲 乔宁 +4 位作者 陈立功 徐环叶 徐倩倩 王迎春 董世山 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期99-102,共4页

为了体外分离培养和鉴定仔猪肠粘膜上皮细胞,探讨小檗碱对体外培养的仔猪肠粘膜上皮细胞的安全剂量。本试验取刚出生未吃初乳的仔猪小肠的回肠段,用胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ进行消化处理,获得原代仔猪肠粘膜上皮细胞,用免疫组化法对培养的仔... 为了体外分离培养和鉴定仔猪肠粘膜上皮细胞,探讨小檗碱对体外培养的仔猪肠粘膜上皮细胞的安全剂量。本试验取刚出生未吃初乳的仔猪小肠的回肠段,用胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ进行消化处理,获得原代仔猪肠粘膜上皮细胞,用免疫组化法对培养的仔猪肠粘膜细胞进行鉴定,用MTT检测法测定硫酸小檗碱对仔猪肠粘膜上皮细胞的安全浓度。结果表明:免疫组化法分离培养的细胞膜呈棕黄色,为粘膜上皮细胞。硫酸小檗碱对体外培养的仔猪肠粘膜上皮细胞的安全浓度为20μmol/L。 展开更多

关键词 仔猪 肠粘膜上皮细胞 培养 鉴定 小檗碱

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白头翁素对腹泻小鼠肠黏膜修复因子EGFR和TGFβ1的影响 被引量：14

7

作者 刘颖 徐倩倩 +4 位作者 薛晓阳 褚军 肖静静 陈立功 董世山 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期475-480,共6页

白头翁素是白头翁的主要成分,对腹泻具有显著的防治效果。本试验利用猪轮状病毒和大肠杆菌混合感染建立腹泻模型,通过免疫组织化学方法和RT-PCR方法研究白头翁素对腹泻小鼠肠黏膜修复因子EGFR和TGFβ1表达的影响,揭示白头翁素防治腹泻... 白头翁素是白头翁的主要成分,对腹泻具有显著的防治效果。本试验利用猪轮状病毒和大肠杆菌混合感染建立腹泻模型,通过免疫组织化学方法和RT-PCR方法研究白头翁素对腹泻小鼠肠黏膜修复因子EGFR和TGFβ1表达的影响,揭示白头翁素防治腹泻的肠黏膜修复机制。结果显示:小鼠腹泻初期,自愈组、治疗组和预防组黏膜修复因子EGFR和TGFβ1的蛋白表达量均有所升高,其中预防组较空白对照组差异显著(P<0.05),EGFR和TGFβ1的mRNA表达量较空白对照组也显著升高,且差异极显著(P<0.01)。腹泻后期,表达量逐渐下降直至正常。试验结果表明:白头翁素对轮状病毒和大肠杆菌混合感染性腹泻良好的预防效果可能与其调节黏膜修复因子EGFR和TGFβ1的表达有关,从而促进肠黏膜的修复。 展开更多

关键词 白头翁素 小鼠 腹泻 黏膜修复 表皮生长因子受体 转化生长因子Β1

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截短猪流行性腹泻病毒N蛋白的可溶性表达及其抗原活性 被引量：6

8

作者 朱卫霞 袁万哲 +3 位作者 李丽敏 宋勤叶 孙泰然 李潭清 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期1561-1566,共6页

应用原核表达系统表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白,并探讨其抗原活性。通过RT-PCR扩增截短的PEDV N蛋白(truncated N protein,tN蛋白)基因;构建包含tN蛋白基因的原核表达质粒(pET32a-PEDV-tN),将质粒转化E.coli BL21感受态细胞,诱导表... 应用原核表达系统表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白,并探讨其抗原活性。通过RT-PCR扩增截短的PEDV N蛋白(truncated N protein,tN蛋白)基因;构建包含tN蛋白基因的原核表达质粒(pET32a-PEDV-tN),将质粒转化E.coli BL21感受态细胞,诱导表达目的蛋白;通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组tN蛋白的表达及其免疫反应原性;用提纯的tN蛋白皮下接种BLAB/c小鼠,通过ELISA和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)检测重组tN蛋白的免疫原性。结果应用RT-PCR扩增到了预期705bp的tN蛋白基因;在E.coli BL21内,携带tN蛋白基因的重组质粒能够以可溶性表达形式诱导表达重组tN蛋白;该蛋白在体外可以与猪抗PEDV抗体特异性结合,能够诱导小鼠产生特异性抗体。本研究应用原核表达系统实现了截短猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白的可溶性表达,该蛋白具有良好的完全抗原活性。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 N蛋白 可溶性原核表达 抗原活性

