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LC-MS/MS定量分析小鼠肝组织15种胆汁酸成分研究
1
作者 蔡玉莹 殷继明 +3 位作者 宁琪琪 高玉雪 杨鹏翔 陈德喜 《实用肝脏病杂志》 CAS 2023年第3期320-323,共4页
目的 建立快速高效的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)同时测定小鼠肝组织15种胆汁酸(BAs)浓度。方法 采用活性炭制备无BAs的空白肝组织,作为制备标准样品和质量控制样品的生物基质。匀浆小鼠肝组织,加入碱性乙腈溶液(5%NH4OH)沉淀蛋白。... 目的 建立快速高效的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)同时测定小鼠肝组织15种胆汁酸(BAs)浓度。方法 采用活性炭制备无BAs的空白肝组织,作为制备标准样品和质量控制样品的生物基质。匀浆小鼠肝组织,加入碱性乙腈溶液(5%NH4OH)沉淀蛋白。以^(2)H_(4)-DCA,GUDCA-d_(5)和LCA-d4为内标物,用Agilent Poroshell 120 EC C18色谱柱(100 mm×4.6 mm, 2.7μm)分离,以醋酸铵水溶液和甲醇-乙腈溶液为流动相梯度洗脱,柱温30℃,流速0.3 mL/min,进样量为2μL,采用电喷雾离子源(ESI)负离子模式,多反应监测(MRM)。结果 15种BAs线性关系良好,R^(2)均大于0.993,定量检测限均小于2 ng/mL,基质效应为90.76%~109.25%;日内、日间准确度和精密度均小于15%, 4℃24h、反复冻融、冷冻保存1个月稳定性良好,满足生物样品的分析要求;小鼠肝组织检测结果显示游离型BAs和结合型BAs(G-BAs、T-BAs)都以母体CA为主,TCA含量最高;游离BAs浓度为(723.89±50.65)ng/mL,显著高于G-BAs【(56.90±11.28)ng/mL,P<0.001】,T-BAs浓度为(40322.90±14034.80)ng/mL,显著高于游离BAs(P<0.001)或G-BAs(P<0.001)。结论 建立的LC-MS/MS方法灵敏度高,准确可靠,适用于检测小鼠肝组织BAs浓度。 展开更多
关键词 肝组织 胆汁酸 液相色谱-串联质谱 小鼠
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DDX3X肝特异性敲除在对乙酰氨基酚诱导小鼠急性肝损伤中的作用机制研究
2
作者 莫胤康 范子豪 +1 位作者 徐玲 任锋 《胃肠病学和肝病学杂志》 2025年第4期554-559,共6页
目的探讨DDX3X在对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)诱导小鼠急性肝损伤(APAP-induced acute liver injury,AILI)中的作用及机制。方法动物实验使用C57BL/6J小鼠(包括野生型、DDX3X^(fl/fl)和DDX3X^(Δhep)小鼠),APAP(300 mg/kg)诱导急... 目的探讨DDX3X在对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)诱导小鼠急性肝损伤(APAP-induced acute liver injury,AILI)中的作用及机制。方法动物实验使用C57BL/6J小鼠(包括野生型、DDX3X^(fl/fl)和DDX3X^(Δhep)小鼠),APAP(300 mg/kg)诱导急性肝损伤。检测肝功、病理评价小鼠肝脏损伤;qRT-PCR方法检测基因表达水平;利用Western blotting方法确定蛋白表达含量;ELISA方法鉴定小鼠血清中蛋白表达水平。结果DDX3X的基因和蛋白表达在APAP处理时间梯度中先上升后降低;APAP处理24 h后,DDX3X^(fl/fl)小鼠出现了严重的肝损伤,而DDX3X^(Δhep)小鼠的肝损伤显著减轻,主要表现在小鼠肝功水平显著降低(P<0.05),病理坏死区域和炎症细胞浸润面积减少。两组小鼠中肝组织CYP2E1和GSH的蛋白表达在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。同时,与DDX3X^(fl/fl)小鼠相比,DDX3X^(Δhep)小鼠在APAP处理后炎症指标TNF-α、IL-1β和IL-6在肝组织中基因表达和血清中含量均显著降低(P<0.05)。结论DDX3X肝特异性敲除可能通过降低炎症反应来明显改善小鼠AILI,这为DDX3X在调控肝损伤的功能方面提供了理论支撑。 展开更多
关键词 对乙酰氨基酚 药物性肝损伤 DDX3X 炎症反应
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基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的建立 被引量：1
3
作者 王俊文 田原 +7 位作者 范子豪 徐玲 高耀 曹亚玲 潘桢桢 张向颖 宋岩 任锋 《中华实验和临床感染病杂志（电子版）》 CAS 2022年第5期320-327,共8页
目的建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)检测方法。方法提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA... 目的建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)检测方法。方法提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后,使用HindⅢ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶(PSAD)分别进行酶切;根据松弛环状DNA(rcDNA)和cccDNA的结构差异,设计特异性扩增HBV cccDNA的引物,对酶切后的产物进行滚环扩增(RCA)和PCR扩增;并筛选crRNA,建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果利用α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和HBV表面抗原(HBsAg)引物对双重酶切后的产物进行扩增,验证产物中HBV基因组的存在;利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增,验证了产物中只存在HBV cccDNA;利用RCA后的阳性样本作为模板梯度稀释,然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测,计算出检测下限为10拷贝/μl。结论本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法,可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测,为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。 展开更多
关键词 肝炎病毒 乙型 共价闭合环状DNA 规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白 微滴数字聚合酶链反应 荧光定量聚合酶链反应
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