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人类白细胞抗原DR4（＊0405）表达细胞系的建立
1
作者 赵义 向志光 +2 位作者 陈振军 张连峰 栗占国 《中华临床免疫和变态反应杂志》 2007年第1期8-13,130,共7页
目的构建人类白细胞抗原（HIA）DR4（＊0005）真核表达载体，并使其在小鼠成纤维细胞系中得到稳定表达。方法从含且HLA-DRA全长eDNA的质粒中扩增HLA．DRA的开放读码框（ORF）序列，通过酶切将载体pIRES2-EGFP中的增强绿色荧光蛋白（EGF... 目的构建人类白细胞抗原（HIA）DR4（＊0005）真核表达载体，并使其在小鼠成纤维细胞系中得到稳定表达。方法从含且HLA-DRA全长eDNA的质粒中扩增HLA．DRA的开放读码框（ORF）序列，通过酶切将载体pIRES2-EGFP中的增强绿色荧光蛋白（EGFP）切除，将HLA-DRAORF插入到载体中；采用RT-PCR方法从HLA．DR4（＊04051阳性人外周血单个核细胞中克隆出HLA-DRB1＊0405ORF序列，将其插入pIRESrDRct载体的多克隆位点处，构建出真核表达载体pIRES，DRccβ＊0405。对构建的载体进行限制性内切酶鉴定和测序。采用脂质体转染方法将表达载体转入小鼠成纤维细胞系DAP2．3中，G418抗性筛选，并进行单克隆扩增。通过流式细胞术对细胞克隆进行鉴定，筛选出高表达HLA．DR4（＊0005）的细胞株，并采用激光共聚焦显微镜观察H1A-DR4（＊0405）在小鼠成纤维细胞中的表达情况。结果酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且序列与Genbank一致。流式细胞术筛选得到了高表达HLA-DR4（＊0005）的稳定转染细胞株，阳性率达到74．65％。激光共聚焦显微镜观察证实HLA-DR4（＊0405）分子在小鼠成纤维细胞系得到了表达，主要分布于胞膜及胞质内。结论成功构建出真核表达载体pIRES2-DRαβ1＊0405，并在小鼠成纤维细胞系中获得稳定表达，为进一步开展HM-DRB1＊0405的功能研究和转基因鼠模型的建立奠定了基础。 展开更多
关键词 人类白细胞抗原 真核表达 类风湿关节炎
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HLA－DRα和HLA-DRB1^＊0405表达载体的构建及其在真核细胞中的表达 被引量：2
2
作者 赵义 向志光 +2 位作者 陈振军 张连峰 栗占国 《中国比较医学杂志》 CAS 2007年第6期311-316,F0003,共7页
目的构建HLA-DRα和HLA-DRB1*0405真核表达载体,并使其在哺乳动物细胞内得到表达。方法从含HLA-DRα全长cDNA的质粒中扩增HLA-DRα的ORF序列,通过酶切将载体pIRES2-EGFP中的EGFP切除,将HLA-DRαORF插入到载体中;采用RT-PCR方法从HLA-DRB... 目的构建HLA-DRα和HLA-DRB1*0405真核表达载体,并使其在哺乳动物细胞内得到表达。方法从含HLA-DRα全长cDNA的质粒中扩增HLA-DRα的ORF序列,通过酶切将载体pIRES2-EGFP中的EGFP切除,将HLA-DRαORF插入到载体中;采用RT-PCR方法从HLA-DRB1*0405阳性人外周血单个核细胞中克隆出HLA-DRB1*0405 ORF序列,将其插入pIRES2-DRα载体的多克隆位点处,构建出真核表达载体pIRES2-DRαβ1*0405。对构建的载体进行限制性内切酶鉴定和测序。采用脂质体转染方法将表达载体转入小鼠成纤维细胞系DAP2.3中,通过流式细胞术和间接免疫荧光法对HLA-DRα和HLA-DRB1*0405的表达进行检测。结果酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且序列与GenBank一致。流式细胞术检测约41.41%的转pIRES2-HLA-DRαβ1*0405载体的细胞呈阳性,间接免疫荧光显示HLA-DRα和HLA-DRB1*0405在转基因细胞中得到表达并形成完整的HLA-DR4分子,表达于胞膜及胞质内。结论成功构建出真核表达载体pIRES2-DRαβ1*0405,并在小鼠成纤维细胞系中得到表达,为下一步进行稳定细胞系的建立和转基因鼠模型的构建奠定了基础。 展开更多
关键词 HLA—DR 真核表达 关节炎 类风湿
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