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白头翁素对腹泻小鼠肠黏膜修复因子PCNA和TGFα表达的影响 被引量：2

9

作者 徐倩倩 陈立功 +5 位作者 刘颖 肖静静 王迎春 李硕绵 王建军 董世山 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期99-102,共4页

本试验利用猪轮状病毒和大肠杆菌混合感染建立腹泻模型,通过免疫组织化学方法研究白头翁素对腹泻小鼠肠黏膜修复因子蛋白表达的影响,揭示白头翁素防治腹泻的黏膜修复机制。结果显示:小鼠腹泻96h内,自愈组、治疗组和预防组黏膜修复因子P... 本试验利用猪轮状病毒和大肠杆菌混合感染建立腹泻模型,通过免疫组织化学方法研究白头翁素对腹泻小鼠肠黏膜修复因子蛋白表达的影响,揭示白头翁素防治腹泻的黏膜修复机制。结果显示:小鼠腹泻96h内,自愈组、治疗组和预防组黏膜修复因子PCNA和TGFα的蛋白表达量均有所升高,其中预防组显著高于空白对照组(P<0.05),腹泻96h后,表达量逐渐下降直至正常。结果表明,白头翁素防治小鼠轮状病毒和大肠杆菌混合感染性腹泻的显著效果可能与其调节黏膜修复因子PCNA和TGFα的表达有关,从而促进了肠黏膜的修复。 展开更多

关键词 白头翁素 小鼠 腹泻 黏膜修复 细胞增殖核抗原 转化生长因子Α

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猪繁殖与呼吸综合征弱毒活疫苗免疫猪脾脏转移因子的制备及其活性分析 被引量：2

10

作者 郭海勇 袁洪兴 +4 位作者 孙泰然 曹静 宋勤叶 李潭清 逯纪成 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期1467-1474,共8页

从猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)弱毒活疫苗免疫猪脾制备转移因子(TF),检测其免疫活性,为开发新型免疫增强剂和有效防制PRRS提供科学依据。用PRRSV弱毒活疫苗免疫健康育成猪,无菌采集脾,通过透析法从脾提取TF。应用磺基水杨酸法、茚三酮反... 从猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)弱毒活疫苗免疫猪脾制备转移因子(TF),检测其免疫活性,为开发新型免疫增强剂和有效防制PRRS提供科学依据。用PRRSV弱毒活疫苗免疫健康育成猪,无菌采集脾,通过透析法从脾提取TF。应用磺基水杨酸法、茚三酮反应和硝酸-钼酸铵试验等方法检测TF的主要成分,经高效液相色谱法测定TF中氨基酸种类及其含量;通过鸡红细胞吞噬试验和MTT法,检测TF对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能和外周血淋巴细胞增殖活性的调节作用。进而将9头4周龄健康仔猪随机分为A、B和C组,每组3头。A组每头猪左、右侧耳后分别肌内注射1头份PRRSV疫苗和1mL TF;B组每头猪注射1头份PRRSV疫苗与1mL TF的混合液;C组每头猪注射1头份PRRSV疫苗与1mL生理盐水混合液。免疫后20d,通过MTT法检测每组猪外周血淋巴细胞(PBLC)的增殖活性。制备的TF内无蛋白质成分,含有核酸和18种氨基酸,每毫升TF含核酸21.5μg、总氨基酸3.479mg。TF能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬能力和PBLC增殖活性。当TF与PRRSV疫苗分开或混合注射给4周龄仔猪后,能够显著提高仔猪PBLC的增殖能力。从PRRS弱毒活疫苗免疫猪的脾制备了TF,其能显著提高巨噬细胞的吞噬功能和外周血淋巴细胞的增殖活性。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪 脾 转移因子 免疫活性

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猪瘟高免卵黄抗体ELISA检测方法的建立 被引量：1

11

作者 肖静静 李硕绵 +3 位作者 李妹玲 陈立功 王迎春 董世山 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期90-93,112,共5页

本试验采用猪瘟活疫苗病毒包被酶标板，提取的卵黄抗体作为一抗，建立针对猪瘟病毒卵黄抗体的间接ELISA检测方法。用方阵滴定法确定各反应液的工作浓度及作用时间，并对检测方法的特异性、敏感性及重复性进行了评估。结果显示，抗原最... 本试验采用猪瘟活疫苗病毒包被酶标板，提取的卵黄抗体作为一抗，建立针对猪瘟病毒卵黄抗体的间接ELISA检测方法。用方阵滴定法确定各反应液的工作浓度及作用时间，并对检测方法的特异性、敏感性及重复性进行了评估。结果显示，抗原最佳包被浓度为1：1000，酶标二抗工作浓度为1：6000，临界值为0．131～0．145。建立的ELISA方法较IHA敏感性高，用IHA检测效价为2^7的抗体，稀释2^14倍后，用ELISA方法检测仍为阳性，且其特异性及重复性较好。 展开更多

