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题名基于FRET构建A型肉毒毒素活性检测的高通量方法
被引量：1
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作者
罗森
郭丽娜
李涛
王琴
王慧
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机构
遵义医药高等专科学校细胞生物学与免疫学教研室
军事医学科学院微生物流行病研究所、病原微生物生物安全国家重点实验室
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出处
《安徽医科大学学报》
CAS
北大核心
2023年第1期15-21,共7页
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基金
国家自然科学基金(编号:31201352)
遵义市科技计划项目[编号:遵市科合HZ字(2019)195号]。
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文摘
目的利用荧光共振能量转移(FRET)构建针对A型肉毒毒素酶活性检测的高通量体外方法。方法构建只识别A型肉毒毒素的基于双荧光标记底物的重组表达质粒,将其构建的质粒转入大肠杆菌表达系统进行表达,对表达后的荧光标记底物重组蛋白进行纯化和透析并保存备用;利用A型肉毒毒素轻链(ALc)对重组蛋白进行酶切检测活性;对本检测方法的条件进行优化;ALc切割荧光标记底物测定其酶动力学参数K_(m)与K_(cat)值。结果重组表达质粒构建成功,通过大肠杆菌表达系统表达后检测明显出现目的条带,对其纯化后获得的重组蛋白纯度在90%左右,命名重组蛋白为CYA。对CYA通过酶ALc、B型肉毒毒素轻链(BLc)进行酶切鉴定,结果显示CYA只能被ALc酶切产生与预期相符的两个蛋白片段,不能被BLc酶切。对基于FRET底物的条件优化得到:设定滤光片灵敏度在65~110之间;实时动态检测间隔为2 min/次,动态检测时间为30~120 min,底物CYA合适的浓度范围0.5~32μmol/L。CYA在ALc酶作用下随时时间的变化与荧光值528与485的比值作图最小在0.5左右,最大时约为0.9。酶动力学参数测定ALc切割CYA的值K_(cat)值为(5±0.4)s^(-1)和K_(m)为(2.33±0.21)μmol/L。结论成功构建了基于FRET技术的A型肉毒毒素活性检测的高通量体外分析方法。
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关键词
FRET
肉毒毒素
高通量检测
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Keywords
FRET
botulinum toxin
high throughput screening
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分类号
R378.8
[医药卫生—病原生物学]
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