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利用CRISPR/Cas9系统制备斑马鱼cbsb敲除模型 被引量：1
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作者 陈福海 蒋林 +4 位作者 曹建斌 蒋伟青 项略 顾珊烨 刘犇 《浙江医学》 CAS 2024年第4期377-383,共7页
目的 采用成簇的规律性间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统对斑马鱼胱硫醚-β-合成酶b基因(cbsb)进行编辑,并制备稳定的斑马鱼cbsb敲除品系。方法 使用ClustalX软件分析斑马鱼cbsb编码蛋白(Cbsb)的保守结构域,利用生物信息学选取向... 目的 采用成簇的规律性间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统对斑马鱼胱硫醚-β-合成酶b基因(cbsb)进行编辑,并制备稳定的斑马鱼cbsb敲除品系。方法 使用ClustalX软件分析斑马鱼cbsb编码蛋白(Cbsb)的保守结构域,利用生物信息学选取向导RNA(gRNA)靶点,体外合成并纯化gRNA和密码子优化的Cas9 mRNA,在刚受精的斑马鱼胚胎(1-cell期)中显微注射混合的gRNA和Cas9 mRNA,提取受精后3 d的斑马鱼幼鱼基因组,通过PCR扩增并测序分析靶点的切割效率,通过基因组扩增和测序筛选并获得cbsb敲除的稳定品系。结果 斑马鱼Cbsb与人、小鼠胱硫醚-β-合成酶(CBS)高度同源。在斑马鱼Cbsb保守结构域的编码序列处设计4个靶点,其中4#靶点具有高效的切割效率,利用该靶点制备并筛选获得多个cbsb敲除斑马鱼,选取-3+13 bps和-228 bps移码突变的两种品系,进一步筛选获得稳定的cbsb敲除品系。结论 利用CRISPR/Cas9系统成功制备了两种斑马鱼cbsb敲除的稳定品系,为进一步在斑马鱼活体中研究Cbsb的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 胱硫醚-β-合成酶b 硫化氢 基因敲除 斑马鱼 成簇的规律性间隔的短回文重复序列/Cas9
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氯硝柳胺下调CLOCK引起胃癌细胞节律紊乱诱发支链氨基酸代谢失调的机制研究
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作者 陈通钻 戴瑞霞 +9 位作者 金高巍 梁琪 朱晓晖 戴纪辰 洪培彬 张加骐 陈通克 方合志 陈祥建 谢彬涛 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 2022年第5期817-825,共9页
生物节律是周期性的生命活动现象。肿瘤细胞内普遍存在代谢重编程,有研究表明生物节律与代谢调控密切相关。氯硝柳胺(Niclosamide)是一种传统抗蠕虫药,具有氧化磷酸化解偶联的特性,近年来已步入抗癌药物研究领域。为探究氯硝柳胺抑制胃... 生物节律是周期性的生命活动现象。肿瘤细胞内普遍存在代谢重编程,有研究表明生物节律与代谢调控密切相关。氯硝柳胺(Niclosamide)是一种传统抗蠕虫药,具有氧化磷酸化解偶联的特性,近年来已步入抗癌药物研究领域。为探究氯硝柳胺抑制胃癌发生发展的具体机制,该研究通过CCK-8增殖、ROS和凋亡等实验发现氯硝柳胺可抑制增殖促进凋亡。通过生物信息学筛选出胃癌与癌旁生物节律差异基因Clock、Per、Dbp等,Western blot实验检测发现它们所编码的蛋白在药物作用后表达均有明显变化,其中CLOCK变化最为显著,提示药物作用后胞内生物节律紊乱。通过海马能量代谢和代谢组学分析进一步探讨药物作用后细胞代谢特性及其与生物节律的相关性,结果提示细胞内氧化磷酸化整体趋势呈药物浓度依赖性下降,同时证实了三羧酸循环中间产物延胡索酸在氯硝柳胺抑癌机制中的重要度。通过Western blot实验发现药物作用后支链氨基酸相关蛋白下调,CLOCK敲低与加药联合作用可进一步抑制支链氨基酸转氨酶1(BCAT1)的表达。综上,该研究认为氯硝柳胺可通过紊乱胃癌细胞节律,诱导支链氨基酸代谢失调从而发挥抑癌效应,有望成为抗癌药物的新星。 展开更多
关键词 氯硝柳胺 生物节律 代谢重编程 支链氨基酸代谢 CLOCK
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