关键词 猪瘟 卵黄抗体 间接ELISA

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人CD14信号肽介导卵清蛋白在HEK293T细胞的高效表达

12

作者 能昌爱 李秀锦 +5 位作者 仲飞 李振 张峰 陈慧慧 张考 韩冬梅 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期2165-2171,共7页

本试验将人CD14信号肽序列与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)基因融合,旨在提高OVA在非输卵管上皮细胞中的表达。提取鸡输卵管上皮细胞总RNA,经反转录合成的cDNA,再利用修饰的特异性引物,通过PCR从cDNA中分别扩增出5'端与人CD14信号肽序列... 本试验将人CD14信号肽序列与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)基因融合,旨在提高OVA在非输卵管上皮细胞中的表达。提取鸡输卵管上皮细胞总RNA,经反转录合成的cDNA,再利用修饰的特异性引物,通过PCR从cDNA中分别扩增出5'端与人CD14信号肽序列融合和非融合的OVA基因,并将它们分别插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成表达载体pcDNA-CD14sp-OVA和pcDNA-OVA。经磷酸钙介导,将质粒转染至HEK293T细胞,使其进行表达,用鼠抗OVA单克隆抗体通过免疫印迹(Western blot)法检测OVA表达水平。结果表明:本试验扩增的OVA基因序列与GenBank中的序列(登录号NM_205152)一致,构建的人CD14信号肽序列融合OVA基因的表达载体结构正确。经过在HEK293T细胞的表达,融合人CD14信号肽序列的重组蛋白OVA的表达水平明显得到提高。结果提示,融合人CD14信号肽序列后的重组蛋白OVA在非输卵管上皮细胞中的表达水平明显提高,为OVA基因作为DNA疫苗模式抗原的应用提供了必要的条件。 展开更多

关键词 卵清蛋白 人CD14信号肽 重组蛋白表达 HEK293T细胞

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一株分离自免疫猪场的伪狂犬病病毒的鉴定与变异分析 被引量：12

13

作者 王一鹏 王亚文 +3 位作者 徐瑞涛 林依丹 李潭清 宋勤叶 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期2070-2078,共9页

为了明确河北某伪狂犬病疫苗免疫猪场的哺乳仔猪出现神经症状和死亡的病因,作者对发病仔猪进行研究时从脑组织中分离到1株病毒,通过PCR、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、动物试验以及基因序列分析等试验,证明所分离的病毒为伪狂犬病病毒... 为了明确河北某伪狂犬病疫苗免疫猪场的哺乳仔猪出现神经症状和死亡的病因,作者对发病仔猪进行研究时从脑组织中分离到1株病毒,通过PCR、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、动物试验以及基因序列分析等试验,证明所分离的病毒为伪狂犬病病毒(PRV),命名为HBXT-2018株。皮下接种该病毒后24h,家兔开始啃咬病毒接种部位皮肤,在44~68h内全部死亡。抗PRVBartha-K61株的血清对分离株的中和抗体效价低于1∶8,而抗PRV变异株血清的中和抗体效价为1∶58.9。与Bartha株比较,HBXT-2018株的gB和gC的核苷酸和氨基酸序列多处发生单个或连续几个碱基(或氨基酸)置换、插入和缺失突变,预测的gB和gC上的潜在抗原表位也发生了改变。基于gB、gC和TK的系统进化分析表明,HBXT-2018株与国内流行毒株尤其与2011年之后的流行毒株处于同一个进化分支,而与Bartha株及其他欧美毒株处于不同的进化分支。上述结果表明,分离的PRVHBXT-2018株为致病毒株,其与当前国内流行的PRV变异株具有相同的遗传特征,与Bartha株为代表的欧美流行株的遗传关系远。Bartha-K61株抗血清对分离株的中和作用不明显,提示gB与gC的突变可能与该毒株免疫逃逸、继而导致仔猪发病有关。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 Bartha-K61 HBXT-2018 血清中和作用 变异分析

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检测猪流行性腹泻病毒S1蛋白抗体的间接ELISA方法 被引量：4

14

作者 姚作俊 郝达仁 +4 位作者 白云 颜国华 王海敏 宋勤叶 李潭清 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期1085-1091,共7页

为了建立检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗体的间接ELISA方法,初步分析PED灭活疫苗免疫母猪所产仔猪的血清母源特异抗体动态,笔者应用重组PEDV部分纤突(spike,S)蛋白作为检测抗原,建立了基于PEDV S1蛋白... 为了建立检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗体的间接ELISA方法,初步分析PED灭活疫苗免疫母猪所产仔猪的血清母源特异抗体动态,笔者应用重组PEDV部分纤突(spike,S)蛋白作为检测抗原,建立了基于PEDV S1蛋白的间接ELISA抗体检测方法,并用该方法检测了产前4周用PED灭活疫苗免疫母猪的初乳、分娩当天血清及其仔猪1、7、14、21、28和35日龄(d)时血清中的PEDV抗体。结果显示:建立的间接ELISA方法能够特异地检测PEDV抗体,与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒及猪轮状病毒的抗血清无交叉反应;敏感性高于免疫过氧化物酶单层试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA),与IPMA检测结果的符合率为97.14%;批内和批间重复性试验的变异系数小于10%。免疫母猪初乳、分娩当天血清中的PEDV抗体阳性率为100%,初乳比血清中的平均抗体水平低;1d仔猪血清PEDV抗体阳性率为50%,平均抗体水平低,与初乳中的抗体水平接近,7d以后所有仔猪血清全部转为PEDV抗体阴性。建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法;产前用PEDV灭活疫苗给怀孕母猪免疫1次时,其所产仔猪血清中的母源特异抗体阳性率和抗体水平低,且维持时间短暂。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 重组PEDV S1蛋白 间接ELISA 初生仔猪 母源抗体

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重组单增李斯特菌溶血素O在HEK293T细胞中的分泌表达及活性分析 被引量：2

15

作者 常玉梅 李文艳 +4 位作者 张永红 张建楼 温洁霞 王利月 仲飞 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期53-57,共5页

为研究单增李斯特菌分泌的溶血素O(LLO)的免疫佐剂作用,需要构建其真核表达载体,使其在动物体内进行分泌表达,从而发挥其生物佐剂活性。为此,本试验通过PCR方法从LM基因组DNA中扩增了LLO基因,并将其插入到带有CD5信号肽的质粒pcDNA3.1AC... 为研究单增李斯特菌分泌的溶血素O(LLO)的免疫佐剂作用,需要构建其真核表达载体,使其在动物体内进行分泌表达,从而发挥其生物佐剂活性。为此,本试验通过PCR方法从LM基因组DNA中扩增了LLO基因,并将其插入到带有CD5信号肽的质粒pcDNA3.1ACD5sp的信号肽下游构建成真核表达载体,然后转染人胚肾细胞HEK293T细胞使其分泌表达,用Ni-NTA琼脂糖凝胶层析法从培养基中分离纯化重组LLO蛋白,通过Western-blot对其进行鉴定,并用溶血试验鉴定其生物活性。结果表明,扩增的LLO基因序列与GenBank中的基因序列完全一致,在HEK293T细胞中表达的重组LLO在CD5信号肽介导下能被分泌到细胞外,并具有较强的溶血活性,这为进一步研究LLO的功能提供了必要的条件。 展开更多

关键词 单增李斯特菌 溶血素O 真核表达 溶血活性

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猪流行性腹泻病毒与产硫化氢大肠杆菌混合感染的实验室诊断 被引量：2

16

作者 刘京 赵雪 +4 位作者 王云霄 徐瑞涛 宋勤叶 李潭清 高玉红 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2018年第11期35-38,42,I0003,共6页

为了明确某猪场初生仔猪腹泻的病因,应用PCR、核酸序列分析、细菌分离鉴定以及动物试验等方法,对该病例进行了实验室诊断。从病仔猪的肠道及其内容物中检测到了猪流行性腹泻病毒(PEDV) N蛋白基因,该基因片段与近年国内流行的PEDV变异株... 为了明确某猪场初生仔猪腹泻的病因,应用PCR、核酸序列分析、细菌分离鉴定以及动物试验等方法,对该病例进行了实验室诊断。从病仔猪的肠道及其内容物中检测到了猪流行性腹泻病毒(PEDV) N蛋白基因,该基因片段与近年国内流行的PEDV变异株的同一性在99%以上。同时从病猪的肝脏和脾脏中分离到了致病性大肠杆菌,该分离株具有一般大肠杆菌的形态特征、培养特性和生化特点,但产生H_2S,其16S rRNA基因序列与已知大肠杆菌的同源性高达99.9%。遗传进化分析表明,分离菌株与产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)处于同一分支。BALB/c小鼠(n=8)经腹腔感染分离菌株5 h开始死亡,至感染后20 h,感染小鼠全部死亡。此外,该大肠杆菌分离株只对多黏菌素B敏感,对常用的第3代头孢菌素类药物中介,而对其他常用的多种氨基糖苷类、喹诺酮类药物以及复方新诺明等多种药物耐药。 展开更多

关键词 初生仔猪 猪流行性腹泻病毒 产H2S大肠杆菌 混合感染

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猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：4

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作者 张庆桥 王一鹏 +4 位作者 魏艳秋 米建华 赵雪 孙立旦 宋勤叶 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2019年第1期31-35,I0002,共6页

为了制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单克隆抗体,本实验以重组PEDV-N蛋白免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术,经过3～5次亚克隆与筛选,获得了4株分泌抗PEDV McAb的杂交瘤细胞,分别命名为4A7、6C1、5E10和6F7。4株杂交瘤细胞分泌的McAb均为I... 为了制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单克隆抗体,本实验以重组PEDV-N蛋白免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术,经过3～5次亚克隆与筛选,获得了4株分泌抗PEDV McAb的杂交瘤细胞,分别命名为4A7、6C1、5E10和6F7。4株杂交瘤细胞分泌的McAb均为IgM,其轻链均为κ链。ELISA、Western Blot和免疫荧光鉴定结果表明,4株单抗均与N蛋白及PEDV具有良好的结合活性。复苏冻存的4株杂交瘤细胞,连续传代培养30代,4株杂交瘤细胞能够持续稳定分泌抗体,细胞上清的ELISA抗体效价均在1∶800以上。4株细胞诱生的小鼠腹水抗体效价为1∶10~5～1∶10~6。将单克隆抗体(4A7)用于免疫组化试验和IPMA时,其能够特异地识别PEDV人工感染猪小肠组织和Vero细胞内的病毒。上述实验结果表明,制备的单克隆抗体可以用于PEDV抗原检测以及体内病毒的组织定位分析,并可为进一步研发PEDV抗原或抗体检测技术奠定基础。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 N蛋白 杂交瘤细胞 单克隆抗体

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产肠毒素性大肠杆菌主要毒力因子及其疫苗的研究进展 被引量：10

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作者 张秀媛 袁万哲 孙继国 《畜牧与兽医》 北大核心 2014年第5期112-116,共5页

产肠毒素性大肠杆菌的毒力因子很多,包括黏附素,肠毒素,溶血素等,其中黏附素与肠毒素在发病学和免疫学方面都扮演着重要角色。本文对产肠毒素性大肠杆菌的主要毒力因子作一综述,并介绍产肠毒素性大肠杆菌各类黏附素疫苗的研究现状。

关键词 产肠毒素性大肠杆菌 毒力因子 黏附素 疫苗

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重组单增李斯特菌溶血素O在大肠杆菌中的分泌表达及活性分析 被引量：2

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作者 李文艳 张永红 +2 位作者 林洪羽 李秀锦 仲飞 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期1278-1283,共6页

单增李斯特菌是食源性致病菌,常引起人和动物的生殖障碍,由此菌分泌的溶血素O(LLO)是重要的致病因子。为研究LLO对细胞的毒性作用及对动物体生殖免疫的调节作用,需要制备大量重组LLO。为此本试验依据LLO基因序列(JN703918)通过PCR方法... 单增李斯特菌是食源性致病菌,常引起人和动物的生殖障碍,由此菌分泌的溶血素O(LLO)是重要的致病因子。为研究LLO对细胞的毒性作用及对动物体生殖免疫的调节作用,需要制备大量重组LLO。为此本试验依据LLO基因序列(JN703918)通过PCR方法从单增李斯特菌菌株基因组中扩增无信号肽的LLO编码基因,然后将其插入到pET-20b(+)质粒中,使其5′端与载体中的pelB信号肽序列融合,3′端与His-标签融合,构建成LLO分泌性原核表达载体pET-20b-LLO/H。将载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,在IPTG的诱导下进行表达,利用Ni-NTA琼脂糖凝胶从细菌周质释放液中提取和纯化重组LLO蛋白,并通过SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。利用溶血试验检测重组蛋白的生物活性。结果表明,本试验扩增的LLO基因序列与GenBank中的LLO基因序列完全一致。采用分泌性表达策略实现了重组LLO在大肠杆菌中的分泌表达,并且表达的重组LLO具有明显的溶血活性。 展开更多

关键词 溶血素O 单增李斯特菌 大肠杆菌 分泌表达 生物活性

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